淡水與海水養(yǎng)殖的暗紋東方鲀(Takifugu obscurus)幼魚的生長、生化指標和消化酶活力的差異

陳微佳，李福學，張思鵬，陳燕婷，戴燕彬，黃洪龍，尤穎哲，陳武各

(1.廈門大學海洋與地球學院，福建 廈門 361102；2.福建省水產技術推廣總站，福建 福州 350002；3.漳州市水產技術推廣站，福建 漳州 363000；4.漳浦縣興海水產養(yǎng)殖有限公司，福建 漳州 363000)

魚類的活動與生理功能受內部(神經、內分泌)和外部(生態(tài))因素調控[1]。許多研究已經證實了環(huán)境鹽度對魚類的生長發(fā)育具有重要的影響[2-4]。魚類可以通過調控非特異性免疫酶、抗氧化酶和鈉-鉀ATP酶(Na+/K+-ATPase)活性來抵御鹽度脅迫損害[5]：抗氧化酶能夠清除魚體內由應激反應產生的過量氧自由基，減輕氧化損傷，增強魚體的免疫功能[6]；Na+/K+-ATPase參與細胞內Na+和K+主動跨膜運輸，是衡量魚類調節(jié)滲透壓以維持體內外平衡的主要指標，其中廣鹽性魚類能夠通過消耗能量來調節(jié)體內離子含量[7-8]。消化酶活性則代表了魚類對營養(yǎng)物質的消化吸收能力，而鹽度能夠影響脂肪酶等消化酶的活性[9]。

暗紋東方鲀(Takifuguobscurus)隸屬于硬骨魚綱(Osteichthyes)、輻鰭亞綱(Actinopterygii)、鲀形目(Tetraodontiformes)、鲀科(Tetraodontidae)，是江海洄游性魚類，具備肉質鮮美、生長快速、經濟效益高等優(yōu)點，作為經濟魚類的開發(fā)利用前景十分廣闊[10]。近年來，有關其種質資源[11]、生理特性[12-13]和加工方式[14-15]的研究均有報道。在短期鹽度脅迫對暗紋東方鲀個體生長發(fā)育和生理生化指標的影響研究中發(fā)現(xiàn)，暗紋東方鲀幼魚的發(fā)育和鰓絲、肝臟組織的Na+/K+-ATPase活性受鹽度變化的影響顯著[16]。對不同鹽度脅迫處理的暗紋東方鲀個體的監(jiān)測(為期50 d)結果表明，高鹽度對暗紋東方鲀生長、特異性免疫和抗氧化酶活性均有顯著影響[17]。

本研究對淡水與海水養(yǎng)殖的暗紋東方鲀個體生長指標進行為期87 d的監(jiān)測，實驗終末時，測定個體血清中溶菌酶(Lysozyme，LZM)、谷草轉氨酶(Glutamic oxaloacetictransaminase，GOT)、谷丙轉氨酶(Glutamic pyruvictransaminase，GPT)活性和丙二醛(Malondialdehyde，MDA)含量，肝臟腸道組織中非特異性免疫酶、抗氧化酶及消化酶活性，肌肉灰分、粗脂肪和粗蛋白含量。實驗結果旨在明確淡、海水養(yǎng)殖對暗紋東方鲀生長、生理指標的影響，為其規(guī)?；】叼B(yǎng)殖提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

2021年7月，從福建省漳州市漳浦縣興海水產養(yǎng)殖有限公司獲得當年自行繁育的暗紋東方鲀幼魚約100尾。實驗投喂飼料為廣東恒興飼料實業(yè)股份有限公司生產的海水魚配合飼料(粗蛋白質≥41.0%、粗纖維≤4.0%、粗脂肪≥6.0%、粗灰分≤15.0%、總磷為0.8%～2.0%、賴氨酸≥2.4%、水分≤11.0%)。實驗養(yǎng)殖用水為曝氣24 h以上的淡水(鹽度為0)及經二級砂濾的海水(鹽度為30)。實驗于廈門大學翔安校區(qū)實驗室開展，實驗所用養(yǎng)殖池為2個相同容積的養(yǎng)殖池(>500 L)，各配備水體自循環(huán)裝置。

