酸快生芽孢桿菌‘HS3’培養(yǎng)條件的優(yōu)化及其在玉米花生間作體系中的促生效果

王中華，張輝紅，常瀘尹，郭 慷，張昊鑫，牛 兵，姜 瑛

（河南農業(yè)大學資源與環(huán)境學院，河南 鄭州 450002）

花生(Arachis hypogaea Linn.)是我國重要的油料作物和經濟作物，玉米(Zea mays L.)是集糧食、飼料和工業(yè)原料為一體的優(yōu)勢作物，花生與玉米生產在保障糧食安全以及提高家畜養(yǎng)殖的生產效率等方面具有重要的作用和前景[1–2]。在作物的栽培過程中，采取科學的間作套種等種植模式，有利于提高作物對自然資源的利用率、高產性和抗逆性[3–4]?；ㄉ衩组g作是河南省黃泛區(qū)一種常見的種植模式，兩者間作能夠增加作物生物多樣性，提高土地、光、水和養(yǎng)分等資源的利用能力[5–6]，在共生固氮系統(tǒng)作用下花生可以向玉米轉移氮素，進而緩解豆科作物生物固氮的“氮阻遏”作用，同時促進玉米對磷素的吸收，同樣玉米也可以改善花生的鐵鋅營養(yǎng)狀況[7–10]。常見的間作模式玉米∶花生∶玉米的行數(shù)為3∶8∶3[11–12]、2∶6∶2 和 2∶4∶2[13]。然而，在一塊田地里同時種植兩種作物的管理比單一作物更加復雜，不同的作物對土壤養(yǎng)分往往有著不同的需求，常規(guī)施肥下往往難以同時滿足兩種作物對養(yǎng)分的最適需求。同時，不合理的施肥反而會導致減產，也會對農田環(huán)境造成負面影響，引起農業(yè)面源污染[14]。我國人均資源偏低、自然災害嚴重，如何優(yōu)化這一模式，進而提高花生玉米產量和質量是亟待研究的問題。

植物根際促生菌 (plant growth-promoting rhizobacteria，PGPR)是指自由生活在土壤或附生于植物根系的一類可促進植物生長及其對礦質營養(yǎng)的吸收和利用，并能抑制有害微生物的有益菌類[15]。通常具有生物固氮、溶磷、解鉀、分泌吲哚乙酸(indole-3-acetic acid, IAA)、鐵載體等促生特性[16]。根際促生菌作為微生物肥料肥效均衡、綠色無污染，并且在土壤肥力的保持、生態(tài)系統(tǒng)平衡的維護上有重要作用。目前關于根際促生菌的篩選、鑒定及其作用機理也有較為深入的研究[17–19]。但有關根際促生菌在實際生產應用中的研究往往停留在實驗室或原生作物條件下，能夠有效定植在根際環(huán)境中并發(fā)揮優(yōu)異促生性能，同時兼具廣譜性的優(yōu)質微生物資源仍比較稀缺[20]。已有相關研究將根際促生菌應用在茴香(Foeniculum vulgare Mill.)/菜豆 (Phaseolus vulgaris Linn.)和大豆 [Glycine max (Linn.) Merr.]/玉米間作條件下，均取得了較好的應用效果[21–22]。然而在花生/玉米間作條件下的應用研究卻鮮有報道。當下針對間作環(huán)境下養(yǎng)分分配不均衡，化學肥料利用率低等問題，主要通過改善間作模式、施肥配比等手段來探究最佳土地當量比[23–24]。在花生玉米間作模式下施用根際促生菌能否提高土壤有效養(yǎng)分含量，同時對兩種作物產生促生作用，以達到化肥“減施增效”的目的，值得深入探討。

本研究從砂質潮土花生根際土中篩選一株具有產IAA能力，同時兼具溶有機磷、解鉀等多種促生功能的根際促生菌，并對其進行鑒定、培養(yǎng)條件優(yōu)化、花生盆栽促生試驗，并在玉米花生間作條件下研究該菌對土壤養(yǎng)分、花生和玉米產量、品質等指標的影響。以期獲得一株優(yōu)異微生物資源，同時為間作條件下根際促生菌的應用開拓新的視野，提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試土壤

