毛葉苕子磷饑餓響應(yīng)基因VvPHR1的克隆及功能研究

毛琳琳，朱瑞利，易可可，段志龍，王秀斌，周 衛(wèi)，孫靜文*

（1 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所，北京 100081 / 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部植物營養(yǎng)與肥料重點實驗室；2 延安市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，陜西 延安 716000）

磷是核酸、脂質(zhì)、糖類等生物大分子的重要組成部分，在細(xì)胞代謝活動、酶的調(diào)控反應(yīng)中起著至關(guān)重要的作用[1–3]。盡管在土壤中磷含量豐富，但其擴(kuò)散速率較低，易被金屬離子固定，不易被植物吸收利用[4], 因此土壤中磷的有效性并不高。在低磷環(huán)境下，植株生長緩慢、矮小且瘦弱，同時生育期延遲，并最終導(dǎo)致農(nóng)作物減產(chǎn)[5]。在生產(chǎn)中通常會施用磷肥來解決作物缺磷問題，但當(dāng)季磷肥利用率并不高，通常在10%～25%，同時過度施用磷肥會造成磷礦資源枯竭和水體富營養(yǎng)化等負(fù)面影響[6]。因此，提高植物自身對磷的吸收顯得尤為重要。

多年來，育種學(xué)家們通過雜交育種或分子改良等方法來提高作物對磷的吸收和利用能力以提升作物對低磷環(huán)境的適應(yīng)性[7–8]。PHR基因是植物響應(yīng)低磷脅迫的關(guān)鍵調(diào)控因子，可通過啟動下游基因的表達(dá)來提高植物對磷的吸收，被啟動的功能基因主要包括促進(jìn)根系伸長基因和磷的轉(zhuǎn)運蛋白基因等[9–10]。PHR基因?qū)ο掠位虻恼{(diào)控作用最早在擬南芥中報道，目前共發(fā)現(xiàn)15個AtPHR家族成員，其中PHR1基因是參與低磷調(diào)控最重要的一個基因。水稻中的同源基因為OsPHR2，與AtPHR1有相同的功能[10]，同時 OsPHR3、OsPHR4 基因等相繼被發(fā)現(xiàn)[11–12]。 在擬南芥和水稻模式植物中，大多數(shù)磷饑餓響應(yīng)基因都是被 AtPHR1 和 OsPHR2 以及其同源基因 AtPHL1、AtPHL2、OsPHR1 和 OsPHR3 誘導(dǎo)而激活[13–14]。因此，通過轉(zhuǎn)錄因子誘導(dǎo)下游磷吸收相關(guān)基因的表達(dá)，來提高轉(zhuǎn)基因植物抗低磷脅迫能力一直是國內(nèi)外研究的熱點。迄今為止，已經(jīng)從擬南芥、水稻、小麥、玉米、油菜等多種植物中克隆出PHR轉(zhuǎn)錄因子。在豆科植物中，已從大豆中克隆了35個PHR基因，并將其中的GmPHR25轉(zhuǎn)入到大豆中，在低磷脅迫下，獲得的轉(zhuǎn)基因植株根毛中11個磷轉(zhuǎn)運基因及5個磷饑餓響應(yīng)基因的表達(dá)顯著提高[15]。同時，在NCBI GenBank中還能搜索出苜蓿等的PHR基因序列，但沒有相應(yīng)基因的生物學(xué)功能報道。因此，總體來說豆科植物PHR基因功能的相關(guān)研究較少。

