現(xiàn)代心肺復蘇動物模型研究進展

湯紅梅 綜述 單怡 審校

1.上海市奉賢區(qū)中醫(yī)醫(yī)院急診科，上海 201499；

2.海軍軍醫(yī)大學第二附屬醫(yī)院(上海長征醫(yī)院)急救科，上海 200001

心搏驟停(cardiac arrest，CA)是指心臟有效搏動突然停止。在美國，每年約有35萬人發(fā)生院外心搏驟停(out of hospital cardiac arrest，OHCA)，而院內(nèi)心搏驟停(in hospital cardiac arrest，IHCA)人數(shù)約為20萬[1]。心搏驟停死亡率很高，即使復蘇成功后，多數(shù)存活患者仍然遭受嚴重的缺血缺氧損傷，各臟器功能發(fā)生損害。因臨床無法模擬實際心搏驟停的場景，故擬通過設計心搏驟停動物模型來模擬人類的心搏驟停事件，用于研究心肺復蘇后機體發(fā)生的病理生理變化、優(yōu)化心肺復蘇流程[2]，提高CA患者的生存率及復蘇后生活質(zhì)量。

1 常用心肺復蘇動物的選擇

目前用于建模的動物有大動物、中等動物以及小動物[3-4]，不同的動物模型有其各自的優(yōu)缺點[5]，其中應用最廣泛的是豬，其次是大鼠、小鼠、兔子，以成年雄性動物為多。

1.1 大動物實驗模型代表豬是一種大型哺乳動物，其心臟解剖和生理結(jié)構(gòu)與人類相似[6]，傳導系統(tǒng)的血供、冠脈血液分布、心肌組織學表現(xiàn)以及缺血損傷后的代謝、靜息心率、血壓、血清化學成分與人類非常相似[7]，且血容量較大，可滿足實驗所需的相關(guān)生化分析、血管內(nèi)和心內(nèi)壓力檢測以及靜脈給藥及治療等。豬的胸廓寬大，對胸外按壓及心臟除顫耐受較好，且腦組織體積大，可取得更多的組織標本。因此，73%的室顫模型選用豬[5]。一般選用成年雄性豬，有約克夏長白橫豬[(80.0±6.0)kg]或12~14個月齡小型家豬[8][(25.0±2.0)kg]、北京長白豬[(30.0±1.0)kg]。但豬因體積龐大、麻醉難度較大，實驗操作起來需要的人力較多，故造模成本較高。犬的神經(jīng)系統(tǒng)較發(fā)達，修復能力弱，對于缺血缺氧損傷更敏感，能更好地模擬人心肺復蘇后的嚴重腦損傷。一般有選用3~5歲雌性純種小獵犬[9](7.5~13 kg)、雄性成年比格犬[10](10~12 kg)、成年雜種犬(10~15 kg)等行CA相關(guān)實驗研究。羔羊的體質(zhì)量、基線血壓與胎兒接近，故在研究新生兒窒息領域有重要的價值。有實驗研究羔羊在母體行剖腹產(chǎn)后行臍帶結(jié)扎引起心臟驟停[11]，模擬圍產(chǎn)期窒息模型，但實驗成本高，實驗操作技術(shù)要求高，國內(nèi)相關(guān)研究甚少。猴的神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)達，與人類有很多相似的地方，有研究發(fā)現(xiàn)CA后猴的腦血管內(nèi)存在大量血凝塊，但因其本身的珍貴性及稀有性，故極少用來做心肺復蘇模型。

1.2 中等動物實驗模型代表家兔性格溫順、體型較小、實驗成本低，家兔心臟具有左右心房及心室，動脈血壓與人類也基本相似，兼有大小動物的一些優(yōu)點，是近期較常用來CA建模的動物。國內(nèi)實驗研究多采用成年雄性新西蘭大白兔(2~2.5 kg)、日本大耳白兔(2~3 kg)。有學者研究兔CA后氫氣干預可降低心肌糖代謝，以及CA后不同時相亞低溫治療對兔腦功能的影響。國外有選用成年龍貓雜種兔[12](1.5~2 kg)研究Olesoxime對心肌缺血再灌注損傷的保護作用。

