轉錄組學技術在急性白血病診治中的應用研究進展

強曉 耿貝貝 劉四喜 夏婷

1天津科技大學生物工程學院（天津 300457）；2深圳市兒童醫(yī)院血液腫瘤科（廣東深圳 518038）

急性白血?。╝cute leukemia， AL）是常見的血液系統(tǒng)惡性腫瘤疾病，AL 的發(fā)生和發(fā)展與染色體和基因異常密切相關［1-2］。在基因水平上主要是拷貝數(shù)變化、結構變異、缺失、插入或單核苷酸序列變異（single nucleotide variations， SNV）?；蛩降漠惓е翧L 細胞轉錄程序的改變，通過這些改變的轉錄基因來推斷白血病樣本的細胞來源和分型，進而指導AL 患者的治療方案和預后［3］。同時，也可對這些改變的轉錄基因進行干擾，為AL患者的靶點治療提供新的策略［4］。因此，轉錄組學技術在AL 診治中的研究越來越受到國內外學者的廣泛關注，是目前研究的熱點，但既往相關的綜述較少。根據(jù)轉錄組學研究技術的發(fā)展先后分為微陣列技術和測序技術，目前常用的是后者。在測序技術中RNA 測序（RNA-sequencing，RNA-seq）技術近年發(fā)展迅速，被廣泛應用。利用RNA-seq 技術，不僅能夠檢測出細胞中所有的基因表達水平，還可以識別mRNA 水平的結構改變，包括選擇性剪接和融合基因，而融合基因是導致白血病發(fā)生的關鍵致癌驅動因素［5］，為白血病的治療和診斷提供有價值的依據(jù)。本文基于轉錄組學技術，尤其是RNA-seq 技術在AL 診斷與治療中的研究應用作一綜述，為AL 分子生物學提供新的理論基礎，也為AL 的治療提供新的靶標。

1 RNA-seq 技術在AL 診斷中的應用

在AL 的診斷、治療及預后判斷過程中，基因異常是一項重要指標，而以往常用的檢測方法無法發(fā)現(xiàn)一些較為隱匿的基因融合和在轉錄過程中發(fā)生的序列變異［6］。近年研究發(fā)現(xiàn)RNA-seq技術可以檢測出全部融合基因，且不受染色體斷裂及基因重組等因素的限制，為發(fā)現(xiàn)隱匿融合基因提供了新的方法和手段［7］。多項研究利用RNA-seq技術發(fā)現(xiàn)了多種新的融合基因，如IGKV4-1-IGKC，HBA2-HBB，ETV6-NID1，IKZF1-NUTM1。此外，RNAseq 技術還可檢測AL 基因的局部變化，如：SNV、序列插入和丟失等，以及不同的轉錄異構體、剪接變異體等，為AL的診斷與分型提供了可靠依據(jù)［7-8］。

1.1 急性髓系白血病急性髓系白血?。╝cute myeloid leukemia，AML）的發(fā)病原因是由基因突變或表觀遺傳學變化導致髓系前體細胞無限增殖和成熟停滯，從而產生未成熟的髓系細胞的克隆［9］。AML 在兒童和成人中均有發(fā)生，目前根據(jù)世界衛(wèi)生組織血液惡性腫瘤分類將AML 區(qū)分為六大類，在AML 病例中，僅有50% ～ 55%的遺傳變異可通過風險評估進行精確分類，當前使用的技術平臺中，AML 的診斷和風險評估存在著復雜、昂貴且結果信息不完整的問題［10］。

近年RNA-seq 技術在AL 診斷方面的應用彌補了當前不足。ARINDRARTO 等［11］利用RNA-seq技術建立了一個專業(yè)、全面和靈敏的人類急性髓細胞白血病快捷轉錄組學（human AML expedited transcriptomics， HAMLET）平臺用于AML 診斷。HAMLET 可以同時檢測融合基因、微小變異、串聯(lián)重復、易位和基因表達水平，對AML 進行分類和風險評估。目前該平臺已作為常規(guī)診斷程序在萊頓大學醫(yī)學中心應用，為AML 分類、風險評估和靶向治療提供更為準確全面的診斷信息，大大推動了AML 的風險分類和個性化醫(yī)療。江梅等［12］利用RNA-seq 技術對3 例染色體核型正常的AML 患者進行轉錄組學分析，結果發(fā)現(xiàn)3 種少見型融合基因BCR-FGFR1、CPSF6-RARG和NUP98-RARG。而這些融合序列存在微缺失或者隱匿性較強的特點，不易被其他檢測手段發(fā)現(xiàn)和鑒定。RNA-seq技術的應用提高了這些少見型融合基因的測出率，從而增強了AML 的診斷精準度。

