多免疫基因預(yù)后模型在評估結(jié)直腸癌生存和預(yù)后中的作用：基于TCGA數(shù)據(jù)庫的研究

郝 博，董 銳，邱權(quán)威，王逸童，左蘆根，劉牧林

結(jié)直腸癌是危害人類健康的第三大惡性腫瘤，其高發(fā)病率(每年全球新發(fā)病例1 096 601例，占所有癌癥的6.1%)和高死亡率(每年全球死亡病例551 269例，占所有癌癥的5.8%)，是全球公共衛(wèi)生面臨的重大挑戰(zhàn)[1]。近年來，對結(jié)直腸癌分子機(jī)制研究取得了重大的進(jìn)展，但是由于結(jié)直腸癌的高轉(zhuǎn)移率及高復(fù)發(fā)率，結(jié)直腸癌仍然是癌癥主要的死因；基于此，亟需找到一種可用于結(jié)直腸癌治療預(yù)后的預(yù)測工具[2]。先前的大多數(shù)相關(guān)研究都是基于臨床病理特征(如腫瘤大小、腫瘤數(shù)量、淋巴結(jié)及血管浸潤等)和單分子生物標(biāo)志物[如癌胚抗原(CEA)、糖類抗原(CA199)、CH24和CA242等]構(gòu)建的預(yù)后模型[3-4]；盡管如此，仍沒有找到一種可靠的指標(biāo)可準(zhǔn)確用于結(jié)直腸癌治療預(yù)后的預(yù)測。

隨著對結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展機(jī)制研究的深入，發(fā)現(xiàn)免疫反應(yīng)在結(jié)直腸癌的惡性進(jìn)展中起著重要的作用。免疫反應(yīng)對癌癥的產(chǎn)生具有雙向作用，正常條件下癌組織作為一種異常的器官可被免疫系統(tǒng)消滅清除；但在某些情況下卻可以促進(jìn)癌變[5-6]。結(jié)直腸癌中存在著大量的異質(zhì)性，在克隆選擇的作用下，基因組不穩(wěn)定性使結(jié)直腸癌產(chǎn)生不同的細(xì)胞群體[7]。新的細(xì)胞群體間具有不同的免疫特性，突變的腫瘤細(xì)胞通過躲避免疫系統(tǒng)的攻擊獲得無限增殖的能力，使腫瘤細(xì)胞異質(zhì)化的分子事件可能促進(jìn)癌癥的發(fā)生和發(fā)展[8-9]。

近年來，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌、前列腺癌及肝癌等腫瘤中聯(lián)合多個基因所作的預(yù)后模型可顯著提高預(yù)后預(yù)測的準(zhǔn)確性；免疫相關(guān)基因在結(jié)直腸的惡性進(jìn)展中具有重要作用，然而關(guān)于免疫基因所作的預(yù)后模型在結(jié)直腸癌中尚缺乏相關(guān)的研究[10-12]。本研究利用預(yù)后相關(guān)免疫基因建立預(yù)后模型，首次研究了多種免疫基因聯(lián)合在結(jié)直腸癌預(yù)后預(yù)測中的優(yōu)勢；并分析了結(jié)直腸癌中免疫細(xì)胞及轉(zhuǎn)錄因子及免疫基因的相互作用關(guān)系。本研究摒棄了單基因預(yù)后預(yù)測的敏感性低或靈敏度低的缺陷，有望為結(jié)直腸癌的治療及預(yù)后提供一個可靠的指標(biāo)，并為結(jié)直腸癌的免疫反應(yīng)研究提供了一定的參考。

1 材料與方法

1.1 結(jié)直腸癌中差異基因的篩選 從腫瘤基因組圖譜數(shù)據(jù)庫(The Cancer Genome Atlas，TCGA)下載結(jié)直腸癌基因表達(dá)數(shù)據(jù)集(包含41例正常結(jié)直腸組織樣本及473例結(jié)直腸癌組織樣本)和臨床病理特征數(shù)據(jù)，引用R軟件“Limma”包對表達(dá)數(shù)據(jù)集進(jìn)行差異分析，篩選出在結(jié)直腸癌中差異表達(dá)的基因[13]。

1.2 結(jié)直腸癌中差異免疫基因的篩選 從免疫基因數(shù)據(jù)庫(Immunology Database Analysis Portal，ImmPort)下載結(jié)直腸癌相關(guān)免疫基因(共包含2 498個免疫相關(guān)基因)，應(yīng)用Perl軟件對差異基因與免疫基因取交集處理，篩選出在結(jié)直腸癌中差異表達(dá)的免疫基因[14]。

