外泌體在多發(fā)性硬化中的研究進(jìn)展

張夢(mèng)潔,張 磊,秦新月,馮金洲

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 a.神經(jīng)內(nèi)科,b.康復(fù)醫(yī)學(xué)科,重慶 400016)

多發(fā)性硬化(multiple sclerosis,MS)是一種病因未明的中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性自身免疫性脫髓鞘疾病,主要累及腦、脊髓和視神經(jīng)。其主要病理改變包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)白質(zhì)脫髓鞘、炎性浸潤(rùn)和軸突破壞等。外泌體是一種細(xì)胞外分泌的多囊泡體,內(nèi)含細(xì)胞的生物分子,如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、DNA和RNA等多種成分,釋放到細(xì)胞外后,通過(guò)多種方式影響受體細(xì)胞,包括細(xì)胞融合、與受體細(xì)胞表面受體的相互作用,以及被受體細(xì)胞攝取等,發(fā)揮各種生物學(xué)功能如抗原呈遞、免疫調(diào)節(jié)和組織修復(fù)等。近年來(lái)研究證實(shí)外泌體參與MS的多個(gè)生理病理改變過(guò)程。外泌體不僅參與MS的生理病理改變,而且可以用于預(yù)估疾病進(jìn)展、作為MS的診斷手段和治療方法。本文就外泌體對(duì)MS的發(fā)病機(jī)制及其在MS的診斷和治療中的潛在作用進(jìn)行綜述探討。

1 外泌體的生物學(xué)功能

外泌體屬于胞外囊泡的一種,是含有胞漿質(zhì)膜的、直徑在30～120 nm的微小囊泡。它主要是細(xì)胞內(nèi)的溶酶體內(nèi)陷后,形成多囊泡體,當(dāng)受到刺激(如低氧、氧化應(yīng)激等)時(shí),多囊泡體釋放到細(xì)胞外,形成外泌體[1,2]。它在大部分體液中均能檢測(cè)到,如血清、腦脊液、尿液、乳汁、唾液、羊水等[3]。外泌體作為一種細(xì)胞之間的信息傳遞介質(zhì),可以在細(xì)胞與細(xì)胞之間交換胞膜蛋白和胞漿,激活受體及下游通路等,發(fā)揮不同的生物學(xué)功能[4,5]。根據(jù)外泌體的細(xì)胞來(lái)源和靶向功能不同,外泌體中會(huì)含有不同的物質(zhì),包括脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、DNA、miRNA、mRNA、非編碼RNA以及來(lái)自病毒或朊病毒的遺傳物質(zhì)[6],并介導(dǎo)不同生物學(xué)功能,包括免疫反應(yīng)、細(xì)胞分化和細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)等[7]。同時(shí),外泌體表面也含有多種生物標(biāo)志物,一些是共有的,如CD9,CD63,CD81、Alix、熱休克蛋白70、MHCⅠ等[3,8～10];另一部分生物標(biāo)志物則依賴(lài)于其來(lái)源的細(xì)胞類(lèi)型不同而異,如少突膠質(zhì)細(xì)胞釋放的外泌體可攜帶髓鞘蛋白脂蛋白(myelin proteolipid protein ,PLP)、2′3′-環(huán)核苷酸磷酸二酯酶(2′3′-cyclic-nucleotide-phosphodies-terase,CNPase)等[11],它們可能參與膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的軸突營(yíng)養(yǎng)支持;而樹(shù)突狀細(xì)胞(dendritic cells ,DCs)釋放的外泌體攜帶功能性肽-MHC復(fù)合物,可直接激活特異性抗原效應(yīng)T細(xì)胞或傳遞給其他DCs以激活未激活的特異性抗原T細(xì)胞[12]。