1.2 急性淋巴細胞白血病急性淋巴細胞白血?。╝cute lymphoblastic leukemia，ALL）在兒科各種惡性腫瘤的發(fā)病率中居于首位［13］。ALL 的基因組特征之一是染色體易位，它會導致產生新型特異性融合蛋白，新的融合基因的發(fā)現(xiàn)對于ALL 的診斷、靶點治療和預后具有重要的臨床意義。和T系ALL相比，B 系ALL 患者的復發(fā)率高，預后依然不佳。費城染色體樣（Ph）染色體是ALL 中最常見的染色體異常，在B 細胞發(fā)育基因中參與的缺失頻率高達82%，Ph 染色體異位后產生BCR-ABL1 融合基因，占所有急性前體B 淋巴細胞白血?。╬recursor B cell acute lymphoblastic leukemia， preB-ALL）病例的20% ～ 30%，BCR-ABL 亞型ALL 對L-天冬酰胺酶和柔紅霉素有較強的耐藥性，因而這種類型患者的治療效果不佳，是一種高風險ALL 亞型［14］。RNA-seq 技術可檢測出BCR-ABL1 融合基因，從而大大提高了Ph 樣ALL 的診斷精準度，為高危ALL的治療提供重要的臨床線索［15］。YASUDA 等［16］利用RNA-seq 技術分析了354 例ALL 患者的轉錄組，在193 例15 ～ 39 歲ALL 患者的B 細胞中發(fā)現(xiàn)IGH基因座中頻繁插入含有DUX4 基因的D4Z4 重復序列，導致具有C 末端的DUX4 蛋白過度表達。另發(fā)現(xiàn)DUX4 基因融合僅在15 ～ 39 歲ALL 患者中檢測到，提示該年齡段與其他年齡段ALL 患者表現(xiàn)出不同的臨床特征和DUX4 基因融合密切相關，RNA-seq技術為此年齡段的ALL診斷和預后提供重要的臨床參考。另外染色體t（12；21）易位會導致兩個關鍵造血轉錄因子ETV6 和RUNX1 的嵌合轉錄，形成新的融合基因，致使特異性促進祖B 淋巴細胞擴增，并阻礙B 淋巴細胞的分化，從而導致B系AL 的發(fā)生，利用RNA-seq 技術檢測出異常的ETV6-RUNX1 融合基因，為ETV6-RUNX1 陽性ALL的靶向治療提供新的手段［17］。綜上所述，RNA-seq技術在AL 中的應用，能夠發(fā)現(xiàn)AL 轉錄組中更多的融合基因，提高ALL 診斷準確率，并為臨床治療提供更加可靠的依據(jù)。

2 RNA-seq 技術在AL 風險評估與預后中的應用

AL 目前主要根據(jù)患者的細胞遺傳學、分子生物學和誘導治療后微小殘留病進行風險分層，不同的風險分層對預后有顯著差異［18-19］。利用RNAseq 檢測結果對AL 進行風險分層，根據(jù)潛在的生物標志物和靶點，對高風險患者選擇精準的靶點治療方案，對于提高臨床預后具有積極的意義［20］。