1.3 小動物實驗模型代表嚙齒類小動物如大鼠和小鼠相對實驗成本低，操作方便，且其都有左右心房和心室組成，和人類相似。不同的是大鼠心率為260~450次/min，小鼠心率為500~600次/min。因大鼠基礎心率快，相對不應期短，具有自動復律及除顫功能，故誘導室顫時需要持續(xù)低強度電流維持，所需致顫時間較長。大鼠神經(jīng)系統(tǒng)相對不發(fā)達，心肺復蘇后很少出現(xiàn)意識障礙及腦干功能衰竭，與人腦對缺血缺氧損傷異常敏感的生理病理特點不同，在模擬嚴重缺氧性腦病時與臨床情況有一定差別。國內(nèi)研究一般選用健康成年雄性SD大鼠[(466±45)g]行CA后相關(guān)實驗研究，也有學者選用10周齡Sprague-D awley大鼠[13][(310~320)g)行CA后觀察到低溫(32℃)治療可減輕神經(jīng)損傷。還有選用昆明小鼠[(30~40)g]研究發(fā)現(xiàn)戊巴比妥較水合氯醛更適合CA動物麻醉。

2 常用誘導心搏驟停的實驗方法

誘導心搏驟停常用的方法有電擊致顫法、窒息法和氯化鉀停跳法。2017年發(fā)表在《Resuscitation》上的綜述總結(jié)了2011—2016年CA的動物模型文章，其中電擊致顫占54%、窒息占25%、高鉀占8%、冠狀動脈結(jié)扎誘導急性心肌梗死占2%、毒物占3%、大血管閉塞占1%、張力性氣胸，還有幾種方法的組合等[5]。其中，電擊致顫模型中豬使用最廣泛，窒息模型中多使用大鼠，高鉀模型中多使用小鼠。

2.1 電擊致顫法誘導CA經(jīng)右心導管交流電誘發(fā)室顫，這是最經(jīng)典的電擊方式，致顫的結(jié)果是心臟無法維持正向血流。以大鼠為例：對致顫大鼠的一側(cè)頸外靜脈置入絕緣導管約4 cm，導管中插入導絲，劍突下皮下組織處置一側(cè)電極，根據(jù)血壓波形，判斷導絲是否進入右心室，2.5 mA通電誘顫，觀察大鼠血壓及心電圖變化，調(diào)整誘顫導絲位置，直至心電圖呈室顫心律。致顫2.5~3 min后關(guān)閉電源，見自發(fā)室顫[14]。大動物中以豬為例[15]：給豬行右側(cè)股靜脈置管至右心室，胸壁皮下組織插入另一電極，采用30~60 mA交流電通電10 s誘發(fā)室顫。經(jīng)胸壁體外電擊誘導室顫：經(jīng)胸壁以60~70 V直流電電擊5 s或50~110 V交流電電擊1~2 s，可重復電擊多次，直至心電圖出現(xiàn)室顫。經(jīng)食道-胸壁電刺激誘導室顫：經(jīng)食道插入食道調(diào)搏電極至心臟水平，同時將另一電極插入動物胸壁皮下。多項研究表明：6 mA、4 ms、50 Hz可以達到最小損傷且穩(wěn)定致顫的目的。開胸直視電擊誘導室顫：將麻醉后家兔開胸直視下采用1 V交流電誘發(fā)室顫4 min，并在直視下行心臟按壓及藥物復蘇治療。

2.2 窒息法誘導CA窒息法是指在呼氣末通過氣管插管管口堵塞或氣管切開后夾閉氣管來模擬呼吸道梗阻，造成窒息缺氧致心跳停止。大鼠在窒息動物模型中占46%[5]。窒息所致的心搏驟停不同于室顫，室顫是突然發(fā)生的，而窒息是一個逐漸發(fā)生的過程，可合并有嚴重呼吸性酸中毒。故窒息致心搏驟停模型會導致更嚴重的心、腦、腎和彌漫性微循環(huán)障礙[16-17]，利用PET-CT檢查發(fā)現(xiàn)豬窒息后致腦代謝的損傷明顯重于室顫法[18]。

2.3 高鉀誘導CA將10%氯化鉀溶液快速注入動物靜脈或心腔，可快速導致CA。此法操作相對簡單，但因致CA時心電圖常呈無脈性心電活動或者心室靜止，和臨床某些先室顫后演變?yōu)樾氖异o止情況有一定差別，且推注高鉀引起動物體內(nèi)電解質(zhì)紊亂，故采用此法時需注意電解質(zhì)紊亂對實驗結(jié)論的影響。

