前列腺癌EpCAM特異性分子探針的構(gòu)建及其在體MR成像研究

仲津漫，丁健科，劉朵朵，陳欣，楊全新

前列腺癌是嚴(yán)重威脅男性健康的泌尿生殖系惡性腫瘤之一，約占前列腺惡性腫瘤的95%[1]。臨床診斷前列腺癌的方法主要有直腸指檢、血清前列腺特異性抗原測(cè)定以及超聲、MRI等影像診斷方法，其中MRI具有極高的軟組織分辨率，可以多方位、多參數(shù)成像，是目前公認(rèn)的診斷前列腺癌理想的檢查手段[2,3]。但對(duì)于早期前列腺癌，MRI診斷缺乏特異性，易與一些前列腺良性病變相混淆。近年來(lái)，基于細(xì)胞分子水平的靶向?qū)Ρ葎┭芯恐饾u成為熱點(diǎn)。

上皮細(xì)胞粘附分子(epithelial cell adhesion molecule,EpCAM)是一種跨膜糖蛋白，在正常上皮細(xì)胞中表達(dá)極低[4]。研究表明EpCAM在前列腺癌及癌旁組織中均呈過(guò)表達(dá)，且表達(dá)水平與前列腺癌的術(shù)前和術(shù)后Gleason評(píng)分呈正相關(guān)，與無(wú)復(fù)發(fā)生存率呈負(fù)相關(guān)。過(guò)表達(dá)EpCAM可顯著增強(qiáng)前列腺癌細(xì)胞增殖、侵襲的能力[5,6]。金磁納米微粒是一種以氧化鐵為核心，表面被覆金作為殼的新型核/殼結(jié)構(gòu)復(fù)合微粒[7]，不僅具有膠體金的光學(xué)性質(zhì)和偶聯(lián)性能，還兼具超順磁性氧化鐵核心的磁響應(yīng)性及其衍生的分離純化能力，在MR分子影像學(xué)中具有極大的應(yīng)用前景。本研究利用GoldMag金磁納米微粒的理化性質(zhì)，將其與本課題組先前制備的EpCAM特異性核酸適配體Ep1[8]偶聯(lián)，構(gòu)建分子探針Ep1-GoldMag，檢測(cè)其對(duì)EpCAM陽(yáng)性的前列腺癌細(xì)胞的靶向親和性，進(jìn)一步探討其在活體內(nèi)MR成像的可行性，為前列腺癌的早期靶向診療研究奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

材料與方法

1.主要儀器和試劑

人前列腺癌細(xì)胞系LNCap、PC-3以及人正常前列腺基質(zhì)細(xì)胞系WPMY-1購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究所細(xì)胞庫(kù)；核酸適配體Ep1在本人研究生期間的課題實(shí)驗(yàn)中已成功制備并保存；DMEM、RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司；進(jìn)口胎牛血清購(gòu)自ZETA LIFE公司；GoldMagTM-CS金磁納米微粒試劑盒購(gòu)自西安金磁納米生物有限公司；其他試劑均為進(jìn)口分裝或國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

其他儀器還包括磁性分離器(西安金磁納米生物技術(shù)有限公司)、FACS Calibur流式細(xì)胞儀(BD美國(guó))、熒光顯微鏡及照相系統(tǒng)(Olympus日本)、激光共聚焦熒光顯微鏡(Nikon日本)、紫外分光光度計(jì)(Bio-Rad公司)、3.0T磁共振掃描儀(Siemens Magnetom Tim Trio 3.0 T MRI)。

2.核酸適配體在金磁納米微粒表面的固定化效率檢測(cè)