毛葉苕子(Vicia villosa)是重要的豆科綠肥作物，具有較強(qiáng)的固氮能力，翻壓還田可以有效提高土壤中養(yǎng)分含量，改良土壤結(jié)構(gòu)。但是其對磷利用率低，吸收利用土壤難溶性磷酸鹽的能力較差，極大地限制了其在綠肥翻壓還田增加土壤有效磷含量中的應(yīng)用。長期以來關(guān)注毛葉苕子氮素養(yǎng)分吸收及釋放規(guī)律多，其磷素養(yǎng)分吸收轉(zhuǎn)運的相關(guān)研究少。同時，關(guān)于PHR基因的研究都是在模式植物如水稻、擬南芥開展的，非模式植物特別是綠肥作物上的研究甚少。毛葉苕子中PHR基因的生物學(xué)功能是否與模式植物一致，目前并不清楚。因此，本研究從毛葉苕子中克隆PHR基因，研究該基因的亞細(xì)胞定位特征及轉(zhuǎn)錄自激活功能，進(jìn)一步將該基因分別在野生型及Atphr1突變體擬南芥中表達(dá)，研究轉(zhuǎn)基因材料的生理表型及磷含量變化，以期深入揭示毛葉苕子PHR基因的生物學(xué)功能，為遺傳改良磷高效毛葉苕子品種、闡明綠肥作物耐低磷脅迫的分子機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試毛葉苕子品種為‘蘇聯(lián)毛苕’和‘徐苕3號’，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所曹衛(wèi)東研究員提供，phr1突變體擬南芥由清華大學(xué)劉棟教授提供。植物總RNA提取試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購于TIANGEN生物公司。大腸桿菌 DH5α感受態(tài)細(xì)胞、農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞、酵母AH109感受態(tài)細(xì)胞均購于北京擎科生物技術(shù)有限公司。試驗所設(shè)計的引物由上海生工生物工程有限公司合成?？寺≥d體pCAMBIA1300、pCAMBIA1300-GFP均購于北京華越洋生物公司。

1.2 毛葉苕子轉(zhuǎn)錄組測序及PHR基因相關(guān)轉(zhuǎn)錄本表達(dá)分析

設(shè)置兩個處理：1)正常磷 (200 μmol/L Pi)；2)低磷(2 μmol/L Pi)，3次重復(fù)。在智能光照培養(yǎng)箱中(26℃，16 h 光照；20℃，8 h 黑暗)，采用 Hoagland改良營養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，營養(yǎng)液pH為6.3 ± 0.1，每隔3天更換1次營養(yǎng)液。

選取正常磷和低磷處理12天的‘蘇聯(lián)毛苕’和‘徐苕3號’的地上部和根系，每個處理3次生物學(xué)重復(fù)，共計構(gòu)建24個基因文庫。為消除個體間差異，將低磷處理12天相同品種的毛葉苕子5株混合取樣，每個材料取3次生物學(xué)重復(fù)，樣品經(jīng)液氮速凍后?80℃保存，用于RNA提取。委托美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成基因文庫構(gòu)建和轉(zhuǎn)錄組測序。采用單分子實時測序技術(shù)(SMRT)進(jìn)行毛葉苕子全長轉(zhuǎn)錄組測序。使用RSEM比對軟件(http://deweylab.biostat.wisc.edu/rsem/)對轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)水平進(jìn)行定量分析，利用 FPKM (fragments per kilobases per million reads)法計算基因表達(dá)量，即每一百萬條序列中，每個基因以一千個堿基為單位，比對上的reads (建庫時打斷獲得的fragments，當(dāng)以PE測序時，同一個片段包含兩條reads)個數(shù)。具體公式如下：FPKM=某基因唯一比對到基因的fragments數(shù)/(某基因的長度×唯一比對到參與基因組的總fragments數(shù))×109。

1.3 VvPHR1基因的克隆

基于毛葉苕子3代全長轉(zhuǎn)錄組測序獲得PHR序列信息，設(shè)計上下游引物，正向引物序列為primer F：5′– ATGGAAGCTCGTCCTGCTTTCTCAATTG–3′，反向引物序列為 primer R：5′–TCAATGGGGCTTA GTTTTTTTTTCTCCAGC–3′。采用 TIANGEN 公司的試劑盒提取毛葉苕子總RNA，以毛葉苕子總RNA為模板，用Promega公司的AMV反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，獲得毛葉苕子cDNA。利用PCR方法從cDNA中擴(kuò)增PHR基因全長ORF，反應(yīng)體系為 cDNA 1 μL、2×KOD Buffer 25 μL、dNTPs 5 μL、KOD酶1 μL、上下游引物各1 μL，ddH2O補足至50 μL。PCR 反應(yīng)條件為 95℃ 5 min；95℃ 30 s，58℃10 s，72℃ 1 min；28 個循環(huán)；72℃ 5 min 。PCR 產(chǎn)物膠回收后連接到pMD18-T克隆載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，然后提取質(zhì)粒DNA，將質(zhì)粒送北京博邁德生物科技有限公司完成測序，獲得毛葉苕子PHR基因序列，命名為VvPHR1基因。