微小RNA（microRNA，miRNA）具有豐富的生物學功能，在AML 的發(fā)病機制和預后中起著關鍵作用。ESPERANZA 等［21］利用RNA-seq 技術分析了110 例AL 患者的轉錄組學，結果發(fā)現(xiàn)24-miRNA標記與白血病干細胞評分和患者的潛在遺傳學顯著相關。并且24-miRNA 標記提供了AL 的表觀遺傳學數(shù)據(jù)，整合到遺傳學、微小殘留病和干細胞相關白血病的評分中，以完善兒童AML患者的風險分層，結合臨床學表現(xiàn)，構建一套簡單、有效的評分系統(tǒng)。另有研究者利用RNA-seq 技術對1 362 份患者樣本進行了miRNA 測序，經分析確定了36 個miRNA 表達水平與患者復發(fā)率高度相關。隨后建立了一個基于這36 種miRNA 的風險分類系統(tǒng)——AMLmiR36，此系統(tǒng)可對不同復發(fā)風險的患者進行預測，更好地指導臨床治療［22］。

除了miRNA 外，非編碼RNA 中的長鏈非編碼RNA（long noncoding RNAs， lncRNA）的異常表達也在白血病的發(fā)生和預后預測中起著重要的作用。LI 等［23］使用lncRNA 微陣列和RNA-seq 技術分析了7 個N6-甲基腺苷相關的lncRNA 風險信號，經競爭性內源RNA 網絡和功能富集分析后，結果發(fā)現(xiàn)這7 個與N6-甲基腺苷相關的lncRNA 可以充分預測AML 的預后，為AML 患者提供新的治療靶點。

3 RNA-seq 技術在AL 治療中的應用

白血病復發(fā)是影響臨床預后和治療效果的主要原因，而導致復發(fā)的生物學因素尚不明確。STUKAITE-RUIBIENE 等［24］通過RNA-seq 技術對復發(fā)的高危B 系ALL 患者進行轉錄組測序，結果發(fā)現(xiàn)新的基因融合-NUP214-ABL1。此基因在B 系ALL 中罕見，會導致JAK 激酶（屬于酪氨酸激酶）信號異常，預后不佳。經體內試驗顯示具有這種NUP214-ABL1 融合基因的B-ALL 患者對酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitor， TKI）—伊馬替尼敏感，結果提示可選用TKI 作為NUP214-ABL1基因融合的B 系ALL 的靶點治療。此外，基于RNA-seq技術，在preB-ALL亞型中發(fā)現(xiàn)含有MEF2D融合，針對這種基因融合選用組蛋白脫乙酰酶抑制劑（如伏立司他和帕比司他）對preB-ALL 患者進行治療，可顯著改善了患者預后，使患者的5 年總生存率從50%以下增加到75%［25］。KERBS 等［26］利用RNA-seq 技術對806 例AML 患者進行融合基因檢測，結果發(fā)現(xiàn)157 個的新型候選融合基因，與ChimerDB 或Mitelman 數(shù)據(jù)庫比對后，有14 例患者中有新型復發(fā)融合基因，其中包括NRIP1-MIR99AHG融合基因和融合基因。因此，RNA-seq 技術在提高融合基因的全面系統(tǒng)檢測方面具有很大潛力，為其臨床應用提供了有利工具?？傊?，利用RNA-seq技術是識別 AL 中新的融合基因，并針對融合基因對AL 進行更精準的診斷和分型，從而指導AL 的靶向藥物治療，能有效改善患者預后。