1.3 結(jié)直腸癌中預(yù)后相關(guān)免疫基因的篩選 對TCGA數(shù)據(jù)庫結(jié)直腸臨床病理數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，刪除數(shù)據(jù)不完整病例；將病人生存時間(共包含395個生存數(shù)據(jù))與差異基因表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行合并；然后引用R軟件“survival”包進(jìn)行生存分析，篩選出結(jié)直腸癌預(yù)后相關(guān)免疫基因。

1.4 結(jié)直腸癌中差異轉(zhuǎn)錄因子的篩選 通過轉(zhuǎn)錄因子(transcription factor，TF)網(wǎng)站(http：//www.cistrome.org/)，下載腫瘤相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(共包含318個腫瘤相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子)。將轉(zhuǎn)錄因子與差異基因取交集后獲得在結(jié)直腸癌中差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子[15]。

1.5 構(gòu)建結(jié)直腸癌免疫基因預(yù)后模型 對結(jié)直腸癌中差異免疫基因進(jìn)行多因素COX分析，篩選出可作為結(jié)直腸癌獨立預(yù)后風(fēng)險因子的差異免疫基因；并計算出各風(fēng)險基因?qū)Σ∪祟A(yù)后的風(fēng)險系數(shù)，根據(jù)風(fēng)險系數(shù)構(gòu)建免疫基因預(yù)后模型。構(gòu)建免疫基因模型風(fēng)險評分=(CoefficientmRNA1×mRNA1的表達(dá))+(CoefficientmRNA2×mRNA2的表達(dá))+......+(CoefficientmRNAn×表達(dá)mRNAn)[16]。

1.6 免疫基因預(yù)后模型風(fēng)險評分對結(jié)直腸癌病人預(yù)后的驗證 根據(jù)預(yù)后模型風(fēng)險評分將病人分為高風(fēng)險組(風(fēng)險評分>中位風(fēng)險評分)和低風(fēng)險組(風(fēng)險評分<中位風(fēng)險評分)；引用R軟件“survival”包對風(fēng)險評分進(jìn)行生存分析。然后，引用R軟件“survivalROC”包對風(fēng)險評分的預(yù)后價值繪制ROC曲線，根據(jù)曲線下面積(AUC)評價預(yù)后模型對病人的預(yù)后價值。AUC=1，預(yù)測效果較好；AUC=[0.85,0.95],預(yù)測效果很好；AUC=[0.7,0.85],預(yù)測效果一般；AUC=[0.5,0.7],效果較低。

1.7 免疫基因預(yù)后模型及病人臨床病理特征獨立預(yù)后分析 將預(yù)后模型風(fēng)險評分及臨床病理特征與病人生存時間進(jìn)行合并；然后對合并數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素及多因素COX分析，評價預(yù)后模型風(fēng)險評分及各臨床病理特征對病人預(yù)后的獨立風(fēng)險。單因素COX分析表示風(fēng)險因子與病人預(yù)后具有相關(guān)性；多因素獨立分析表示風(fēng)險因子可作為病人預(yù)后的獨立風(fēng)險因子。

1.8 免疫基因與轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)性分析 引用R軟件對差異轉(zhuǎn)錄因子與差異免疫基因進(jìn)行相關(guān)性檢驗分析，并根據(jù)相關(guān)性系數(shù)R對結(jié)果進(jìn)行篩選。|R|<0.3無相關(guān)性；0.3<|R|<0.5具有低度相關(guān)性；0.5<|R|<0.8具有中等程度相關(guān)；|R|>0.8具有高度相關(guān)性。

1.9 預(yù)后模型與結(jié)直腸癌免疫細(xì)胞的相關(guān)性分析 通過腫瘤免疫資源網(wǎng)站(https：//cistrome.shinyapps.io/timer/，TIMER)下載TCGA數(shù)據(jù)庫中的各結(jié)直腸癌病例中免疫細(xì)胞的含量；對免疫細(xì)胞數(shù)據(jù)和預(yù)后模型數(shù)據(jù)進(jìn)行曲交集，篩選出同時具有2組數(shù)據(jù)的病例；然后引用R軟件對免疫細(xì)胞含量及預(yù)后模型風(fēng)險評分進(jìn)行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)直腸癌中差異基因的篩選 以|LogFC|>1,P<0.05的條件篩選，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有6 478個基因在結(jié)直腸癌中差異表達(dá)(其中1 716個基因表達(dá)下調(diào)，4 762個基因表達(dá)上調(diào))。引用R軟件“pheatmap”包對差異基因繪制熱圖(見圖1A)及火山圖(見圖1B)。