2 外泌體在MS發(fā)病機(jī)制中的作用

研究提示外泌體在MS的病理生理和發(fā)病過(guò)程中起著關(guān)鍵作用。在MS患者的血清和腦脊液中外泌體含量明顯升高[9],外周炎性細(xì)胞通過(guò)釋放含有γ-干擾素(IFN-γ)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)等炎性細(xì)胞因子的外泌體,進(jìn)而損傷內(nèi)皮細(xì)胞,破壞血腦屏障,介導(dǎo)MS發(fā)病[13]。內(nèi)皮細(xì)胞功能受損、血腦屏障通透性升高,進(jìn)而使外周激活的淋巴細(xì)胞更易經(jīng)損傷的BBB進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng),繼發(fā)脫髓鞘、軸突破壞等一系列典型病理?yè)p傷。另一方面,這些囊泡中表達(dá)的炎性細(xì)胞因子打破Th17和Treg T細(xì)胞之間的平衡,促進(jìn)疾病進(jìn)展[14]。又有研究指出,外泌體參與MS的發(fā)病主要是因?yàn)橥饷隗w中所含的miRNA。MS患者的血清中提取的外泌體含有一種miRNA是let-7i,其作用于幼稚T細(xì)胞,使幼稚T細(xì)胞向IFN-γ-IL-17A-Foxp3+CD4+T細(xì)胞分化減少[15],進(jìn)一步降低體內(nèi)Treg 細(xì)胞,破壞Th17/Treg平衡,從而導(dǎo)致疾病發(fā)生。在Murugaiyan等的研究中,miR-155被證實(shí)為實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)小鼠炎癥反應(yīng)的主要調(diào)控因素,靶向敲除miR-155基因?qū)е轮袠猩窠?jīng)系統(tǒng)和外周淋巴器官中Th1和Th17細(xì)胞的分化減少,miR-155的敲除以及藥物靶向治療均導(dǎo)致EAE小鼠的發(fā)病過(guò)程延緩和疾病嚴(yán)重程度減輕[16]。此外外泌體中的miR-21和miR-219激活小膠質(zhì)細(xì)胞和巨噬細(xì)胞,釋放促炎因子TNF-α和IL-6等[17,18],促使MS的的發(fā)病和殘疾進(jìn)展,以上均說(shuō)明外泌體通過(guò)不同的miRNA參與MS的發(fā)病過(guò)程。

然而,Thangavelu等提出,MS患者牙周膜干細(xì)胞分泌的外泌體可以通過(guò)調(diào)控TRL-4受體和NF-κB,進(jìn)而調(diào)控NALP3,產(chǎn)生抗炎因子IL-10和TGF-β等,從而抑制EAE小鼠的炎癥反應(yīng)[19]。同時(shí),低劑量IFNγ刺激DC細(xì)胞產(chǎn)生的外泌體中含有miR-219,可以增加髓鞘的生成和氧化應(yīng)激的耐受能力[10],說(shuō)明外泌體在MS的發(fā)病過(guò)程中有致病和抗炎雙重作用,具體可能與細(xì)胞來(lái)源有關(guān),其調(diào)控機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

3 外泌體在MS診斷中的作用

幾乎所有體液中均在健康和疾病條件下檢測(cè)到外泌體,包括尿液、血液、血清、腦脊液、母乳和精液等[20]。其含有的各種標(biāo)記蛋白,奠定了外泌體可作為疾病診斷的生物標(biāo)志物的分子基礎(chǔ)。外泌體內(nèi)包含的蛋白質(zhì)、miRNA及其他核酸物質(zhì)等,可以通過(guò)血腦屏障從血液進(jìn)入大腦,行使細(xì)胞間通訊作用,間接反映腦內(nèi)的狀態(tài),使其成為潛在的神經(jīng)免疫性疾病生物標(biāo)志物。

MS至今尚無(wú)高度特異的生物學(xué)標(biāo)記物。近年的研究表明,MS患者的血清和腦脊液中所含外泌體可以作為一種診斷標(biāo)志物。Welton等指出在MS患者的血清中提取的外泌體中含有50多種蛋白質(zhì),且有30種已被報(bào)道與MS的疾病進(jìn)展有關(guān)[21]。Azimi等研究觀察到,在復(fù)發(fā)緩解型多發(fā)性硬化(relapsing remitting multiple sclerosis,RRMS)患者中,與健康對(duì)照組相比,外泌體中miR-326的表達(dá)顯著上調(diào)。這提示外泌體中這種miRNA的異常表達(dá)可能作為一種診斷和預(yù)后的生物標(biāo)志物[22]。有文獻(xiàn)指出,實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)小鼠腦脊液中小膠質(zhì)細(xì)胞衍生的外泌體的濃度能反映病情的嚴(yán)重程度以及疾病階段[23]。此外,在不同亞型的MS患者的血清中外泌體中均能檢測(cè)到含量更高的MOG蛋白,且其嚴(yán)重程度與Gd增強(qiáng)MRI的表現(xiàn)一致[9]。并且內(nèi)皮細(xì)胞分泌的外泌體聯(lián)合CD31濃度的檢測(cè)對(duì)MS的臨床診斷與釓增強(qiáng)磁共振成像相比具有更高的靈敏度[3]。