1.4 VvPHR1基因的亞細(xì)胞定位分析

根據(jù)VvPHR1基因的開放閱讀框設(shè)計特異性引物 (primer F：5′– AACACGGGGGACGAGCTCGGTA CCATGGAAGCTCGTCCTGCTTTCTC–3′; primer R：5′– ATGATACGAACGAAAGCTCTGCAGATGGG GCTTAGTTTTTTTTTCTCCAGC–3′)，采用高保真酶擴(kuò)增獲得VvPHR1基因全長ORF(去除終止密碼子TGA)，采用無縫克隆與pCAMBIA-35S-EGFP載體連接構(gòu)建融合表達(dá)載體，參照郭貞慧[16]的方法制備水稻原生質(zhì)體和煙草細(xì)胞，采用PEG介導(dǎo)法和農(nóng)桿菌注射法將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pCAMBIA-VvPHR1-EGFP分別轉(zhuǎn)入水稻原生質(zhì)體和煙草細(xì)胞中，在光照培養(yǎng)箱中于25℃下光照培養(yǎng)48 h，采用激光共聚焦顯微鏡 (ZEISS LSM- 510 META，Germany)觀察其亞細(xì)胞定位。

1.5 VvPHR1基因的轉(zhuǎn)錄激活功能分析

根據(jù) VvPHR1 設(shè)計特異性引物 (primer F：5′– A GGCCGAATTCCCGGGATGGAAGCTCGTCCTGCT–3′; primer R：5′–GCCGCTGCAGGTCGACTCAATG GGGCTTAGTTTTTTTTTCTCCAGC–3′)，擴(kuò)增VvPHR1基因的ORF，與用XmaI和SalI雙酶切后的表達(dá)載體pGBKT7連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pGBKT7-VvPHR1，經(jīng)測序驗證后轉(zhuǎn)入釀酒酵母AH109，以pGBKT7空載體作為陰性對照，按照100、101、102、103、104和105等6個濃度梯度均勻涂于SD/?Trp單缺陷平板、SD/?Trp/?His 兩缺平板、SD/?Trp/?His/?Ade三缺陷平板上培養(yǎng)，觀察轉(zhuǎn)化子的生長情況，再挑選轉(zhuǎn)化子涂于 SD/?Trp/?His/?Ade(+X-αgal)顯色平板，進(jìn)行β-半乳糖苷酶活性檢測，并拍照記錄。

1.6 VvPHR1基因遺傳轉(zhuǎn)化擬南芥

根據(jù)VvPHR1的開放閱讀框設(shè)計含有酶切位點的特異性引物 (primer F：5′– GGGGTACCATGG AAGCTCGTCCTGCTTTCTC–3′; primer R：5′– ACG CGTCGACTCAATGGGGCTTAGTTTTTTTTTCTCC AGC–3′)，采用高保真酶擴(kuò)增獲得VvPHR1全長ORF，選用限制性內(nèi)切酶KPNI和SALI酶切載體pCAMBIA1300以及帶有酶切位點VvPHR1全長ORF，采用T4連接的方法將目的基因與pCAMBIA1300-35S載體連接構(gòu)建融合表達(dá)載體pCAMBIA1300-35SVvPHR1，然后通過電擊法，將融合表達(dá)載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞。

播種前將擬南芥種子放置于4℃冰箱春化2天，然后營養(yǎng)土裝盆播種擬南芥，待其抽薹開花后進(jìn)行花序侵染。將冷凍保存的含pCAMBIA1300-35S-VvPHR1農(nóng)桿菌菌液活化培養(yǎng)后用于侵染擬南芥。活化后的農(nóng)桿菌菌液加入15 μL表面活化劑Silwet-77，震蕩混勻，利用沾花法分別侵染野生型及phr1突變體擬南芥。剪去已經(jīng)開過的擬南芥的花與籽粒莢，留下花蕾備用。將擬南芥花浸入農(nóng)桿菌懸浮液30 s并套袋處理，重復(fù)侵染2～3次。在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng) (23℃，16 h 光照；20℃，8 h 黑暗)，30 天后，收集成熟種子(T1代)后放置37℃烘干，之后置于4℃保存。