將100 μL 1 mg/mL GoldMagTM-CS金磁納米微粒懸液加入500 μL偶聯(lián)緩沖液振蕩混勻，磁性分離5 min。將Ep1分別稀釋成0 μg/μL、20 μg/μL、40 μg/μL、60 μg/μL、80 μg/μL、100 μg/μL、120 μg/μL、140 μg/μL、160 μg/μL等一系列濃度，加入偶聯(lián)緩沖液混勻，留取部分Ep1溶液標(biāo)記為pre。將余下Ep1溶液重懸上述磁性分離后的金磁納米微粒，37℃孵育1 h，磁性分離后留取上清液，標(biāo)記為post。加入1000 μL PBST緩沖液洗滌、重懸偶聯(lián)產(chǎn)物，磁性分離，留取部分上清液，標(biāo)記為wash，以PBST緩沖液作為空白對(duì)照，分別測(cè)量pre、post和wash樣品在260 nm處的吸光度值(optical density,OD)，用如下公式計(jì)算Ep1在金磁納米微粒表面的固定化效率：固定化效率(%)=(ODpre-ODpost-ODwash)/ODpre×100%。

3.分子探針Ep1-GoldMag-tBid構(gòu)建

將100 μL金磁納米微粒懸液加入500 μL偶聯(lián)緩沖液充分振蕩混勻，磁性分離5 min，棄上清。將40 μg核酸適配體Ep1加入500 μL偶聯(lián)緩沖液充分混勻，并以此重懸上述磁性分離后的金磁納米微粒溶液，37℃孵育30 min后磁性分離。洗滌后再加入封閉緩沖液封閉1 h，PBS重復(fù)洗滌后磁性分離，所得沉淀即為目的分子探針Ep1-GoldMag。用同樣方法制備ssDNA-GoldMag作為陰性對(duì)照組。

4.免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Ep1-GoldMag的細(xì)胞特異性

將LNCap、PC-3及WPMY-1細(xì)胞分別接種于20 mm激光共聚焦培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至培養(yǎng)皿底面積約75%時(shí)，吸棄上清液，PBS洗滌，向培養(yǎng)皿中加入40 g/L多聚甲醛固定15 min，50 g/L BSA室溫封閉1 h，用PBS洗滌后加入200 pmol FAM標(biāo)記的分子探針Ep1-GoldMag溶液，置于4℃避光孵育8 h，再加入DAPI室溫避光孵育10 min襯染細(xì)胞核，PBS重復(fù)洗滌后封片，用激光共聚焦熒光顯微鏡觀察各細(xì)胞的熒光顯示比例。

5.前列腺癌荷瘤裸鼠模型構(gòu)建

制備前列腺癌PC-3細(xì)胞懸液，調(diào)整其濃度為5×106/200 μL。4～6周齡Bab/c雄性裸鼠(體重范圍：14.5～21.0 g)12只，隨機(jī)分為兩組，每組各6只，每只裸鼠右側(cè)皮下注射瘤細(xì)胞懸液200 μL，隔天追加注射200 μL/只1次，置于SPF級(jí)環(huán)境飼養(yǎng)，隔日觀察并記錄裸鼠及其腫瘤的生長(zhǎng)情況。在相同條件下實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

6.檢測(cè)EpCAM在前列腺癌荷瘤裸鼠腫瘤及重要臟器組織中的表達(dá)

待荷瘤裸鼠腫瘤平均直徑達(dá)0.8～1.0 cm時(shí)，將裸鼠麻醉后脫臼處死，取其腫瘤及心、肝、脾、肺、腎等重要臟器組織浸泡于4%多聚甲醛固定，常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋，制成石蠟組織塊，切片后依次經(jīng)過(guò)烘烤、脫蠟復(fù)水、抗原修復(fù)、封閉，向組織切片加入兔抗人EpCAM抗體4℃孵育過(guò)夜，再加入兔超敏二步法免疫組化檢測(cè)試劑室溫孵育20 min，洗片后加入Poly-HRP anti-Rabbit IgG，室溫孵育20 min，再用DAB溶液顯色。用蘇木素染核5 min，依次經(jīng)過(guò)分化、返藍(lán)、脫水、透明，用中性樹脂封片，加蓋蓋玻片封固，在光學(xué)顯微鏡下觀察、取照。