研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn),外泌體不僅可早期診斷MS,更可以區(qū)別MS亞型。在不同亞型的MS患者分離的外泌體含有不同的miRNA,采用Logistic回歸和ROC曲線、森林圖等分析后發(fā)現(xiàn)不同亞型的miRNA表達(dá)量差別很大。單個(gè)miRNA區(qū)別亞型的概率僅66%,而聯(lián)合多個(gè)指標(biāo)敏感性可達(dá)95%[6]。揭示了外泌體的檢測(cè)可以作為一個(gè)更簡(jiǎn)便更有效的診斷手段。Ebrahimkhani等通過(guò)采用下一代測(cè)序技術(shù)和綜合生物信息學(xué)方法,揭示了血清外泌體miRNA譜能夠準(zhǔn)確地區(qū)分MS患者與健康對(duì)照組,同時(shí)還能區(qū)分RRMS與進(jìn)展型多發(fā)性硬化(progressive multiple sclerosis, PMS)[24],為外泌體成為MS潛在的生物標(biāo)志物提供了重要線索和依據(jù)。

4 外泌體在MS治療中的作用

由于血腦屏障的存在,絕大部分藥物不能直接通過(guò)血腦屏障進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮作用。目前研制出的納米顆粒藥物技術(shù)也尚未成熟,納米的毒性和快速被清除等問(wèn)題也有待解決。外泌體是內(nèi)吞的多泡體分泌而來(lái),具有與人類(lèi)細(xì)胞相同的胞膜和胞漿[2],可以有效通過(guò)血腦屏障,同時(shí)降低藥物的清除率,可以作為有效的藥物載體之一。

髓鞘再生是髓鞘損傷部位的信號(hào)因子募集少突膠質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞(oligodendrocyte precursor cell,OPCs)到該損傷處后生成髓鞘[25],而促進(jìn)髓鞘再生是延緩MS進(jìn)展的治療方向之一。研究指出,樹(shù)突狀細(xì)胞分泌的含有miR-219的外泌體,增加了髓鞘再生和氧化應(yīng)激的耐受性[10],而Pusic等也證實(shí)了含有miR-219的外泌體能增加髓鞘再生[26],參與其免疫調(diào)節(jié)作用,從而抑制MS的進(jìn)展。有研究發(fā)現(xiàn)[27],利用具有高表達(dá)配體 PDGF-A的神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells,NSCs)釋放的外泌體(extracellular vesicles and particles,EVPs),大大增強(qiáng)了對(duì)少突膠質(zhì)細(xì)胞譜系的靶向能力。此外,與單獨(dú)施用 EVPs 或 T3(三碘甲腺原氨酸)相比,全身注射 EVPs + T3 顯著降低了EAE小鼠的臨床評(píng)分,增強(qiáng)了少突膠質(zhì)細(xì)胞的存活,抑制了髓鞘損傷,并促進(jìn)了EAE小鼠的髓鞘再生,從而抑制疾病進(jìn)展,這為MS提供了一種有效的治療策略。

Manna等分析了MS患者在治療前后的血液外泌體相關(guān)miRNA。結(jié)果顯示,在接受干擾素-β(IFN-β)治療的復(fù)發(fā)緩解型MS患者中,有14種外泌體相關(guān)miRNA明顯下調(diào),而有2種外泌體相關(guān)miRNA明顯上調(diào)。這表明外泌體相關(guān)miRNA具有作為多發(fā)性硬化治療反應(yīng)生物標(biāo)志物的潛力[28]。Riazifar采用EAE小鼠模型,對(duì)人間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)分泌的外泌體在治療MS方面的效果進(jìn)行了評(píng)估。結(jié)果表明,經(jīng)IFNγ刺激的MSCs產(chǎn)生的外泌體(IFNγ-Exo)通過(guò)靜脈注射與PBS對(duì)照組相比,能夠顯著降低EAE小鼠的平均臨床評(píng)分,減輕脫髓鞘和神經(jīng)炎癥,并上調(diào)了EAE小鼠脊髓內(nèi)CD4+CD25+FOXP3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Tregs)的數(shù)量[29]。Xue等設(shè)計(jì)制備了一種新型的納米制劑,使用巨噬細(xì)胞衍生的外泌體作為載體負(fù)載天然產(chǎn)物白藜蘆醇(RSV&Exo),研究發(fā)現(xiàn)在小鼠MS模型中,通過(guò)鼻內(nèi)給藥RSV&Exo顯著抑制了中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周的炎癥反應(yīng),并有效改善了MS的臨床進(jìn)展[30]。因此,外泌體劑型能夠作為MS的潛在治療靶點(diǎn),并有巨大開(kāi)發(fā)研究前景。

