海洋環(huán)境微生物的分離和抑菌活性菌株的篩選

程茜彤，靳 婷，馬楚雯，陳永軒*

(1.廈門醫(yī)學院藥學系，福建 廈門 361023；2.廈門昶科生物工程有限公司，福建 廈門 361022)

近年來，抗生素濫用的情況十分普遍，細菌的耐藥速率逐漸提高，人類曾經戰(zhàn)勝的病原菌又卷土重來。周華書從史氏鱘病灶樣品中分離出一株多重耐藥革蘭氏陽性菌JY08，耐藥基因和毒力因子分析結果顯示，菌株JY08攜帶了10大類103個抗生素耐藥基因[1]，可見細菌耐藥性形勢嚴峻。因此，尋找新型抗菌藥物的任務迫在眉睫。隨著陸源微生物資源的不斷消耗，人們將注意力轉向了海洋。海洋微生物與陸源微生物生活環(huán)境迥異，二者各有特性，而這種特殊的生活環(huán)境使海洋微生物蘊含著巨大的潛能[2-3]，這大大增加了從海洋微生物資源中發(fā)現(xiàn)拮抗菌的機率。

海洋拮抗菌研究的歷史可追朔至19世紀，已有無數前人進行過海洋拮抗菌篩選的研究。Viju N等曾經報道過一株惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)，發(fā)現(xiàn)其對細菌形成的生物膜均表現(xiàn)出很強的活性，并可以從中分離出潛在防污作用的化合物[4]。Perumal L等發(fā)現(xiàn)從孟加拉灣深海沉積物中分離到的海洋細菌具有廣譜的抗菌活性和細胞毒性，并鑒定出拮抗海洋細菌為芽孢桿菌(Bacillus)、鹽桿菌(Halobacillus)、葡萄球菌(Staphylococcus)和海洋桿菌(Marinobacter)[5]。Zhou S X等報道過Bacillussp.YB1701對魚類病原菌嗜水氣單胞菌和副溶血弧菌具有抗菌作用，并可用于水產養(yǎng)殖有機廢料的降解，是一種潛在的益生菌[6]。徐亞飛發(fā)現(xiàn)地衣芽孢桿菌(Baclicuslincheniformis)在生長代謝過程中能產生多種抗菌物質,這些物質對多種病原菌具有很強的拮抗作用[7]。

目前，已有很多學者研究了海洋共附生真菌的抗菌活性。Liu H等在海洋紅藻細翼藻(Pterocladiellatenuis)內發(fā)現(xiàn)一株真菌(Penicilliumchermesinum) EN-480的代謝產物，對條件致病菌黃體微球菌(Micrococcusluteus)具有一定的抑制活性[8]。Kuvarina A E等從嗜堿真菌(Emericellopsisbasena) VKPM F1428中發(fā)現(xiàn)其產生的emericellipsin A(EmiA)具有很強的抗真菌和細胞毒作用[9]。Thiyagarajan S等從紅樹林和河口的沉積物中發(fā)現(xiàn)一株曲霉菌EF4對甲基球菌屬(Methyloccussp.)、黃桿菌屬(Havobacteriumsp.)、海洋球菌屬(Marinococcussp.)、沙雷氏菌屬(Serratiasp.)、假單胞菌屬(Pseudomonassp.)均具有一定的抑制作用[10]。本研究以漁業(yè)養(yǎng)殖常見的革蘭陰性致病菌作為指示病原菌，采用濾紙片擴散法研究海洋微生物的抑菌譜，旨在篩選出具有抗菌活性的海洋微生物，并探討其作為益生菌，用于制作微生態(tài)制劑并應用于漁業(yè)養(yǎng)殖的可能性。

1 材料與方法

1.1 菌種

1.1.1 海洋分離微生物

由廈門醫(yī)學院海洋藥學研究中心提供的采集自福建東山兄弟嶼的海綿、漳江口紅樹林的植株、土壤、螃蟹中分離提純的74株海洋微生物(真菌71株、放線菌2株、細菌1株)。

1.1.2 測試病原菌

鰻鱺愛德華氏菌(Edwardsiellaanguillarum)A-01、A-02、A-03；遲緩愛德華氏菌(Edwardsiellatarda)A-11、A-12、A-13；嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)E-01、E-02、E-03、E-04；維氏氣單胞菌(Aeromonasveronii)E-11、E-12；副溶血弧菌(Vibrioparahemolyticus)B-01、B-02、B-03、B-04、B-05、B-06、B-07、B-08；溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)B-11；哈維氏弧菌(Vibrioharveyi)B-21；大腸桿菌(Escherichiacoli)C-01、C-02、C-03；雞白痢沙門氏菌(Salmonellapullorum)D-01、D-02。均由集美大學水產學院提供，共9種27株。