1.2 實驗設計與日常維護

將暗紋東方鲀幼魚隨機分為淡水和海水2個養(yǎng)殖組，每組約50尾，分別置于淡、海水池中養(yǎng)殖，少量投喂飼料，馴化30 d(連續(xù)10 d無個體死亡)后開始進行正式實驗，此時淡水組個體為38尾，海水組個體為43尾。實驗期間，養(yǎng)殖池水溫為(25.0±1)℃，淡、海水鹽度分別為0和(30±1)。每日9：00、18：00投喂飼料，并少量多次以確保沒有飼料殘余，每次投喂至實驗個體表觀飽食為止并分別記錄淡、海水組飼料投喂量。為維護水質，每日用虹吸方法進行一次池底清污、每周更換二分之一養(yǎng)殖水體，約每10 d測量全部暗紋東方鲀個體的體長和體質量(受疫情影響，測定時間間隔不一致)。

1.3 取樣和樣品制備

血清生理指標測定：養(yǎng)殖實驗結束前24 h停止投喂飼料，分別轉移2組全部暗紋東方鲀個體至潔凈的塑料桶中，桶中裝有50 L原養(yǎng)殖池中的養(yǎng)殖用水，添加丁香酚(終濃度為60 mg·L-1)麻醉個體。5 min后，撈出暗紋東方鲀個體，用生理鹽水清洗后置于冰盤上進行解剖，以2 mL注射器從個體心臟取血，低溫低速離心(4℃、3 000 r·min-1、10 min)取血清。樣品于4℃中保存,備用。

肌肉生化指標測定：心臟取血后立即取肝組織和腸道樣品，將附著物去除后用生理鹽水沖洗并用濾紙輕輕吸干，用滅菌處理的剪刀和鑷子取樣品并迅速稱重，-80℃保存?zhèn)溆?，用于測定肝臟和腸道的生理指標。用滅菌解剖刀剝離魚皮后剪取背部肌肉樣品，生理鹽水沖洗后用濾紙吸干水分，稱重并保存于-80℃，待測。

酶活性等生理指標測定：按試劑盒說明書中的樣品制備要求，用超聲波細胞粉碎機(XINYI-ⅡD，信儀)制備肝組織和腸道樣品勻漿液，低溫離心機(5425R,Eppendorf)3 000 r·min-1、4℃離心20 min，取上清液，于4℃保存,待測。

1.4 測定指標與測定方法

1.4.1 生長性能指標與飼料利用率

體長日均增長量(Average daily gain in body length，DLG)、體質量日均增長量(Average daily gain in body mass，DWG)、體長相對增長率(Relative growth rate of body length，RL)、體質量相對增長率(Relative growth rate of body mass，RW)、體長特定增長率(Specific growth rate of body length，SGRL)、體質量特定增長率(Specific growth rate of body mass，SGRW)、肥滿度(Condition factor，CF)、飼料利用率(Efficiency of feed utilization，EFU)、存活率(Survival rate，SR)等指標的計算公式為：

DLG(cm·d-1)=(L2-L1)/(t2-t1)

(1)

DWG(g·d-1)=(W2-W1)/(t2-t1)

(2)

RL(%)=(L2-L1)/L1×100

(3)

RW(%)=[ (W2-W1)/W1]×100

(4)

SGRL(%·d-1)=[(lnL2-lnL1/(t2-t1))]× 100

(5)

SGRW(%·d-1)=[ (lnW2-lnW1)/(t2-t1)]×100

(6)

CF(g·cm-3)=W/L3× 100

(7)

EFU(%)=(W2-W1)/c×100

(8)

SR(%)=Nt/N0×100

(9)

式中，c為每實驗魚投喂的飼料總量(g)；L為實驗魚體長(cm)；W為實驗魚體質量(g)；W1、W2和L1、L2分別為t1、t2時的魚的體質量(g)和體長(cm)；Nt為終末魚數(shù)量(尾)；N0為初始魚數(shù)量。

1.4.2 血清生理指標、非特異性免疫酶與消化酶指標

血清生理指標包括GPT、GOT、LZM活性和MDA含量；肝組織生理指標包括超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione peroxidase，GSH-Px)、Na+/K+-ATPase、過氧化氫酶(Hydrogen peroxidase，CAT)的活性及總抗氧化能力(Total antioxidant capacity，T-AOC)；消化酶指標包括糜蛋白酶(Chymotrypsin，SA)和腸脂肪酶(Lipase，LSP)活力。肝組織生理指標、血液生理指標、組織蛋白質含量和消化酶活性測定均采用南京建成生物工程研究所生產的試劑盒，實驗操作和計算方法嚴格按照試劑盒說明書進行，采用分光光度計(普析TU-1810)或單功能酶標儀(SpectraMax ABS Plus，MOLECULAR DEV ICES)測定數(shù)據(jù)。