目前利用RNA-seq 技術檢測AL 樣本中的所有RNA 轉錄組，以研究基因結構和功能，并發(fā)現(xiàn)新型融合基因。但呈現(xiàn)的是所有RNA 的平均數(shù)據(jù)，不能很好地描述細胞之間的基因差異，也不能準確地判斷表達異常的基因是所有細胞還是某種細胞群引起的。而近年來迅速發(fā)展起來的單細胞RNA 測序（single-cell RNA sequencing，scRNA-seq）技術能夠提供組織或器官中每個細胞的RNA 表達譜，揭示每種細胞的轉錄狀態(tài)，從而鑒定出樣本中基因差異的細胞亞群和細胞異質性［27-28］。VAN GALEN 等［27］對16 例AML 患者和5 例健康人骨髓抽吸物中的38 410 個細胞進行scRNA-seq 和基因分型，并通過機器學習對細胞進行分類。結果發(fā)現(xiàn)與健康個體相比，AML 患者中含有6 種與AML密切相關的惡性細胞亞群（造血干細胞樣、祖細胞樣、粒細胞-巨噬細胞祖細胞樣、原單核細胞樣、單核細胞樣以及傳統(tǒng)樹突狀細胞樣惡性細胞亞群）。其中造血干細胞樣和祖細胞樣惡性細胞亞群富含F(xiàn)LT3-ITD基因突變，單核細胞樣惡性細胞亞群富含F(xiàn)LT3-TKD基因突變，促進AL 的發(fā)展。同時發(fā)現(xiàn)富含F(xiàn)LT3-ITD基因突變的造血干細胞樣和祖細胞樣惡性細胞亞群患者預后更差。這項研究結果揭示了不同細胞亞群與AL 的發(fā)生發(fā)展密切相關，針對AML 細胞亞群的精準藥物治療和免疫治療，為提高AML 的預后提供了新的策略。WITKOWSKI 等［28］采用scRNA-seq 繪制了健康人群和處于診斷、緩解和復發(fā)3 個不同階段的B-ALL患者的骨髓免疫微環(huán)境綜合地圖，結果發(fā)現(xiàn)在診斷和復發(fā)的B-ALL 患者中存在非經典單核細胞在髓樣區(qū)內富集和重新出現(xiàn)，并且單核細胞數(shù)量增加的B-ALL 患者生存率較差。在B-ALL 小鼠模型中，通過阻斷CSFR1 受體靶向非經典單核細胞，致使其數(shù)量減少，進而增強B-ALL 對TKI 的化療敏感性，提高生存率。這項研究表明，scRNA-seq 技術可以更好地分析AL 不同發(fā)展階段的RNA 表達譜，并為不同階段的B-ALL 患者治療提供更精準的靶向方案。煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）的消耗是B-ALL 的一種潛在治療方法，LIN 等［29］利用scRNA-seq技術在51例B-ALL患者中尋找NAD代謝相關基因（NMRGs），結果通過機器學習從23 個差異表達NMRGs 中找到3個生物標志物（NADSYN1，SIRT3 和PARP6），從而為B-ALL 復發(fā)治療提供相關靶點?？傊?，scRNA-seq 技術的應用極大地推進了遺傳學領域的發(fā)展，使不同細胞亞群得以精細區(qū)分，從而在單細胞水平進行AL 機制研究，指導AL 的靶向治療。但是，目前單細胞測序技術依然存在成本較高、分選細胞時容易被污染、容易受到損傷等弊端，有待進一步完善。

4 RNA-seq技術與其他技術聯(lián)用在AL中的研究應用

由于AL 可能涉及多種機制的基因異常，因此單一水平的組學數(shù)據(jù)不能全面地解析AL 的發(fā)生發(fā)展機制，而將轉錄組、基因組和蛋白組數(shù)據(jù)聯(lián)合分析能彌補使用單一技術在AL 研究中的不足。染色體易位t（8；21）是AML患者中最常見的細胞遺傳學異常，重排后AML1的DNA結合結構域與轉錄抑制因子ETO 融合，導致AML1-ETO 融合轉錄因子的表達，而AML1-ETO 進一步抑制正常AML1 功能的轉錄活性，阻斷其分化并促進自我更新。數(shù)據(jù)非依賴性的掃描模式（data-independent acquisition，DIA）是一種新的質譜數(shù)據(jù)采集方式。與此技術結合的蛋白組學稱為DIA 蛋白組學。SCHNOEDER等［30］采用DIA 蛋白組學與轉錄組學結合，研究發(fā)現(xiàn)AML1-ETO 型白血病的PLCG1 蛋白表達顯著變化。AML 中PLCG1 的基因失活可抑制AML1-ETO 依賴的自我更新、白血病增殖和體內白血病維持。結果表明PLCG1通路可作為AML1-ETO 陽性AL 的重要治療生物標志物，為AL臨床治療提供了新的思路。