5 外泌體在MS臨床應(yīng)用中的不足

目前外泌體的提取和保存尚存在一定的困難。首先,外泌體的分離目前還是依靠外泌體的直徑、密度和生物標(biāo)志物。而胞外囊泡含有三種:壞死小體、微粒體和外泌體。而外泌體(直徑在30～150 nm)和微粒體(直徑在20 nm～1 μm)直徑有相交,導(dǎo)致提取的外泌體純度不足[31]。其次,目前外泌體的提純主要采用梯度離心后超速離心法,可能會(huì)導(dǎo)致外泌體分離物中含有微粒體和其他細(xì)胞碎片。且不同來(lái)源細(xì)胞的外泌體,其大小、密度、標(biāo)志蛋白表達(dá)量都可能存在差異[32]。同時(shí)超速離心法本身對(duì)外泌體也有一定的損害[33]。近年來(lái)越來(lái)越多的分離方法涌現(xiàn)出來(lái),如采用不同孔徑和凝膠的濾過(guò)膜,多聚化合物如PEGs,免疫親和法如磁分離法,納米等離子體分析和動(dòng)態(tài)光散射技術(shù)等,但目前在應(yīng)用中均有限制。因此,研發(fā)既能獲得高純度又具有高特異性的外泌體,并確保其產(chǎn)量供應(yīng)的方法,仍然是當(dāng)前外泌體研究的核心方向之一。最后,盡管外泌體的推薦保存條件為-80 ℃,但在處理或運(yùn)輸過(guò)程中,有時(shí)難以保持這種低溫環(huán)境。一項(xiàng)研究提出了一種凍干法,采用海藻糖作為保護(hù)劑,在冷凍過(guò)程中發(fā)揮生物保護(hù)作用,如穩(wěn)定蛋白質(zhì)、細(xì)胞膜和脂質(zhì)體,減少冰的形成,避免蛋白質(zhì)和外泌體的聚集,以及減少在分離和保存過(guò)程中損失細(xì)胞外囊泡等[34]。需要注意的是,由于不同來(lái)源的外泌體具有異質(zhì)性,因此不同種類(lèi)外泌體的最佳保存條件可能會(huì)有所不同,需要進(jìn)一步研究探討。此外,目前關(guān)于外泌體的不良反應(yīng)仍不明確,也限制了其在臨床中的應(yīng)用[35]。

6 總結(jié)與展望

本文介紹了外泌體的生物學(xué)功能以及在MS的發(fā)病機(jī)制、診斷和治療中的作用。外周炎性細(xì)胞通過(guò)外泌體刺激血腦屏障的內(nèi)皮細(xì)胞,增加血腦屏障的通透性,導(dǎo)致腦內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤(rùn),軸突破壞等。而MS患者的血清外泌體中含有特殊的miRNA,可對(duì)MS做出更有效的診斷。同時(shí),外泌體標(biāo)本主要來(lái)源于血清、尿液、唾液等,用于MS的診斷較長(zhǎng)久以來(lái)MS患者依靠腦脊液免疫檢測(cè)和MRI影像檢查進(jìn)行診斷的方法更加簡(jiǎn)單、無(wú)創(chuàng)。而具有脂質(zhì)雙層結(jié)構(gòu)的外泌體,很好地保護(hù)了內(nèi)含物質(zhì)的降解,并且保存時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng),加大了檢測(cè)時(shí)間窗。此外外泌體能夠很好地穿過(guò)血腦屏障,可以作為一種生物載體,參與MS的治療。與此同時(shí),外泌體中還含有許多其他物質(zhì)如DNA、RNA、非編碼RNA等,這些物質(zhì)的作用是否與MS的疾病發(fā)生發(fā)展、診斷、治療相關(guān),尚有待進(jìn)一步探索和證實(shí)。