1.4.3 肌肉生化組分指標

測定暗紋東方鲀幼魚肌肉的粗蛋白質含量(凱氏定氮法， GB 5009.5—2016《食品安全國家標準 食品中蛋白質的測定》)、粗脂肪含量(索氏抽提法， GB 5009.6—2016《食品安全國家標準 食品中脂肪的測定》)和粗灰分含量(高溫灼燒法， GB 5009.4—2016《食品安全國家標準 食品中灰分的測定》)。

1.5 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計

用SPSS 22處理數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)以平均值±標準差(Mean±SD)表示。采用協(xié)方差分析(ANCOVA)，以初始體長、初始體質量為協(xié)變量比較實驗期間暗紋東方鲀幼魚體長、體質量變化組間差異性(P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著)；采用t檢驗(t-test)比較組間生長指標、血液生理指標、肝組織生理指標和消化酶活性(P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著)。

2 結果與分析

淡水與海水養(yǎng)殖的暗紋東方鲀幼魚在實驗期間(87 d)生長狀態(tài)均良好，實驗結束時個體存活率高，其中，淡水組幼魚存活38尾，個體存活率為100%；海水組幼魚存活42尾，死亡1尾(養(yǎng)殖過程中因意外吸入下水口而受傷，并最終死亡)，個體存活率為97.73%。

2.1 淡、海水養(yǎng)殖對暗紋東方鲀幼魚生長與飼料利用率的影響

統(tǒng)計分析結果表明，淡水組與海水組暗紋東方鲀幼魚初始體長無顯著差異(P>0.05)，至實驗結束時，淡水組幼魚的平均體長增長極顯著大于海水組(P<0.01)；初始體質量無顯著差異(P>0.05)，至實驗結束時，淡水組幼魚平均體質量增長極顯著大于海水組(P<0.01)(表1)。淡水組幼魚體長日均增長量、體質量日均增長量、體長相對增長率、體質量相對增長率、體長特定增長率、體質量特定增長率和肥滿度7個生長指標均極顯著高于海水組(P<0.01)；淡水組幼魚的總飼料利用率高于海水組(表1)。綜上，幼魚生長指標的監(jiān)測結果表明，淡水養(yǎng)殖的暗紋東方鲀幼魚生長情況優(yōu)于海水組，個體的生長發(fā)育速度也顯著快于海水組。

表1 淡、海水養(yǎng)殖暗紋東方鲀幼魚的生長性能與飼料利用率

淡水組與海水組暗紋東方鲀幼魚組間體長和體質量的差異隨養(yǎng)殖時間增加而逐漸增大，組內幼魚個體之間生長發(fā)育差異也逐漸增大(圖1)。淡水組與海水組之間個體體長平均數(shù)之差和體質量平均數(shù)之差與養(yǎng)殖時間分別存在極顯著的正相關關系(圖2，體長r1=0.827,P<0.01；體質量r2=0.994，P<0.01)，且養(yǎng)殖時間越長，組間生長差異越大。暗紋東方鲀幼魚的體長和體質量的增長都極顯著受到養(yǎng)殖水鹽度的影響。

2.2 淡、海水養(yǎng)殖對暗紋東方鲀幼魚血清生理指標的影響

淡水組與海水組暗紋東方鲀幼魚血清的GPT和GOT活性無顯著差異(P>0.05)；淡水組暗紋東方鲀幼魚LZM活性顯著高于海水組(P<0.05)；MDA含量在淡水組與海水組之間無顯著性差異(P>0.05)(表2)。

2.3 淡、海水養(yǎng)殖對暗紋東方鲀幼魚肝組織生理指標的影響

淡水組暗紋東方鲀幼魚的Na+/K+-ATPase酶活力顯著低于海水組(P<0.05)，此外，淡水組與海水組幼魚的SOD、GSH-Px、T-AOC、CAT活性在組間均無顯著性差異(P>0.05)(表3)。