1.2 主要試劑和培養(yǎng)基

諾氟沙星藥物敏感紙片購自杭州微生物試劑有限公司。MH肉湯培養(yǎng)基(Mueller-hinton broth medium)購自青島海博生物技術有限公司。胰酪胨大豆肉湯培養(yǎng)基(Trypticase soy broth medium，TSB)購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。LB肉湯培養(yǎng)基(LB broth medium)購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 指示病原菌的保存

將各類指示病原菌分別接種于含0.5 mL 20%甘油水溶液和1 mL對應培養(yǎng)液的凍存管中(每種菌株保存9管)，按照4℃、-20℃、-80℃的順序梯度保存。

1.3.2 樣品菌菌體萃取物的制備

樣品菌菌體萃取物的制備采用有機溶劑萃取法[11-12]，將74株平板培養(yǎng)的樣品菌用藥勺切成小塊，轉移入250 mL錐形瓶中，加入80%乙酸乙酯、15%甲醇、5%乙酸混合溶劑浸泡2～3 d，待樣品菌代謝產物完全溶出，進行抽濾，取濾液。用旋轉蒸發(fā)儀或氮吹儀蒸干濾液中的溶劑，再用甲醇溶解，將其移入已編號且稱量過空重的2 mL離心管中，然后用真空離心濃縮儀將甲醇蒸干，再稱量總重，計算粗產物凈重，最后用甲醇將其配制成10 μg/mL的濃度(以甲醇為陰性對照，未產生抑菌圈)。

1.3.3 指示病原菌搖瓶制備

配制各指示病原菌對應培養(yǎng)液100 mL，分別加入對應指示病原菌凍存液200 μL，搖床培養(yǎng)24 h(32℃、200 r/min)。

1.3.4 抑菌譜的測定

采用Bauer和Kirby建立的圓紙片瓊脂擴散法 (K-B法)對74株海洋菌株進行篩選[13]。將指示病原菌搖瓶培養(yǎng)液按照0.1%(V/V)的接種量，待培養(yǎng)液稍冷后接種于對應培養(yǎng)基中，充分搖勻后倒板。吸取5 μL樣品菌菌體萃取物于6 mm濾紙圓片上，待培養(yǎng)基凝固后，貼于平板相應位置，以甲醇為陰性對照，以諾氟沙星藥敏紙片為陽性對照，在32℃條件下，培養(yǎng)24 h。用直尺測量抑菌圈直徑，每組設3個平行。

在7種指示病原菌中，氣單胞菌采用LB培養(yǎng)基；沙門氏菌和大腸桿菌采用MH肉湯培養(yǎng)基；愛德華氏菌采用TSB培養(yǎng)基；副溶血弧菌、溶藻弧菌和哈維氏弧菌采用含2% NaCl的LB培養(yǎng)基。

抑菌圈敏感程度采用單因素方差分析(One-way ANOVA)和Tukey′s多重比較進行統(tǒng)計分析，采用GraphPad Prism 9軟件分析畫圖。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

1.3.5 最小抑菌濃度(MIC)藥敏實驗

采用微量肉湯稀釋法測定芽孢桿菌N-14對維氏氣單胞菌E-12的最小抑菌濃度[14]。配置20 480 μg/mL芽孢桿菌N-14菌體萃取物水溶液。首管芽孢桿菌N-14菌體萃取物濃度未加維氏氣單胞菌E-12菌液前為20 480 μg/mL，取初始稀釋液0.5 mL放在9支裝有0.5 mL LB肉湯的無菌試管中，依次進行9次倍半稀釋，最后一管棄0.5 mL。同時以0.5 mL LB肉湯為空白對照，這11支管最后分別加入0.5 mL制備好的維氏氣單胞菌E-12菌液(1.5×108cfu/mL)，使各管芽孢桿菌N-14粗制發(fā)酵液的終濃度分別為10 240、2 560、1 280、640、320、160、80、40、20、10、0 μg/mL。置于搖床中30℃、150 r/min震蕩培養(yǎng)24 h，觀察各管菌體的生長情況，若前一管菌未生長而后一管有生長，則前者管中所對應的藥物濃度即為該溶液對該菌的最小抑菌濃度。