7.組織免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Ep1-GoldMag的組織特異性

將50 μL FAM標(biāo)記的Ep1-GoldMag經(jīng)內(nèi)眥靜脈注入裸鼠體內(nèi)，隨后將裸鼠麻醉后脫臼處死，取其腫瘤及心、肝、脾、肺、腎等重要臟器組織迅速冷凍，OCT包埋后制備冰凍組織切片。加入5% BSA室溫封閉1 h，用DAPI染核，甘油-滅菌雙蒸水封片，在激光共聚焦熒光顯微鏡下觀察、取照。

8.前列腺癌荷瘤裸鼠MR特異性成像

將裸鼠麻醉后置于西門子3.0T MRI小動(dòng)物專用線圈進(jìn)行MRI掃描，采用俯臥位、頭先進(jìn)、T2WI冠狀位方向掃描，掃描參數(shù)：TR 7400 ms，TE 66 ms，視野200 mm×200 mm，層厚2.0 mm，層數(shù)15，翻轉(zhuǎn)角150°，平均采集次數(shù)4次。將50 μL Ep1-GoldMag經(jīng)裸鼠內(nèi)眥靜脈注入其體內(nèi)，分別在注射后1 h、6 h及12 h對(duì)裸鼠行MRI掃描，體位和掃描參數(shù)均與注射前MRI掃描相同。掃描完成后對(duì)圖像和數(shù)據(jù)進(jìn)行后處理，測(cè)量裸鼠腫瘤的信號(hào)強(qiáng)度。采用Graph Pad Prism 6.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，利用One-way Anova和t檢驗(yàn)比較各組裸鼠腫瘤在注入分子探針前后不同時(shí)間點(diǎn)的信號(hào)強(qiáng)度差異，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.核酸適配體Ep1在金磁納米微粒表面的固定化效率

采用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)Ep1在金磁納米微粒表面的固定化效率，結(jié)果顯示隨著加入Ep1的含量逐漸增加，其在金磁納米微粒表面的固定化效率逐漸下降(圖1)。當(dāng)Ep1加入40 μg時(shí)，其在金磁納米微粒表面的固定化效率約為92%，當(dāng)Ep1加入50 μg時(shí)，其在金磁納米微粒表面的固定化效率約為86%。

2.Ep1-GoldMag的細(xì)胞特異性檢測(cè)

將Ep1-GoldMag分別與LNCap、PC-3和WPMY-1細(xì)胞孵育后，采用激光共聚焦熒光顯微鏡觀察熒光在細(xì)胞的分布情況，結(jié)果顯示與Ep1-GoldMag作用的兩種EpCAM陽(yáng)性的前列腺癌細(xì)胞膜上均可見明顯的綠色熒光，而與對(duì)照組ssDNA-GoldMag作用的細(xì)胞膜上未見明顯綠色熒光顯示(圖2)，結(jié)果表明Ep1-GoldMag具有良好的EpCAM靶向親和性。

圖1 核酸適配體Ep1在金磁納米微粒表面的固定化效率。 圖2 激光共聚焦熒光顯微鏡觀察Ep1-GoldMag的細(xì)胞特異性。

3.EpCAM在前列腺癌荷瘤裸鼠腫瘤及重要臟器組織中的表達(dá)

用免疫組織化學(xué)染色實(shí)驗(yàn)檢測(cè)前列腺癌PC-3荷瘤裸鼠腫瘤組織及心、肝、脾、肺、腎等重要臟器組織中EpCAM的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，荷瘤裸鼠腫瘤組織中EpCAM呈高表達(dá)，而心、肝、脾、肺、腎等臟器組織中EpCAM表達(dá)不明顯(圖3)。

圖3 免疫組化染色檢測(cè)前列腺癌荷瘤裸鼠腫瘤組織及其重要臟器組織中EpCAM的表達(dá)。 圖4 激光共聚焦熒光顯微鏡觀察Ep1-GoldMag的組織特異性。