表3 養(yǎng)殖水體鹽度對暗紋東方鲀幼魚肝組織生理指標的影響

2.4 淡、海水養(yǎng)殖對暗紋東方鲀幼魚消化酶活力的影響

淡水組與海水組的暗紋東方鲀幼魚個體糜蛋白酶和腸脂肪酶的活性在組間均無顯著性差異(P>0.05)(表4)。

表4 養(yǎng)殖水體鹽度對暗紋東方鲀幼魚消化酶活性的影響

2.5 淡、海水養(yǎng)殖對暗紋東方鲀幼魚肌肉生化組分的影響

淡水組暗紋東方鲀幼魚肌肉的粗蛋白、粗脂肪含量略高于海水組，粗灰分則略低于海水組，但這一差異不具有顯著性(P>0.05)(表5)。

表5 養(yǎng)殖水體鹽度對暗紋東方鲀幼魚個體肌肉一般營養(yǎng)成分的影響

3 討論

3.1 淡、海水養(yǎng)殖對暗紋東方鲀幼魚生長指標的影響

魚類的生長發(fā)育顯著受到水環(huán)境鹽度的影響[18]。對金錢魚(Scatophagusargus)[19]、珍珠龍膽石斑魚(Epinephelusfuscoguttatus♀×E.lanceolatus♂)[20]、四指馬鲅(Eleutheronematetradactylum)[21]、多鱗(Sillagosihama)[22]的研究結果指出，個體生長發(fā)育速度隨鹽度升高而降低。邊平江等的研究結果表明，在鹽度為24～30的處理組中，暗紋東方鲀個體生長受到較大抑制[17]，這與本研究結果一致：淡水養(yǎng)殖組幼魚多個生長指標極顯著高于海水組(P<0.01)，鹽度對暗紋東方鲀的發(fā)育具有極顯著的影響。肥滿度是評價魚類營養(yǎng)狀況的重要指標，個體肥滿度越高，其體內儲存的營養(yǎng)能量物質越多[23]。本研究中，淡水組幼魚肥滿度極顯著高于海水組(P<0.01)，這表明淡水組幼魚的營養(yǎng)物質積累與儲備顯著優(yōu)于海水組，從養(yǎng)殖經濟效益的角度看，淡水組幼魚的飼料利用率高于海水組也可證明淡水養(yǎng)殖暗紋東方鲀的飼料投喂成本更低。綜合以上表觀生長指標的監(jiān)測結果，淡水養(yǎng)殖的暗紋東方鲀幼魚生長情況更好，個體的生長發(fā)育速度顯著快于在海水養(yǎng)殖。

3.2 淡、海水養(yǎng)殖對暗紋東方鲀幼魚血清生理指標的影響

GOT、GPT等轉氨酶一般存在于肝臟細胞中，在環(huán)境脅迫下，動物發(fā)生肝損傷會大量釋放轉氨酶于血液之中，導致血液中轉氨酶活性升高[24]。MDA是生物體內脂質過氧化的終產物，其含量是指征機體抗氧化能力的重要參數(shù)，能夠反映機體脂質過氧化速率、強度和氧化損傷程度[25]。本研究中，淡、海水養(yǎng)殖的暗紋東方鲀幼魚血清中GOT、GPT活性和MDA含量均無顯著性差異(P>0.05)，說明經過87 d海水養(yǎng)殖的幼魚已適應了高鹽環(huán)境，肝臟等組織器官生理狀態(tài)正常。

LZM是一類能夠水解黏多糖的堿性蛋白酶，可以破壞和消除進入體內的異物，是機體免疫調節(jié)能力的指標[26]。本研究中，淡水組暗紋東方鲀幼魚血清的LZM含量顯著高于海水組(P<0.05)，即海水組幼魚的機體免疫調節(jié)能力差，這與邊平江等的研究結果一致：在鹽度30的水體中養(yǎng)殖天數(shù)超過40 d的暗紋東方鲀LZM含量顯著低于淡水養(yǎng)殖組[17]。

3.3 淡、海水養(yǎng)殖對暗紋東方鲀幼魚肝組織生理指標的影響

動物體內代謝產生活性氧(ROS)，包括超氧陰離子(O2-)、過氧化氫(H2O2)和羥基自由基(·OH)等[27]。ROS在細胞凋亡過程中發(fā)揮著重要作用，多余ROS會導致氧化應激反應，誘導蛋白質、脂質和DNA氧化損傷，造成細胞凋亡[28-29]。SOD、CAT、T-AOC和GSH-Px是抗氧化系統(tǒng)中清除多余活性自由基的重要抗氧化酶。本研究中，暗紋東方鲀幼魚的淡、海水處理組之間CAT、SOD、T-AOC和GSH-Px活力均無顯著性差異，因此，淡、海水養(yǎng)殖對魚體的抗氧化能力無顯著影響，這與血清中表征抗氧化能力的MDA含量測定結果一致。本研究結果與邊平江等的研究結論相似：當鹽度為30、養(yǎng)殖時間大于40 d時，暗紋東方鲀肝臟中抗氧化酶的活力恢復至與淡水組水平相當[17]，這可能是長期適應的結果。