試驗所用土樣取自河南省鄭州市農業(yè)農村部華北小麥–玉米輪作營養(yǎng)與施肥科學觀測試驗站。選取幾株長勢良好的花生，采集根系附近土樣，取樣深度為0—20 cm，去除石塊、枯枝落葉等雜質，過2 mm篩，分裝為兩份：一份用于多功能促生菌的篩選，另一份用于土壤基礎理化性質的測定，均在4℃下儲存。土壤基本性狀如下：有機碳1.91 g/kg、全磷0.29 g/kg、有效磷 3.44 mg/kg、全鉀 19.56 g/kg、速效鉀 20.42 mg/kg、pH 7.39。

1.2 培養(yǎng)基

LB液體培養(yǎng)基：蛋白胨10.00 g，酵母提取物5.00 g，氯化鈉 10.00 g，蒸餾水 1000 mL，pH 7.00～7.20，115℃ 滅菌 30 min。

LB固體培養(yǎng)基：LB液體培養(yǎng)基的基礎上加瓊脂20.00 g/L，其它條件同上。

蒙金娜培養(yǎng)基：葡萄糖10.00 g，硫酸銨0.50 g，七水硫酸鎂 0.30 g，氯化鈉 0.30 g，氯化鉀 0.30 g，硫酸亞鐵0.03 g，一水硫酸錳0.03 g，蒸餾水1000 mL，115℃ 滅菌 30 min。

有機磷培養(yǎng)基：在蒙金娜培養(yǎng)基的基礎上加酵母膏 0.40 g，卵磷脂 0.20 g。

解鉀液體培養(yǎng)基：蔗糖10.00 g，酵母膏0.50 g，硫酸銨 1.00 g，磷酸氫二鈉 2.00 g，七水硫酸鎂 0.50 g，碳酸鈣 1.00 g，鉀長石粉 1.00 g，蒸餾水 1000 mL，115℃ 滅菌 30 min。

無機鹽培養(yǎng)基：葡萄糖10.00 g，硫酸銨2.00 g，磷酸二氫鈉0.50 g，磷酸氫二鉀0.50 g，七水硫酸鎂 0.20 g，二水氯化鈣 0.10 g，蒸餾水 1000 mL，pH 7.00，115℃ 滅菌 30 min。

1.3 多功能促生菌的篩選及功能鑒定

1.3.1 菌株的分離純化 將l0.00 g供試土壤加入裝有90 mL無菌水并帶有玻璃珠的250 mL錐形瓶中，于30℃條件下150 r/min振蕩20 min，取出后靜置10 min，得到濃度為0.1 g/mL土壤菌懸液。對此菌懸液依次進行稀釋，得到濃度為 10?2、10?3、10?4、10?5、10?6g/mL 的菌懸液。分別吸取 100 μL 稀釋梯度為 10?4、10?5、10?6g/mL 的菌懸液均勻涂于 LB 固體培養(yǎng)基上，30℃恒溫倒置培養(yǎng)24 h，挑取不同類型典型單個菌落，經平板純化后，編號，4℃保存。1.3.2 菌株分泌IAA能力的測定 將分離純化后的細菌調節(jié)至OD600(表征細菌的生長情況)為1的菌懸液，按1% (V/V)接種量，接種于含有L-色氨酸 (100 mg/L)的LB液體培養(yǎng)基，于30℃、180 r/min條件下培養(yǎng) 24 h。

1)定性測定[25]：取50 μL菌懸液滴于白色陶瓷板上，同時加 50 μL Salkowski比色液 (50 mL 35% HClO4+1 mL 0.5 mol/L FeCl3)。加入 50 μL 50 mg/L 的吲哚乙酸比色液作為陽性對照。白色陶瓷板于室溫避光放置30 min后觀察，顏色變紅者表示能夠分泌IAA。