4.Ep1-GoldMag的腫瘤組織特異性檢測(cè)

將50 μL分子探針經(jīng)內(nèi)眥靜脈注入裸鼠體內(nèi)，隨后將裸鼠麻醉后予以脫臼處死，分別取其腫瘤組織及心、肝、脾、肺、腎等重要臟器組織制成冰凍組織切片。采用組織免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Ep1-GoldMag在裸鼠腫瘤組織及重要組織器官的分布情況。結(jié)果顯示Ep1-GoldMag可以特異性集聚于荷瘤裸鼠的腫瘤組織，而在心、肝、脾、肺、腎等重要組織臟器中未見明顯分布(圖4)。

5.Ep1-GoldMag對(duì)前列腺癌荷瘤裸鼠的MR特異性成像

對(duì)荷瘤裸鼠行MRI掃描，隨后將Ep1-GoldMag經(jīng)內(nèi)眥靜脈注入其體內(nèi)，分別在注射后1 h、6 h和12 h對(duì)裸鼠再次行MRI掃描。結(jié)果顯示注入Ep1-GoldMag 1 h后，腫瘤組織T2WI信號(hào)明顯減低，注入6 h后腫瘤組織T2WI信號(hào)持續(xù)減低，注入12 h后腫瘤組織T2WI信號(hào)強(qiáng)度略有升高，但與注射前相比仍呈明顯低信號(hào)；而ssDNA-GoldMag注射前后T2WI信號(hào)強(qiáng)度未見明顯減低(圖5a)，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組在分子探針注入后各時(shí)間點(diǎn)之間的信號(hào)強(qiáng)度差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；此外，實(shí)驗(yàn)組內(nèi)部注射前與注射后各時(shí)間點(diǎn)的信號(hào)強(qiáng)度差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖5b，表1、2)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Ep1-GoldMag可以在體內(nèi)特異性靶向并結(jié)合EpCAM陽(yáng)性的前列腺腫瘤組織，并使其在MR上成像。

圖5 Ep1-GoldMag注射前與注射后1h、6h和12h前列腺癌荷瘤裸鼠的MR成像。a) 注入分子探針Ep1-GoldMag 1h后進(jìn)行MRI掃描，可見裸鼠腫瘤組織T2WI信號(hào)強(qiáng)度明顯減低，注入分子探針6 h后，腫瘤組織T2WI信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)一步減低，注入分子探針12h后，腫瘤組織T2WI信號(hào)強(qiáng)度略有回升，但與注射前相比仍呈明顯低信號(hào)，而對(duì)照組分子探針ssDNA-GoldMag注射前后腫瘤組織T2WI信號(hào)強(qiáng)度未見明顯減低; b) 箱式圖顯示Ep1-GoldMag實(shí)驗(yàn)組與ssDNA-GoldMag對(duì)照組兩組之間的T2WI信號(hào)強(qiáng)度差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組在注入分子探針前后不同時(shí)間點(diǎn)的腫瘤T2WI信號(hào)強(qiáng)度比較

表2 分子探針2組1h、6h和12h裸鼠腫瘤T2WI信號(hào)強(qiáng)度比較

討 論

前列腺癌是中老年男性最常見的泌尿生殖系惡性腫瘤之一。傳統(tǒng)的治療手段如手術(shù)多適用于早期前列腺癌。內(nèi)分泌治療是進(jìn)展期前列腺癌最有效的治療方法，但在歷經(jīng)2～3年的有效期，病情終將進(jìn)展為雄激素非依賴性難治階段，使內(nèi)分泌治療失效，患者預(yù)后較差[9]。因此，早期發(fā)現(xiàn)并準(zhǔn)確診斷前列腺癌對(duì)于改善患者預(yù)后、延長(zhǎng)生存期至關(guān)重要。