Na+/K+-ATPase是生物體內離子調節(jié)過程中的關鍵酶，其功能是保持細胞內高K+、細胞外高Na+的離子濃度梯度平衡。本研究中，海水組暗紋東方鲀幼魚的Na+/K+-ATPase活性顯著高于淡水組(P<0.05)，即為了維持高滲環(huán)境下魚體的水-鹽平衡，使內環(huán)境穩(wěn)定，魚體Na+/K+-ATPase活性增強。這一結果與先前對刀鱭(Coilianasus)[30]、羅非魚(Oreochromissp.、Sarotherodonmelanotheron、O.niloticus)[31]、卵形鯧鲹(Trachinotusovatus)[32]和黃河鯉(Cyprinuscarpiohaematoperus)[33]的研究結果相似。本研究中，淡水養(yǎng)殖的暗紋東方鲀幼魚生長指標顯著優(yōu)于海水養(yǎng)殖，可以推測：在高鹽環(huán)境中，廣鹽性魚類需要更多的能量用于維持滲透壓平衡，引起分配到生長的能量減少，從而使其生長受到抑制。

3.4 淡、海水養(yǎng)殖對暗紋東方鲀幼魚消化酶活力的影響

魚類消化酶活性是反映個體基本消化生理特征及其對營養(yǎng)成分的利用能力的重要指標[34]。對于廣鹽性魚類而言，消化酶活力受鹽度影響變化較為復雜，不同物種、年齡的個體之間也存在差異[5,30,35-37]。一項為期14 d的研究結果表明，將0齡暗紋東方鲀從淡水轉移至鹽度為30的海水后，個體胃蛋白酶活性隨適應時間的延長而升高，而后回落的趨勢；胰蛋白酶和淀粉酶則隨適應時間的延長有升高的趨勢[38]。本研究中，淡、海水環(huán)境下分別培養(yǎng)的暗紋東方鲀幼魚腸脂肪酶和糜蛋白酶活性均無顯著性差異(P>0.05)。因此，本研究的結果可能是經長時間養(yǎng)殖的幼魚均已適應各自養(yǎng)殖環(huán)境導致的。此外，一項對黃條(Seriolaaureovittata)個體的生理研究表明：以12 h為間隔的鹽度漸變處理下，黃條腸道的腸脂肪酶和蛋白酶活性隨鹽度的增加而逐漸升高，當鹽度為29時達到最高值，顯著高于鹽度為5的處理組[39]，這與本研究的結果不一致，可能是消化酶活性在不同物種之間的差異導致的。結合生長指標在淡、海水之間的顯著差異，可以推測：暗紋東方鲀在不同處理組之間的生長差異是由攝入營養(yǎng)物質后，對能量的分配方式不同導致的，而非獲取能量的能力存在差異。

3.5 淡、海水養(yǎng)殖對暗紋東方鲀幼魚肌肉生化組分的影響

魚類肌肉的營養(yǎng)成分與其所生存的水環(huán)境密切相關，養(yǎng)殖水體鹽度的變化可能改變魚類肌肉中粗蛋白、粗脂肪和灰分的含量[40-41]。本研究中，暗紋東方鲀幼魚肌肉的粗蛋白、粗脂肪和粗灰分含量在淡、海水組間均無顯著性差異(P>0.05)，這與對消化酶的檢測結果一致，即長期適應后，鹽度對個體吸收和消化脂肪與蛋白質的能力沒有顯著的影響，淡、海水組幼魚對能量的攝取能力沒有顯著的差異，由于海水組幼魚需優(yōu)先分配更多能量用于調節(jié)滲透壓，維持生存，因此其生長發(fā)育速度較淡水組更為緩慢。

4 結論

淡水養(yǎng)殖的暗紋東方鲀幼魚生長指標與免疫能力顯著優(yōu)于海水養(yǎng)殖，不同鹽度下Na+/K+-ATPase滲透壓調節(jié)的耗能可能是影響暗紋東方鲀幼魚生長差異的主要因素。為期87 d的培養(yǎng)后，淡、海水養(yǎng)殖對暗紋東方鲀幼魚抗氧化能力、消化能力，以及其肌肉的粗脂肪、粗蛋白和灰分含量均無顯著的影響。因此，相較于海水養(yǎng)殖，淡水養(yǎng)殖更有利于暗紋東方鲀的生長。實驗結果對暗紋東方鲀的淡化養(yǎng)殖具有較好的指導意義。