通過潮霉素對T1代擬南芥種子進(jìn)行抗性篩選，獲取陽性轉(zhuǎn)基因植株(圖1)。然后通過PCR檢測潮霉素抗性基因(Hyg)，對轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行進(jìn)一步鑒定，檢測引物：Hyg(501) F：GAGCATATACGCC CGGAGTC；Hyg(501) R：CAAGACCTGCCTGAA ACCGA，結(jié)果顯示抗性植株擴(kuò)增出約501 bp的目標(biāo)條帶(圖2)。連續(xù)加2代，獲得穩(wěn)定遺傳的T3代轉(zhuǎn)基因擬南芥。

圖1 轉(zhuǎn)基因擬南芥潮霉素抗性苗篩選Fig. 1 Screening of hygromycin-resistant seedlings in transgenic Arabidopsis thaliana

圖2 轉(zhuǎn)基因擬南芥電泳檢測Fig. 2 Electrophoretic test of transgenic Arabidopsis thaliana

1.7 實時熒光定量PCR

將生長30天的正常磷(1 mmol/L Pi)和低磷(1 μmol/L Pi)處理的野生型(WT)和過表達(dá)型(OEPHR1)擬南芥取樣，液氮速凍，提取擬南芥總RNA，使用Promega公司的AMV反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，使用 SYBR Green Pro Taq HS qPCR Kit(Accurate Biotechnology)試劑盒進(jìn)行熒光定量PCR。定量 PCR 反應(yīng)體系為 10 μL 2× SYBR Green Pro Taq HS Premix、1 μL 引物 (10 μmol/L)、2 μL cDNA、0.4 μL ROX Reference Dye，并加入 ddH2O 至 20 μL。反應(yīng)程序：1) 95℃ 預(yù)變性 10 min；2)擴(kuò)增階段，95℃變性 10 s，58℃ 退火+延伸 45 s，40 個循環(huán)；3)溶解曲線階段，95℃ 變性 15 s，60℃ 1 min。其中每個樣品包括3次生物學(xué)重復(fù)和3次技術(shù)重復(fù)。定量PCR引物序列見表1。數(shù)據(jù)分析方法：用擬南芥內(nèi)參基因actin作為相對定量的標(biāo)準(zhǔn)，表達(dá)分析使用2–ΔΔCT法，方法如下：

表1 實時熒光定量PCR引物序列Table 1 Primer sequence of the real-time fluorescent quantitative PCR

1) 待測樣品△CT=待測樣品 CT(gene)–待測樣品CT(actin)；

2)對照樣品△CT=對照樣本CT(gene)–對照樣品CT(actin)；

3) △△CT=待測樣品△CT–對照樣品△CT。

1.8 轉(zhuǎn)VvPHR1基因擬南芥的表型觀察及磷含量測定

將野生型(WT)、T3代轉(zhuǎn)基因型(OEPHR1)、突變體(phr1)以及突變體回補轉(zhuǎn)基因型(phr1-VvPHR1)擬南芥種子用75%乙醇消毒5 min，30% NaClO消毒2 min，75%乙醇消毒2 min，再用無菌蒸餾水洗滌5次，然后將種子鋪在1/2MS固體培養(yǎng)基上，置于4℃黑暗環(huán)境春化處理2天后，放于光照培養(yǎng)箱生長7天左右，將在1/2MS固體培養(yǎng)基上生長的擬南芥移至正常磷(1 mmol/L Pi)和低磷(1 μmol/L Pi)的MS固體培養(yǎng)基上生長30天，拍照記錄表型，取樣保存，用于后續(xù)試驗測定。全磷含量測定采用鉬銻抗比色法，無機(jī)磷含量測定參照郭貞慧[16]無機(jī)磷測定方法。

1.9 生物信息學(xué)分析及數(shù)據(jù)處理

利用 ProtParam 在線工具預(yù)測VvPHR1基因編碼蛋白的分子量、等電點、蛋白質(zhì)分子式和編碼氨基酸組成；利用TMHMM Server v.2.0在線對VvPHR蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，采用Netphos分析VvPHR蛋白的激酶磷酸化位點；利用SOPMA在線工具對VvPHR1蛋白進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)預(yù)測。使用MEGA-X軟件來構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，分析毛葉苕子和其他PHR基因家族成員之間的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系。用 Excel 2019 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)計算和圖表制作。用Origin 2022 進(jìn)行柱狀圖繪制。采用 SPSS 軟件進(jìn)行方差分析，采用 Duncan 氏新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較，不同字母表示 P<0.05，即差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 毛葉苕子PHR1基因的組織特異性表達(dá)分析