2.4 冠脈結(jié)扎或閉塞發(fā)生急性心肌梗死誘導CA1946年，Heimburger等[19]第一個結(jié)扎大鼠冠脈制作急性心梗模型。將大鼠左前降支或左回旋支閉塞后的前30 min內(nèi)，73%~100%的動物發(fā)生室速(VT)，57%~89%的動物發(fā)生室顫(VF)。豬可通過穿刺股動脈，用標準的6-F冠脈介入導管置入優(yōu)勢冠脈口，用標準的血管成型術(shù)球囊充氣至8 atm，封堵冠脈，經(jīng)冠脈造影確定無血流通過，建立急性心梗模型。繼而觀察心電圖及動脈血壓變化，若實驗動物出現(xiàn)室顫、電機械分離或動脈壓力曲線波為直線，則提示CA造模成功。

2.5 其他方式誘導CA如放血療法使動物出現(xiàn)失血性休克而建立CA模型。利用大型豬(70~90 kg)制作出血引起的創(chuàng)傷性心臟驟停模型(TCA)等。此種方法導致的血壓降低是漸進性的，不會發(fā)生心臟節(jié)律或心電圖的突然改變，干擾因素較多，且創(chuàng)傷較大，感染機會多，只能短期觀察生存率，不適合做長時間監(jiān)測。除此之外，還有窒息合并頸內(nèi)靜脈注射冰氯化鉀、毒物或藥物致CA模型等。

3 心搏驟停造模流程

3.1 麻醉方式實驗動物術(shù)前12 h禁食不禁水。麻醉方式有吸入麻醉，靜脈、腹腔、皮下、肌肉注射等。常用的麻醉藥物有戊巴比妥鈉、氯胺酮、氟烷、異丙酚、安定、異氟醚等，目前應用最多的是戊巴比妥鈉。大鼠為5%戊巴比妥(45 mg/kg)腹腔麻醉，之后以10 mg/(kg·h)補充麻醉；小鼠為1%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)腹腔麻醉；大型動物如豬等。一般予以氯胺酮(20 mg/kg)臀部肌肉注射誘導麻醉，經(jīng)耳緣靜脈予以3%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)靜脈麻醉，另予以8 mg/(kg·h)持續(xù)鎮(zhèn)靜治療，維持動物麻醉狀態(tài)，阿托品0.25 mg臀部肌肉注射防止過多分泌物分泌。

3.2 造模前準備及生命體征監(jiān)測誘導CA前完成人工氣道、動靜脈置管后，監(jiān)測心率、平均動脈壓、呼氣末二氧化碳分壓、基線血氣分析，若上述指標均正常，則考慮實驗動物術(shù)前準備達標。在整個實驗過程中，始終用電熱燈泡或電熱毯控制動物肛溫在(37±0.5)℃。如氣管插管過程中出現(xiàn)心搏驟停，予以心肺復蘇的動物或者有大出血、基線平均動脈壓及心率、呼氣末二氧化碳分壓不能維持在正常范圍的，則棄用。

3.3 復蘇過程根據(jù)不同的實驗設計進行心肺復蘇。大鼠按壓位置為劍突上3 cm，幅度為胸廓前后徑的1/3，氣管插管連接小動物呼吸機吸入100%氧氣濃度，按壓與通氣比例為2∶1。當復蘇過程中心電圖呈室顫波時，給予2 J雙向電除顫一次，除顫后立即恢復胸外按壓，2 min后再次判斷，必要時再次除顫。復蘇過程中可給于腎上腺素等輔助藥物。大動物如豬，按壓位置為胸骨中下1/3，按壓頻率為100~120次/min，深度為胸廓前后徑的1/3；以100%的氧氣濃度恢復機械通氣。出現(xiàn)室顫波時給予150 J的雙向波電除顫一次，并判斷是否恢復自主循環(huán)。胸外按壓方式有手動按壓、小動物胸外按壓機、薩博機以及改良的縫紉機。