與傳統(tǒng)的影像學(xué)相比，新興的分子影像學(xué)是將分子生物學(xué)等基礎(chǔ)學(xué)科引入到影像醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中來(lái)，可以從細(xì)胞分子層面探查疾病在活體的發(fā)展過(guò)程[10]。MRI以其高軟組織分辨率及成像參數(shù)多元化而成為理想的分子影像學(xué)診斷媒介[11-13]，但其特異度和靈敏度相對(duì)較低。通過(guò)尋找具有磁響應(yīng)性的MR對(duì)比劑，再聯(lián)合核酸適配體的高親和力特性可以制備兼具特異性靶向病灶并使其MR成像的分子探針，為腫瘤的靶向診斷和精準(zhǔn)治療提供了新方法。

在先前的研究中[8]，本課題組利用細(xì)胞指數(shù)富集配基的系統(tǒng)進(jìn)化(systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX)技術(shù)已成功制備靶向EpCAM分子的特異性核酸適配體Ep1，并通過(guò)一系列實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了Ep1對(duì)EpCAM陽(yáng)性組織細(xì)胞的特異性和親和性，為下一步分子探針的構(gòu)建奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

超順磁性氧化鐵納米微粒(super paramagnetic iron oxide nanoparticles,SPIONs)是一類新型的納米級(jí)材料，具有良好的超順磁性、生物相容性、生物降解性以及表面特性[14]，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域如腫瘤細(xì)胞MRI顯像等方面應(yīng)用前景廣闊?；谄涑槾判缘奈锢硖匦?，SPIONs可以明顯縮短T2和T2*馳豫時(shí)間，從而降低SPIONs聚集處組織細(xì)胞的MR信號(hào)強(qiáng)度[15]。SPIONs對(duì)MR馳豫性能的影響主要由磁鐵礦芯的尺寸、組成、結(jié)晶度和表面被覆涂層等物理化學(xué)性質(zhì)決定。增大SPIONs直徑以及在其表面涂覆聚合物涂層均可增加T2馳豫性能、增加組織中SPIONs的局部濃度、降低背景組織產(chǎn)生的信號(hào)噪聲[16]。本研究采用的GoldMag金磁納米微粒以氧化鐵為主體，本質(zhì)上屬于SPIONs，具有超順磁性氧化鐵的磁響應(yīng)性能[17]。為了權(quán)衡尺寸及其MR成像馳豫性能，本研究采用的金磁納米微粒直徑約40～50 nm，這種金磁納米微粒在表面涂覆了金被膜，可以在保證MR成像質(zhì)量的同時(shí)兼具偶聯(lián)性能。經(jīng)過(guò)固定化效率檢測(cè)，1 mg金磁納米微粒表面可偶聯(lián)約40 μg核酸適配體Ep1，可滿足本實(shí)驗(yàn)偶聯(lián)微量核酸適配體的需要。

分子探針進(jìn)入體內(nèi)以后，在血循環(huán)中需要有合適的清除期，以便既能有效成像，又不會(huì)產(chǎn)生高本底。先前一系列小動(dòng)物活體MR成像研究顯示，在注射對(duì)比劑后平均2～5 h左右，目標(biāo)病灶呈現(xiàn)明顯的特異性強(qiáng)化，延遲成像時(shí)間可達(dá)20 h[18,19]。本研究分別選擇在注射后1 h、6 h以及12 h對(duì)荷瘤裸鼠行MRI掃描，發(fā)現(xiàn)早在對(duì)比劑注入1 h時(shí)，病灶已有明顯信號(hào)改變，6 h后病灶特異性顯像更為顯著，延遲至12 h，雖然信號(hào)強(qiáng)度較6 h時(shí)有所回升，但仍呈現(xiàn)特異性強(qiáng)化，與注入對(duì)比劑前相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

本研究制備的分子探針Ep1-GoldMag具有良好的理化性能，不僅具有EpCAM組織細(xì)胞特異性，還能使前列腺癌EpCAM荷瘤裸鼠在MR上特異性成像，但對(duì)于其生物相容性、半衰期及代謝途徑等藥代動(dòng)力學(xué)特性還有待進(jìn)一步研究。