在毛葉苕子轉(zhuǎn)錄組中共篩選到13個磷酸鹽饑餓響應(yīng)因子 PHR (phosphate starvation response)基因，與擬南芥和苜蓿等PHR1序列相似性最高的是轉(zhuǎn)錄本129590、轉(zhuǎn)錄本96227和轉(zhuǎn)錄本120424，其中轉(zhuǎn)錄本120424在根系和地上部表達(dá)量均最高(表2)，且該基因在正常磷水平下表達(dá)量較低，而在低磷水平下表達(dá)量較高，在毛葉苕子測序的兩個品種的地上部和根部中均有體現(xiàn)(圖3)，該轉(zhuǎn)錄本可能是毛葉苕子磷饑餓響應(yīng)關(guān)鍵基因。

表2 磷饑餓響應(yīng)相關(guān)基因的篩選Table 2 Screening for phosphate starvation response related genes

2.2 VvPHR1基因的生物信息學(xué)分析

毛葉苕子轉(zhuǎn)錄本120424的cDNA序列全長1008 bp，編碼335個氨基酸(圖4)。依據(jù)生物信息學(xué)分析，推測該基因無跨膜結(jié)構(gòu)，可能定位于細(xì)胞核中，編碼蛋白的分子量為36.5 KD，等電點為6.04，存在54個激酶磷酸化位點，其中包括41個Serine(絲氨酸)、11 個 Threonine (蘇氨酸)和 2 個 Tyrosine(酪氨酸)位點；編碼蛋白的二級結(jié)構(gòu)含有20.90%的α-螺旋、70.15%的無規(guī)則卷曲、7.16%的延伸鏈和1.79%的β-轉(zhuǎn)角。用該轉(zhuǎn)錄本序列與擬南芥、水稻和玉米等植物PHR基因做系統(tǒng)進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)，該基因與蒺藜苜蓿和大豆的PHR1親緣關(guān)系較近(圖5)。基于生物信息學(xué)預(yù)測及系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，將毛葉苕子轉(zhuǎn)錄本120424命名為VvPHR1。

圖4 VvPHR1基因序列Fig. 4 Sequence of VvPHR1 gene

圖5 VvPHR1基因系統(tǒng)發(fā)育樹分析Fig. 5 Phylogenetic analysis of VvPHR1 gene

2.3 VvPHR1基因的轉(zhuǎn)錄自激活功能驗證

利用酵母單雜交系統(tǒng)驗證VvPHR1基因的轉(zhuǎn)錄自激活功能。結(jié)果顯示，帶有pGBKT7-VvPHR1融合載體的酵母菌在 SD/?Trp、SD/?Trp/?His 和SD/?Trp/?His/Ade的培養(yǎng)基上都能正常生長，并且能夠使X-α-gal染料顯示藍(lán)色，然而含有pGBKT7空載的酵母菌只能在SD/?Trp上生長(圖6)，上述結(jié)果表明VvPHR1在酵母細(xì)胞中具有轉(zhuǎn)錄激活活性。

圖6 VvPHR1基因的轉(zhuǎn)錄自激活驗證Fig. 6 Transcriptional activation of VvPHR1 gene

2.4 VvPHR1基因的亞細(xì)胞定位分析

將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入煙草細(xì)胞和水稻原生質(zhì)體中，在激光共聚焦顯微鏡下觀察。結(jié)果顯示，在煙草細(xì)胞中VvPHR1-GFP融合蛋白與藍(lán)色核標(biāo)記物融合為青色，共定位于細(xì)胞核中(圖7A)；在水稻原生質(zhì)體中，更清楚地看到VvPHR1-GFP融合蛋白在細(xì)胞核中發(fā)出綠色熒光的區(qū)域，與D53核定位Marker標(biāo)記為紅色的區(qū)域融合成了明顯的黃色(圖7B)，上述試驗結(jié)果表明毛葉苕子VvPHR1基因定位在細(xì)胞核中。