1.3.6 菌株種屬鑒定

參考《伯杰細菌鑒定手冊》及《海洋新菌的分類與鑒定方法》對菌株進行初步鑒定[15-16]。采用平板劃線法，將抑菌活性明顯的菌株進行活化并提取基因組DNA，然后以真菌的ITS4、ITS5或細菌的16S rDNA的引物進行PCR擴增，所得產物委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進行測序。測序所得基因序列在NCBI上進行Blast比對，并根據比對結果，選取近緣參考序列，通過Mega 7.0軟件采用ClustalW進行比對，并采用鄰接法(Neighbour-joining)構建系統(tǒng)樹，選用Kimura 2-parameter 替代模型，自舉(Bootstrap)分析次數為1 000。根據Blast和進化樹分析結果確定該未知菌的種或屬的分類地位。

2 結果與分析

2.1 各海洋菌株對各指示病原菌抑菌譜的測定與種屬鑒定

濾紙片擴散法篩選結果顯示，74株海洋菌株中，有28株海洋菌株(編號N-1～N-28)對各指示病原菌具有不同程度的拮抗活性。28株海洋菌株對各指示病原菌的抑菌譜測定結果如表1所示。由表可以看出，N-3、N-4、N-5、N-10、N-12、N-13、N-20、N-21、N-22對鰻鱺愛德華氏菌、遲緩愛德華氏菌、嗜水氣單胞菌、維氏氣單胞菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌、哈維氏弧菌、大腸桿菌、雞白痢沙門氏菌9種指示病原菌均具有明顯的抑菌作用?；?6S rDNA分析的細菌種屬初步鑒定發(fā)現(xiàn)，這9株微生物均為真菌，N-3為曲霉屬菌(Aspergillussp.)；N-4為赭霉屬菌(Ochroconissp.)；N-5為Roussoellasp.；N-10為Hortaeasp.；N-12和N-20均為翅孢殼霉屬菌(Emericellopsissp.)；N-13為Pseudocosmosporasp.；N-21和N-22均為囊擔菌屬菌(Cystobasidiumsp.)。

此外，N-11和N-17僅對大腸桿菌或雞白痢沙門氏菌有抑菌活性，其種屬鑒定為一種放線菌(Streptomycessp.)。而N-14除了對大腸桿菌和雞白痢沙門氏菌外，對嗜水氣單胞菌和維氏氣單胞菌也有明顯的抑菌活性。菌株N-14根據16S rDNA的基因序列進行Blast比對并繪制進化樹(圖1)，結果表明其與暹羅芽孢桿菌(Bacillussiamensis) (ON248947)和枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis) (HQ317166)的相似性最大(均大于99.8%)，可以確定該菌株為芽孢桿菌屬(Bacillus)，但確定到種的分類地位還需要進一步的生理生化和其他管家基因的鑒定。

表1 海洋菌株對各指示病原菌抑菌譜測定結果

2.2 指示病原菌屬對 9種海洋真菌的敏感程度

用抑菌圈的平均直徑來表示各指示病原菌屬對9種海洋真菌菌屬的敏感程度，經One-way ANOVA和Tukey′s多重比較統(tǒng)計分析(圖2)， 弧菌對曲霉屬(Aspergillu)、Hortaea、Pseudocosmospora的敏感程度相對較高，且與赭霉屬(Ochroconis)、Roussoella、囊擔菌屬(Cystobasidium)有顯著差異。另外，可以看出大腸桿菌對赭霉屬的敏感程度最低。

注：One-way ANOVA分析和Tukey’s多重比較分析, *P<0.05;** P<0.01;***P<0.001;****P<0.000 1。

2.3 芽孢桿菌N-14對維氏氣單胞菌E-12 的最小抑菌濃度

采用芽孢桿菌N-14菌體萃取物對維氏氣單胞菌E-12進行最小抑菌濃度藥敏試驗，結果表明其最小抑菌濃度為10 240 μg/mL(圖3)。芽孢細菌的抑菌活性菌株比例較一般細菌高，且芽孢桿菌可以形成休眠的芽孢形態(tài)，具有極強的抗逆性，在生產和應用方面?zhèn)涫芮嗖A。氣單胞菌在水環(huán)境中普遍存在，具有廣泛的致病性，能感染魚類、禽類和哺乳類，導致皮膚潰瘍等局部感染或敗血癥[6]。芽孢桿菌對氣單胞菌的拮抗作用，對于研發(fā)應用在水產養(yǎng)殖的益生菌或微生態(tài)制劑的意義較大。