2.2 結(jié)直腸癌中差異免疫基因的篩選 從ImmPort下載結(jié)直腸癌相關(guān)免疫基因(共包含2 498個免疫相關(guān)基因)，安裝Perl軟件對免疫基因與結(jié)直腸癌中的差異表達(dá)基因進(jìn)行取交集，篩選出在結(jié)直腸癌中差異表達(dá)的免疫基因(共包含467個差異表達(dá)的免疫基因)，引用R軟件“pheatmap”包對差異表達(dá)的免疫基因繪制熱圖(見圖2A)、火山圖(見圖2B)。

2.3 結(jié)直腸癌中預(yù)后相關(guān)免疫基因的篩選 從TCGA數(shù)據(jù)庫下載結(jié)直腸癌的臨床病理數(shù)據(jù)，然后將病人生存時間與結(jié)直腸癌中差異表達(dá)免疫基因進(jìn)行合并。引用R軟件“survival”包，通過單因素COX分析篩選出預(yù)后相關(guān)的免疫基因(包含50個預(yù)后相關(guān)免疫基因，其中11個低風(fēng)險比基因，39個高風(fēng)險比基因)，對結(jié)果繪制森林圖(見圖3)。風(fēng)險比(hazard ratio，HR)[HR=暴露組的風(fēng)險函數(shù)h1(t)/非暴露組的風(fēng)險函數(shù)h2(t),t指在相同的時間點上]。

2.4 結(jié)直腸癌中差異轉(zhuǎn)錄因子的篩選 通過TF網(wǎng)站，下載腫瘤相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(共包含318個腫瘤相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子)。將腫瘤相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子與結(jié)直腸癌差異表達(dá)基因取交集，獲得在結(jié)直腸癌中差異表達(dá)的腫瘤相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(共有68個差異轉(zhuǎn)錄因子，其中23個轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)下調(diào)，45個轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)上調(diào))。并引用R軟件“pheatmap”包繪制熱圖(見圖4A)、火山圖(見圖4B)。

2.5 結(jié)直腸癌免疫基因預(yù)后模型構(gòu)建 引用R軟件“survival”包對結(jié)直腸癌中差異免疫基因作多因素COX分析，篩選出可作為結(jié)直腸癌獨立預(yù)后風(fēng)險因子的差異免疫基因(共包含18個差異免疫基因，其中4個基因與預(yù)后呈負(fù)相關(guān)，14個基因與預(yù)后呈正相關(guān))及個模型基因的風(fēng)險系數(shù)(risk coefficient)(見表1)。構(gòu)建免疫基因模型風(fēng)險評分=(CoefficientmRNA1×mRNA1的表達(dá))+(CoefficientmRNA2×mRNA2的表達(dá))+......+(CoefficientmRNAn×表達(dá)mRNAn)。

表1 結(jié)直腸癌中預(yù)后模型免疫基因的篩選

2.6 免疫基因預(yù)后模型風(fēng)險評分對結(jié)直腸癌病人預(yù)后的驗證 風(fēng)險評分生存分析見圖5A，ROC曲線見圖5B。引用“pheatmap”包分析每例病人的風(fēng)險評分與其生存狀態(tài)的關(guān)系，評價預(yù)后模型對評估病人預(yù)后的價值；并繪制生存狀態(tài)圖(見圖5C)、風(fēng)險曲線(見圖5D)和風(fēng)險熱圖(見圖5E)。結(jié)果顯示，高風(fēng)險組相較于低風(fēng)險組預(yù)后較差(P<0.05)；預(yù)后模型對評估病人預(yù)后性能較好(AUC=0.861)；風(fēng)險評分高的病人總體預(yù)后較差，該模型對病人預(yù)后顯示出較為可靠的價值。

2.7 免疫基因預(yù)后模型及病人臨床病理特征獨立預(yù)后分析 將預(yù)后模型風(fēng)險評分及結(jié)直腸癌病人臨床病理特征進(jìn)行合并，引用R軟件“survival”包對預(yù)后模型及病人臨床病理特征作單因素(見圖6A)及多因素(見圖6B)COX分析，分析預(yù)后模型及臨床病理特征對結(jié)直腸癌病人的獨立預(yù)后作用，并繪制森林圖對結(jié)果進(jìn)行可視化。結(jié)果顯示，免疫基因預(yù)后模型、TNM分期及病人及年齡可做為評估病人預(yù)后的獨立風(fēng)險因子。