圖7 VvPHR1基因亞細(xì)胞定位Fig. 7 Subcellular localization of VvPHR1 gene

2.5 轉(zhuǎn)VvPHR1基因擬南芥中PHR、PHT基因表達(dá)特征

采用實時熒光定量PCR分析野生型(WT)和超表達(dá)型 (OEPHR1)擬南芥在 1 mmol/L Pi和 1 μmol/L Pi培養(yǎng)基處理30天后，VvPHR1、IPS1和磷轉(zhuǎn)運蛋白基因AtPHT1;1、AtPHT1;4、AtPHT1;8、AtPHT1;9的表達(dá)。結(jié)果顯示，野生型中未檢測到VvPHR1基因的表達(dá)，在OEPHR1擬南芥中，與正常磷處理相比，低磷處理下VvPHR1基因顯著上調(diào)表達(dá)(圖8A)。進(jìn)一步分析PHR1基因調(diào)控的下游磷轉(zhuǎn)運蛋白基因的表達(dá)情況，結(jié)果表明與野生型擬南芥相比，在低磷處理下，OEPHR1擬南芥中的低磷誘導(dǎo)基因IPS1表達(dá)沒有顯著差異，而磷轉(zhuǎn)運蛋白相關(guān)基因AtPHT1;1、AtPHT1;4、AtPHT1;8、AtPHT1;9 表達(dá)均顯著上升，其中AtPHT1;1磷轉(zhuǎn)運基因上調(diào)表達(dá)量最高 (圖 8B)。

圖8 轉(zhuǎn)基因擬南芥中VvPHR1及磷酸鹽轉(zhuǎn)運體的相對表達(dá)量Fig. 8 Relative expression of VvPHR1 and phosphate transporters in transgenic Arabidopsis thaliana

2.6 轉(zhuǎn)VvPHR1基因擬南芥的表型及磷含量分析

在正常磷培養(yǎng)基中，生長7天及30天的野生型(WT)與轉(zhuǎn)VvPHR1基因型(OEPHR1)，突變體(Atphr1)與突變體回補型(Atphr1-VvPHR1)擬南芥鮮重、主根長、全磷及無機(jī)磷含量無顯著差異(圖9a、c、e、g和圖10)。而在低磷培養(yǎng)基中，OEPHR1型擬南芥鮮重、主根長、全磷及無機(jī)磷含量較野生型(wild type, WT)型顯著增加 (圖 9b、f和圖 10)；Atphr1-VvPHR型擬南芥鮮重、主根長、全磷及無機(jī)磷含量較Atphr1型顯著增加(圖9d、h和圖10)，同時正常磷處理下WT和OEPHR1型擬南芥全磷含量和鮮重顯著高于Atphr1型和Atphr1-VvPHR1型。

圖9 不同磷處理下轉(zhuǎn)VvPHR1基因擬南芥的表型Fig. 9 The phenotype of VvPHR1 transgenic Arabidopsis thaliana under different Pi treatments

圖10 不同磷處理下轉(zhuǎn)VvPHR1基因擬南芥主根長、鮮重及磷含量Fig. 10 Main root length, fresh weight, and Pi content of VvPHR1 transgenic Arabidopsis thaliana under different Pi treatments

3 討論

植物PHR基因是響應(yīng)低磷環(huán)境的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子之一，在磷信號傳導(dǎo)中起著十分重要的作用。在擬南芥、水稻等模式植物研究發(fā)現(xiàn)，PHR基因家族形成一個調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，每個基因成員在調(diào)控缺磷信號和維持體內(nèi)磷穩(wěn)態(tài)中分別起著不同的作用[17–24]，其中PHR1是主要調(diào)控因子，在植物生長發(fā)育、響應(yīng)低磷環(huán)境和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等過程中發(fā)揮重要作用[14, 25–28]。在本研究中，毛葉苕子轉(zhuǎn)錄組中有13個PHR基因，轉(zhuǎn)錄本129590、96227、120424與擬南芥的PHR1相似度最高，其中轉(zhuǎn)錄本120424在低磷誘導(dǎo)下根系和地上部表達(dá)量均最高。該轉(zhuǎn)錄本cDNA全長1008 bp，編碼蛋白的二級結(jié)構(gòu)以α螺旋和無規(guī)則卷曲為主，且為不穩(wěn)定的非分泌蛋白，具有親水性，沒有信號肽和跨膜區(qū)域，其二級結(jié)構(gòu)與擬南芥、水稻PHR1基因編碼蛋白的結(jié)構(gòu)具有相似性[19]。同源比對分析發(fā)現(xiàn)毛葉苕子轉(zhuǎn)錄本120424與擬南芥的PHR1親緣關(guān)系較近，序列相似性93.7% (表2)。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明，該基因與蒺藜苜蓿和大豆的PHR1親緣關(guān)系較近(圖5)，基于生物信息學(xué)預(yù)測及系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，將毛葉苕子轉(zhuǎn)錄本120424命名為VvPHR1。