3 討論

本研究通過濾紙片擴散法，從海洋環(huán)境中篩選出28株對特定病原菌具有拮抗作用的海洋菌株，經過鑒定發(fā)現(xiàn)9株具有明顯抑菌作用的海洋菌株都是真菌，分別屬于曲霉屬、赭霉屬、Roussoella、Hortaea、翅孢殼霉屬、囊擔菌屬和Pseudocosmospora。目前已有許多學者對這7種菌屬的抗菌活性及應用研究發(fā)表過報道。Monggoot S等研究發(fā)現(xiàn)Aspergillussp. MFLUCC16-0845的主要抗菌成分是β-刺參素，可作為一種潛在的生物活性物質和植物防御激活劑來源[17]。曲霉屬真菌代謝產物豐富，在食品發(fā)酵、醫(yī)藥、農業(yè)生產等多個重要領域被廣泛應用[18]。Phukhamsakda C等從豬苓鐵線蓮中分離出菌株Roussoellasp.(MFLUCC 17-2059)，發(fā)現(xiàn)其次生代謝產物對金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)生物膜形成具有抑制作用[19]。Dunia A A F等發(fā)現(xiàn)嗜鹽菌Hortaeasp.可以應用于蒽醌染料綠3的生物轉化和解毒[20]。Eugene A R等從嗜堿菌Emericellopsisalkalina的培養(yǎng)基中分離到一種新型抗菌肽emericellipsin A，表現(xiàn)出很強的抗真菌作用和細胞毒活性，可用于開發(fā)抗真菌和抗腫瘤藥物[21]。Santos R A等發(fā)現(xiàn)從不同水產養(yǎng)殖魚類中分離出的芽孢桿菌能夠通過群體猝滅來抑制魚類病原體群體感應，達到抗細菌感染的作用，并且其中半數分離物能夠有效地拮抗重要的魚類病原體，包括嗜水氣單胞菌、沙門氏菌、哈維氏弧菌、副溶血弧菌、愛德華氏菌和志賀氏菌(Shigella)等[22-23]。海洋菌株復雜多樣，其抗菌活性物質及開發(fā)應用前景還有待進一步研究發(fā)現(xiàn)。

本研究還發(fā)現(xiàn)非真菌的N-14菌株，初步鑒定為芽孢桿菌屬，其粗提物對氣單胞菌、大腸桿菌和沙門氏菌都具有一定的抑菌作用。近年來，益生菌作為抗生素的安全替代品之一，以飼料 添加劑形式被廣泛應用于水產養(yǎng)殖中。芽孢桿菌是一類革蘭氏陽性化能異養(yǎng)菌，好氧或兼性厭氧，在自然界中分布廣泛。芽孢桿菌能夠形成芽孢，具有較強的耐酸、耐鹽、耐高溫及耐擠壓等特性，其生物活性在惡劣環(huán)境中也不會降低。眾多研究表明，芽孢桿菌在水產養(yǎng)殖中能降低水體氨氮亞鹽水平，提高消化酶活性、抗氧化酶活性、免疫相關基因和應激相關基因的表達水平，增強魚體對病原微生物的抵抗力等[24]，已經成為水產養(yǎng)殖過程中常用的微生態(tài)制劑。芽孢桿菌保護魚類免受致病菌侵害的機制包括產生抗菌活性物質、提高宿主免疫力、競爭黏附位點、營養(yǎng)物質和能量等，其中減少病原微生物是較為重要的益處之一[25]。不同魚類對益生芽孢桿菌的最適需求量也不同，目前益生芽孢桿菌添加量與魚體規(guī)格間還沒有具體的規(guī)定，但總體來說，大規(guī)格魚需要添加較多劑量的益生芽孢桿菌，小規(guī)格魚對益生芽孢桿菌的劑量需求較少[26]。本研究的一個局限性在于僅通過N-14菌株的粗提物對氣單胞菌進行了最小抑菌濃度的測試。N-14菌株在水產養(yǎng)殖中可能具有的較大的應用前景有待進一步的研究。

4 結論

本研究以東山兄弟嶼的海綿、漳江口紅樹林的植株、土壤、螃蟹中分離提純得到的74株海洋菌株為樣品菌，以6株氣單胞菌、6株愛德華氏菌、10株弧菌、2株沙門氏菌、3株大腸桿菌作為指示病原菌，利用濾紙片擴散法篩選測定菌株的抑菌譜，發(fā)現(xiàn)9株對大腸桿菌、沙門氏菌、愛德華氏菌、氣單胞菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌均具有明顯抑制作用的海洋真菌，通過鑒定發(fā)現(xiàn)N-3屬于曲霉屬；N-4屬于赭霉屬；N-5屬于Roussoella；N-10屬于Hortaea；N-12和N-20均屬于翅孢殼霉屬；N-13屬于Pseudocosmospora；N-21和N-22均屬于囊擔菌屬。研究初步鑒定N-14菌株為芽孢桿菌屬，對氣單胞菌、沙門氏菌和大腸桿菌均具有一定的拮抗作用，其在水產養(yǎng)殖上的應用還有待進一步研究。本研究為深入探索海洋菌株抗菌活性物質及其應用前景提供了基礎資料。