RNA-seq 技術與其他技術［如全基因組測序（whole-genome sequencing，WGS）、全外顯子組測序（whole-exome sequencing，WES）、全免疫組測序等］聯(lián)用通過對遺傳組信息和多組學數(shù)據(jù)綜合分析，能夠為揭示AL 的發(fā)病機制與預后提供更多的實驗證據(jù)［31］。CHEN 等［32］將WES 和RNA-Seq 聯(lián)合應用，對61 例成人和69 例兒童T 系T-ALL 樣本進行基因組和轉錄組特征的鑒定。結果發(fā)現(xiàn)突變率＞ 3%的基因有48 個，其中有6 個為新發(fā)現(xiàn)的突變基因：PAK4、CELSR3、MINK1、NR4A1、BOD1L1和VCP，并且檢測到NOTCH1，F(xiàn)BXW7，PHF6，JAK3，PTEN和JAK1基因的突變率較高（74.6% ～ 10%）。隨后通過轉錄組學功能分析，發(fā)現(xiàn)這些＞ 3%的突變基因被聚集在七個功能類別中：NOTCH1 通路、信號通路、表觀遺傳因子、轉錄因子、細胞周期調節(jié)因子、翻譯和RNA 穩(wěn)定性相關分子以及其他功能，將突變基因及其在疾病中的功能聯(lián)系起來。LAI等［33］將RNA-seq、WGS、WES以及單核苷酸多態(tài)性陣列技術聯(lián)用，分析了2 例具有親緣關系（父子對）的AML 患者的基因組和轉錄組圖譜。結果發(fā)現(xiàn)2 例患者有超過200 個常見外顯子突變基因，在這些基因中父子雙方都有FLT3 突變，且在AML 中的表達增加。結果提示AML 可能是多個基因聯(lián)合作用的結果。KIMURA 等［34］將RNA-seq 和WGS技術聯(lián)用，分析了3 221例新診斷的和177例復發(fā)的B-ALL 患者的基因組和轉錄組圖譜。結果發(fā)現(xiàn)CDX2 失調，融合基因UBTF-ATXN7L3 能夠迅速誘發(fā)特征明顯的AL。因此，CDX2/UBTF 獨特的基因組和臨床特征可能有助于指導青少年和年輕成人白血病患者在診斷時進行預測，并改善預后。綜上所述，轉錄組學與其他方法學的聯(lián)合使用可以站在基因表達全局對AL 進行研究，擴大研究層面從而指導白血病的診斷分型、預后風險分層和靶向治療。

5 展望

目前RNA-seq 技術較成熟，是研究AL 轉錄組的常用技術。通過RNA-seq技術在RNA層面對AL的基因結構和功能能夠更精準地分析，更好地揭示AL 的生物學特征和疾病發(fā)生發(fā)展的分子機制，為AL的臨床診斷和靶點治療提供了更精準的手段，在AL的診治中發(fā)揮著不可替代的作用。在AL的診斷中，RNA-seq 的一個關鍵優(yōu)勢是能夠更靈敏地識別那些非常隱蔽、采用傳統(tǒng)診斷方法檢測可能被遺漏的融合基因和結構異常基因，從而對AL 進行更精準的亞型分類。在AL的臨床治療中，RNA-seq能根據(jù)識別的特征分子標志物和異?；?，對不同患者人群進行AL的復發(fā)風險評估以及采取精準靶向治療，具有獨特優(yōu)勢。隨著RNA-seq 分析AL 樣本量的增加，目前RNA-seq 技術在AL 診斷和治療中的應用，主要面臨數(shù)據(jù)分析與可視化方面的挑戰(zhàn)。針對以上問題，將來需要提供一個或多個RNA-seq數(shù)據(jù)共享平臺，統(tǒng)一RNA-seq 結果的臨床報告通用規(guī)范，以便更好地利用AL 轉錄組學資源，實現(xiàn)AL的精準分析與臨床應用。另外，RNA-seq對AL的數(shù)據(jù)分析，需要與具有臨床背景的數(shù)據(jù)庫及其他組學數(shù)據(jù)庫結合，能夠全面地分析AL 患者的個體化差異，將來為AL精準醫(yī)療提供更精準的生物學信息。相信隨著轉錄組技術應用的不斷深化，將拓展AL發(fā)生發(fā)展的分子機制，為AL 患者精準個體化治療提供新的策略，以提高AL患者的療效及預后。

【Author contributions】QIANG Xiao wrote the article. GENG Beibei performed the investigation. LIU Sixi performed the conceptualization. XIA Ting revised the article. All authors read and approved the final manuscript as submitted.