通常植物轉(zhuǎn)錄因子是定位在細(xì)胞核中，與下游目標(biāo)基因5' 端上游特定序列專一性結(jié)合，從而保證目的基因以特定的強(qiáng)度在特定的時間與空間表達(dá)[29–34]。本研究中，亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示毛葉苕子VvPHR1基因定位在細(xì)胞核中(圖7)，與擬南芥和水稻等模式植物PHR基因的亞細(xì)胞定位結(jié)果一致。PHR基因家族可以通過與下游目的基因啟動子上的P1BS序列相結(jié)合，進(jìn)而激活或抑制下游包括磷轉(zhuǎn)運蛋白基因(PHT)在內(nèi)的許多PSI基因的表達(dá)，從而提高植物抵抗低磷脅迫能力[35–36]。本研究中，酵母單雜試驗表明VvPHR1基因具有轉(zhuǎn)錄自激活活性(圖6)，與擬南芥和水稻等PHR1基因的特征相吻合[18–19]。實時熒光定量PCR結(jié)果顯示，與野生型相比，低磷脅迫下轉(zhuǎn)VvPHR1基因擬南芥中VvPHR1基因及其下游調(diào)控的磷轉(zhuǎn)運蛋白基因的表達(dá)量均顯著上調(diào)(圖8A和B)。上述結(jié)果表明從毛葉苕子克隆到的這個基因?qū)儆赑HR家族的一個轉(zhuǎn)錄因子[9, 37–38]，參與磷饑餓條件下的轉(zhuǎn)錄調(diào)控過程。

一直以來，植物PHR1基因是研究最多的響應(yīng)低磷脅迫應(yīng)答的調(diào)節(jié)因子，并被認(rèn)為是保持植物磷穩(wěn)態(tài)的主要轉(zhuǎn)錄因子之一。擬南芥的phr1突變體在低磷脅迫下表現(xiàn)為花青素積累缺失，葉片中磷含量降低，根/莖值減少等[39]。水稻中有2個擬南芥PHR1的同源基因OsPHR1和OsPHR2，這2個基因均定位于細(xì)胞核，通過調(diào)控Pi饑餓誘導(dǎo)基因的表達(dá)參與了磷饑餓信號通路。其中，OsPHR2過表達(dá)株系對低磷脅迫具有更高的敏感性，該基因能夠在缺磷的環(huán)境下促進(jìn)水稻根系伸長，根毛增多，使水稻磷酸鹽含量增加[10]。本研究中，在低磷處理下，OEPHR1型和突變體回補型擬南芥較野生型和突變體擬南芥的長勢略好，鮮重和主根長增加，且全磷和無機(jī)磷含量顯著高于野生型和突變體擬南芥(圖9和圖10)。同時發(fā)現(xiàn)，低磷情況下Atphr1-VvPHR1突變體回補型植株表現(xiàn)出更高的敏感性，其主根長較突變體增加的長度比轉(zhuǎn)VvPHR1基因型植株較野生型增加的長度更加明顯(圖9b、d、f和h)，這表明VvPHR1參與了Pi饑餓下植株根系構(gòu)型的改變，而轉(zhuǎn)VvPHR1基因型根系伸長不明顯可能是出現(xiàn)了PHR基因功能冗余的現(xiàn)象。上述結(jié)果表明毛葉苕子VvPHR1基因具有能夠在低磷脅迫下改變根系構(gòu)型、提高植物體內(nèi)磷含量的生物學(xué)功能。

4 結(jié)論

毛葉苕子VvPHR1基因定位在細(xì)胞核中且具有轉(zhuǎn)錄自激活活性，具有轉(zhuǎn)錄因子的功能特征，在低磷條件下，該基因與擬南芥AtPHR1基因有相似的功能，能夠促進(jìn)根系伸長和增加植株對磷的吸收，可能是植物體內(nèi)磷信號網(wǎng)絡(luò)中的重要調(diào)控因子。