3.4 捐獻(Donor)動物在實驗過程中需備有Donor動物，尤其是小動物的血容量較少，在動靜脈置管過程中可能會出現(xiàn)出血較多、手術(shù)時間較長的情況，為了保證實驗動物的正常血壓及完成后續(xù)相關(guān)造模實驗要求，保證實驗前基線水平的一致性，需要準備若干只Donor動物，來補充實驗動物的失血量。

3.5 幾個相關(guān)概念Utstein標準(1996年)：是最為常用的呼吸心搏驟停標準，即動脈收縮壓＜25 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)，心電圖顯示為室顫或無脈電活動。無灌流時間：即從心臟停至到心肺復蘇開始的時間[5]。自主循環(huán)恢復(ROSC)[20]：從開始進行標準心肺復蘇至出現(xiàn)自主心律，脈搏波、收縮壓≥60 mmHg且維持10 min以上。復蘇失?。撼掷m(xù)搶救15~30 min以上自主循環(huán)仍未恢復。

4 心搏驟停模型器官功能的相關(guān)研究

4.1 神經(jīng)系統(tǒng)

4.1.1 腦灌注及腦血流文獻綜述分析在成年動物CA模型中皮層和皮層下都有低灌注，灰質(zhì)更容易發(fā)生。動物模型CBF的評估有激光多普勒探頭[21]、靜脈注射微球、自動放射成像法[22]、激光散斑流量法、光學成像法等微創(chuàng)方式以及CT、SPECT、MRI等無創(chuàng)方式。

4.1.2 組織病理學CA誘導的神經(jīng)元壞死在海馬、紋狀體和大腦皮層。Choy等[23]對CA后的皮質(zhì)神經(jīng)退行性變也有報道。Coimbra-Costa等[24]研究證實與海馬CA1區(qū)相比，新皮層對缺氧再灌注的敏感性較低。Keilhoff等[25]制作窒息性大鼠心臟驟停模型(ACA)研究結(jié)論顯示：ACA后，皮質(zhì)呼吸鏈復合物活性增加，線粒體作為ACA誘導細胞應激后能量需求增加的反應，其ATP的合成增加，線粒體MnSOD快速、有效、持久的防御。

4.1.3 生物標志物蛋白最新研究發(fā)現(xiàn)：血清神經(jīng)絲輕鏈(Nfl)[26]在CA患者中血清濃度與生存率呈負相關(guān)，在預測患者預后上優(yōu)于NSE。miRNA為最新缺血缺氧性腦病可預測性的生物標記物，研究表明：在圍產(chǎn)期窒息及新生兒缺血缺氧腦病的患兒中，臍帶血miR-374a和miR-376c的表達降低[27]，在小豬模型中也有類似結(jié)果。同時，肌鈣蛋白T也被認為是一個腦損傷的生物標志物。S-100B是早期急性神經(jīng)損傷生物標志物中研究較多的一個蛋白[28]，CA后24 h血清濃度達峰值，但它也存在于其他組織，故在神經(jīng)預測方面缺乏特異性[29-30]。髓磷脂堿性蛋白(MBP)是持續(xù)的急性神經(jīng)損傷生物標志物[28]。MBP免疫反應性被用于評估豬心臟驟停模型腦組織髓磷脂的損失[31]，MAP濃度與預后呈負相關(guān)[32]。有學者對新生仔豬缺血缺氧性腦病研究發(fā)現(xiàn)：腦脊液中S100A8水平增加最多(9.5倍)，CDH2水平下降最多(0.3倍)，血漿中FABP1顯著增加31.8倍，這可能與缺血缺氧性腦病后的腦損傷直接相關(guān)[33]。另血漿中SOD1表達增加，破壞體內(nèi)氧自由基，可改善腦損傷的預后。干細胞移植是腦復蘇研究領域新的熱點。有學者研究骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)在大鼠全腦缺血缺氧損傷的保護作用和機制。通過窒息法誘導大鼠心搏驟停，并予以心肺復蘇，ROCS后1 h經(jīng)大鼠尾靜脈注射BMSCs，研究發(fā)現(xiàn)BMSCs可能通過分泌胰島素樣生長因子(insulin-like growth factor-1，IGF-1)起到營養(yǎng)神經(jīng)的作用，從而改善心肺復蘇后大鼠的神經(jīng)功能。