2.8 結(jié)直腸癌中轉(zhuǎn)錄因子和免疫基因相關(guān)性分析 為進(jìn)一步研究結(jié)直腸癌中轉(zhuǎn)錄因子和免疫基因的相關(guān)性，引用R軟件對結(jié)直腸癌中的差異轉(zhuǎn)錄因子及差異免疫基因作相關(guān)性檢驗。按相關(guān)系數(shù)|R|>0.4,P<0.001的條件對結(jié)果進(jìn)行篩選，并應(yīng)用cytoscape軟件作轉(zhuǎn)錄因子和免疫基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖(見圖7)進(jìn)行可視化(線條多少表示相關(guān)性強(qiáng)弱，線條越多相關(guān)性越強(qiáng)，線條越少相關(guān)性越差)。結(jié)果顯示，SLIT2、INHBA、SEMA3G、PLCG2等免疫基因與轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)性較強(qiáng)；CCL28、CD1B等免疫基因與轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)性較差。LMC2、IKZF1、IRF4等轉(zhuǎn)錄因子與免疫基因相關(guān)性較強(qiáng)；KLF4、CDK2、EZH2等轉(zhuǎn)錄因子與免疫基因相關(guān)性較差。由此，我們推測轉(zhuǎn)錄因子通過與免疫基因相互作用在結(jié)直腸癌中發(fā)揮作用。

2.9 預(yù)后模型與結(jié)直腸癌免疫細(xì)胞的相關(guān)性分析 通過TIMER下載TCGA數(shù)據(jù)庫中的各結(jié)直腸癌病例中免疫細(xì)胞的含量；并利用R軟件對免疫細(xì)胞的含量與預(yù)后模型風(fēng)險進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果以散點圖進(jìn)行可視化。結(jié)果顯示，風(fēng)險評分與B細(xì)胞(見圖8A)無明顯相關(guān)性，與CD4-T細(xì)胞(見圖8B)、CD8-T細(xì)胞(見圖8C)、樹突狀細(xì)胞(見圖8D)、巨噬細(xì)胞(見圖8E)及中性粒細(xì)胞(見圖8F)呈正相關(guān)，|R|>0.1,P<0.05。結(jié)果表明，免疫基因可影響免疫細(xì)胞的產(chǎn)生，并協(xié)同促進(jìn)結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展。

3 討論

根據(jù)“腫瘤免疫編輯”學(xué)說，腫瘤是免疫逃逸的結(jié)果[17]。腫瘤細(xì)胞是一種不正常的細(xì)胞，表現(xiàn)為基因突變和致癌基因的過表達(dá)。理論上，免疫細(xì)胞可以通過識別這些突變和異常表達(dá)的蛋白清除不正常的細(xì)胞，從而把腫瘤消滅于萌芽狀態(tài)，即“免疫監(jiān)視”作用[18]。但免疫監(jiān)視作用并不能完全地避免惡性腫瘤的發(fā)生，而且腫瘤一旦產(chǎn)生就會隨著病情的發(fā)展，其惡性程度漸進(jìn)增加，并最終發(fā)生廣泛轉(zhuǎn)移。

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展是免疫系統(tǒng)與腫瘤細(xì)胞一系列動態(tài)復(fù)雜的相互作用過程[19]。新生的腫瘤細(xì)胞具有較強(qiáng)的抗原性，在非特異性免疫機(jī)制(如吞噬細(xì)胞、天然殺傷細(xì)胞等)和特異性免疫機(jī)制(如CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞)的作用下，很快被免疫系統(tǒng)識別清除[20-21]。在與免疫系統(tǒng)相互作用的過程中一些腫瘤細(xì)胞發(fā)生變異并逃過了免疫編輯的“清除”作用而存活下來。在免疫系統(tǒng)的壓力下，存活的腫瘤細(xì)胞不斷的發(fā)生突變。隨著突變效應(yīng)的積累，使腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生一系列惡性表型(如不能表達(dá)MHC分子，或不能產(chǎn)生腫瘤肽)而不能被T細(xì)胞識別，從而逃脫免疫殺傷[22]。此外，腫瘤細(xì)胞可使自身的細(xì)胞凋亡信號通路發(fā)生改變，從而逃避免疫細(xì)胞誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞凋亡；同時，腫瘤會產(chǎn)生一個抑制免疫細(xì)胞的微環(huán)境，在這個微環(huán)境中，腫瘤細(xì)胞會釋放一些具有免疫抑制功能的分子，如TGF-β、IL-10等，并能誘導(dǎo)產(chǎn)生表達(dá)CTLA-4的調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞，對其他免疫細(xì)胞產(chǎn)生抑制作用，導(dǎo)致免疫系統(tǒng)產(chǎn)生對腫瘤的免疫耐受[23- 24]。由此，免疫系統(tǒng)的抗腫瘤機(jī)制已全面崩潰，腫瘤細(xì)胞的生長完全失控并發(fā)生廣泛轉(zhuǎn)移。