4.2 心臟有實驗通過電誘導室顫法致大鼠心臟驟停后進行心肺復蘇，于各觀察點動態(tài)觀察大鼠復蘇后心臟結(jié)構(gòu)和功能的動態(tài)變化及血清心肌酶學、線粒體呼吸功能及組織病理學，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在全心缺血-再灌注的過程中，心肌線粒體呼吸功能下降，超微結(jié)構(gòu)受損，能量生產(chǎn)障礙；心超提示：心室壁增厚并心肌做功指數(shù)增加；組織病理學可見間質(zhì)增生[34]。但至于心肌細胞能否逆轉(zhuǎn)等，因?qū)嶒瀯游锛皸l件的限制，目前暫不太清楚。筆者自己在做大鼠室顫致CA模型的時候，ROSC后觀察至72 h，取心臟標本時有一只大鼠出現(xiàn)嚴重的心肌肥厚，左室壁肥厚，左心室腔明顯變小，同時還有纖維化表現(xiàn)。但在豬的心肺復蘇模型中，有研究者發(fā)現(xiàn)復蘇后心功能恢復大約需要24~48 h。有實驗證明，復蘇大鼠心肌中K-OR的基因和蛋白表達水平較正常增高，K-OR的保護性上調(diào)與復蘇后心功能障礙的發(fā)生相關(guān)；K-OR激動劑對復蘇后心功能有保護作用，在缺血早期激活K-OR心肌保護作用更好。有學者通過大鼠CA模型研究普羅布考對大鼠心臟驟停的保護作用及其可能機制，結(jié)論顯示普羅布考可減輕大鼠CA誘導的氧化應激，改善血流動力學參數(shù)和心臟功能，可提高大鼠ROSC率和存活時間，這種保護作用可能是通過KEAP1-NFE2L2系統(tǒng)的調(diào)節(jié)產(chǎn)生的[35]。

4.3 腎臟及肝臟Tissier等[36]通過對兔實行室顫致CA模型實行全弗化碳液體通過實行低溫處理，發(fā)現(xiàn)其對復蘇后腎功能是有保護作用的，也增加了腎臟器官捐獻的可實用性。

4.4 凝血功能CA和CPR后激活體內(nèi)炎癥因子發(fā)生DIC，中性粒細胞和血管內(nèi)皮細胞激活。IL-1激活了下丘腦-垂體-腎上腺軸，產(chǎn)生大劑量腎上腺素，與纖維蛋白血栓形成有關(guān)。另血小板被激活，但血小板聚集下降[37]。動物實驗也證明：犬在CA后腦血管內(nèi)存在大量的血凝塊，肝素可降低死亡率。家兔的肺、脾、肝臟在CA后均有血管內(nèi)纖維蛋白血栓形成。DIC最終導致多器官功能障礙，這是影響心搏驟停后綜合征預后的一個重要因素。

4.5 炎癥感染有研究發(fā)現(xiàn)FTY720對CA后大鼠起抗炎、抗氧化、抗凋亡作用，減輕心臟炎癥反應及心肌損傷，改善心功能[38]。CA后患者體內(nèi)類固醇激素水平越低，患者預后越差；反之，IL-6水平越低，則預后越好[39]。應激劑量的類固醇可增強血管緊張素的作用，減少器官功能損傷。

4.6 免疫系統(tǒng)有學者研究發(fā)現(xiàn)CA后存活一周的患者體內(nèi)CD73表達水平和預后呈正相關(guān)，其主要是通過促進血管內(nèi)皮生長因子的分泌和抑制髓樣細胞的炎癥激活起炎癥保護作用[40]。

5 結(jié)語

綜上所述，通過制作動物CA模型，可以為臨床不同發(fā)病病因所致的心搏驟停以及心搏驟停后人體重要器官功能改變、組織病理學、生化指標、特異性生物標記物等的變化提供實驗依據(jù)。但實驗動物一般采用的都是健康成年動物[41]，而臨床實際中，發(fā)生心搏驟停的患者一般都是老年人且合并多種慢性病，所以動物實驗的數(shù)據(jù)及相關(guān)結(jié)果可能與臨床實際還是有一定的差別。我們需要在不斷的摸索學習中，找到兩者之間的平衡點，更合理地將動物實驗結(jié)果應用于臨床。