本研究利用TCGA數(shù)據(jù)庫篩選出了與結(jié)直腸癌預(yù)后相關(guān)的免疫基因，并以此構(gòu)建免疫基因預(yù)后模型。這些基因可通過不同的途徑調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的功能，及誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生發(fā)展的免疫微環(huán)境產(chǎn)生。例如，CD1B可將腫瘤細(xì)胞中的脂質(zhì)以抗原的形式呈遞給自脂反應(yīng)性T細(xì)胞(HJ1T)并將其激活，激活的HJ1T細(xì)胞通過CD8+T細(xì)胞在早期和后期直接裂解腫瘤細(xì)胞，有效地殺死表達(dá)CD1B的腫瘤細(xì)胞而在腫瘤免疫中發(fā)揮保護(hù)作用[25]。成纖維細(xì)胞生長因子2(FGF2)對細(xì)胞生物學(xué)功能具有廣泛的調(diào)節(jié)作用，包括增殖、血管生成、遷移、分化和損傷修復(fù)。FGF2在甲型流感中通過miR-194-FGF2信號軸抑制甲型流感病毒引起的肺損傷[26]。CCL28作為一種具有廣泛抗菌活性的趨化因子，對革蘭陰性菌和革蘭陽性菌以及真菌具有廣泛的抗菌活性，作為表達(dá)CCR10和/或CCR3的細(xì)胞(如漿細(xì)胞)的化學(xué)吸引劑，在黏膜免疫中發(fā)揮雙重作用[27]。CCL28作為連接先天免疫和適應(yīng)性免疫的錨定點的作用，對B和T細(xì)胞表現(xiàn)出很強(qiáng)的歸巢能力，并協(xié)調(diào)淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)和功能[28-29]。ILC3是腸屏障保護(hù)系統(tǒng)的重要組成部分。腸道ILC3-神經(jīng)中樞形成一個非常嚴(yán)格調(diào)節(jié)的組織特異性電路，通過VIP-VIPR2信號通路誘導(dǎo)ILC3依賴的IL-22細(xì)胞因子產(chǎn)生以控制炎癥性腸道疾病[30]。血管活性腸肽(VIP)在免疫中的作用可以概括為先天性和適應(yīng)性免疫的調(diào)節(jié)，包括抗炎作用，調(diào)節(jié)Th1/Th2平衡，誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和產(chǎn)生致耐受性樹突狀細(xì)胞[31-32]。

本研究的免疫基因預(yù)后模型在預(yù)測結(jié)直腸癌預(yù)后中表現(xiàn)出一定的優(yōu)勢，基于預(yù)后模型建立的風(fēng)險評分對病人具有可靠的預(yù)后評價，高風(fēng)險組病人的預(yù)后相對于低風(fēng)險組預(yù)后較差。預(yù)后模型風(fēng)險評分可作為評估病人預(yù)后的獨立風(fēng)險因子，這進(jìn)一步驗證了本研究預(yù)后模型。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄因子在結(jié)直腸癌中也呈現(xiàn)差異表達(dá)，并且與免疫基因之間具有相互調(diào)控關(guān)系；免疫基因預(yù)后模型風(fēng)險評分與CD4-T細(xì)胞、CD8-T細(xì)胞等免疫細(xì)胞具有相關(guān)性。由此，推測轉(zhuǎn)錄因子通過調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的差異表達(dá)影響免疫細(xì)胞的產(chǎn)生，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的產(chǎn)生及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移而調(diào)節(jié)結(jié)直腸癌病人的預(yù)后。

本研究集中研究了結(jié)直腸癌中不斷變化的免疫基因的預(yù)后作用，避免了單個免疫基因的局限。盡管對結(jié)直腸癌免疫基因、轉(zhuǎn)錄因子及免疫細(xì)胞作了詳盡細(xì)致的分析，并且結(jié)果具有潛在的實質(zhì)性臨床意義，但是仍存在幾個問題。首先，結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展是一個多步驟、多程序、多種基因的過程；在構(gòu)建預(yù)后模型時，僅有18個免疫基因用于模型構(gòu)建，一些重要的差異免疫基因被排除在外，最終降低了模型的性能。其次，需要在結(jié)直腸癌中驗證轉(zhuǎn)錄因子、免疫基因的表達(dá)及免疫細(xì)胞的含量，并進(jìn)行細(xì)胞功能試驗及機(jī)制研究以揭示轉(zhuǎn)錄因子、免疫基因及免疫細(xì)胞在調(diào)控結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展中復(fù)雜的機(jī)制。