2)定量測定[26]：對初篩測出的具有分泌IAA能力的細菌進行定量測定。將10 mL菌懸液在10000 r/min條件下離心10 min，取2.5 mL上清液備用。采用分析純IAA配置濃度依次為0、10、20、30、40、50、60 μg/mL的IAA標準溶液。按1∶1的體積比與Salkowski比色液混合，室溫避光靜置30 min，測定OD530(以不接菌的液體培養(yǎng)基與Salkowski比色液的1∶1混合溶液為空白對照)。以IAA的濃度為橫坐標，OD530為縱坐標繪圖，即得IAA標準曲線，根據(jù)標準曲線計算各待測液IAA濃度。

1.3.3 菌株溶磷解鉀能力的測定 將調節(jié)至OD600為1的供試菌懸液，按1% (V/V)接種量分別接種于盛有50 mL有機磷液體培養(yǎng)基和盛有50 mL解鉀液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶，30℃，180 r/min培養(yǎng)72 h 后，各取培養(yǎng)液 10 mL，6000 r/min 離心 20 min，用鉬藍比色法測定有機磷培養(yǎng)基上清液中可溶磷含量[27]，用火焰分光光度法測定解鉀液體培養(yǎng)基上清液中所解鉀含量[28]。

1.4 多功能促生菌的鑒定

1.4.1 形態(tài)學鑒定 將篩選得到的多功能促生菌采用劃線法接種到LB固體培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)24 h，觀察其單菌落的大小、形狀、顏色、光滑度、透明度等。將菌株進行革蘭氏染色后在顯微鏡下觀察其菌體形態(tài)[29]。將菌株接入液體培養(yǎng)基，37℃條件下180 r/min振蕩培養(yǎng)12 h，用冷凍干燥法制成電鏡樣品，進行電鏡(日立S-3400N)掃描觀察[30]。

1.4.2 生理生化指標鑒定 革蘭氏染色、好氧性、接觸酶、甲基紅(M.R)、二乙酰(V-P)、淀粉水解、明膠水解、硝酸鹽還原、檸檬酸鹽利用等試驗方法均參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[29]。

1.4.3 16S rDNA分子學鑒定 將菌株培養(yǎng)至對數(shù)生長期，離心收集菌體，采用SDS-CTAB法提取總 DNA[31]，采用 16S rDNA 通用引物 27f (5'?AGAGTTTGATCCTGGCTCAG?3')和 1492r(5'?GGTTACCTTGTTACGACTT?3')對 16S rDNA 進行PCR擴增。PCR產物在1%的瓊脂糖凝膠電泳定量，由北京美億美生物技術有限公司進行測序，根據(jù)獲得的16S rDNA序列在GenBank中Blast搜索同源序列，通過MEGA 7.0軟件，以鄰接法(Neighbor?Joining)構建系統(tǒng)發(fā)育樹，分子序列提交GenBank，獲得登錄號。

1.5 菌株促生條件優(yōu)化

按照表1對含有L-色氨酸的無機鹽培養(yǎng)基中的溫度、培養(yǎng)時間、初始pH、裝液量、碳源、氮源進行調節(jié)，將OD600為1的菌懸液按1% (V/V)的接種量接種，30℃，180 r/min培養(yǎng)24 h后，測定其生長情況(OD600值)，并按定量測定的方法測定培養(yǎng)基中IAA含量。

表1 菌株生長及產IAA能力條件優(yōu)化Table 1 Optimized conditions for HS3 strain growth and IAA production capacity

在單因素試驗的基礎上，選擇菌株生長的最佳溫度，最佳培養(yǎng)時間，分別選取初始pH、裝液量、碳源、氮源4因素中菌株生長最優(yōu)的3個水平，采用L9(34)正交表設置正交試驗，將OD600為1的菌懸液按1% (V/V)的接種量接種，分別探究影響菌株產IAA、溶有機磷、解鉀的最優(yōu)條件組合。

1.6 盆栽試驗

花生盆栽試驗于河南農業(yè)大學(鄭州)進行，采集自然條件下砂質潮土0—20 cm土層的新鮮土壤，過 5 mm 篩，每盆裝土 700 g?；ㄉ?(豫花 9719)種子進行20%雙氧水表面消毒20 min，無菌水沖洗多次，保持25℃，濕度90%，催芽2天，選取發(fā)芽一致的幼苗移植到土壤之中。將菌懸液4000 r/min離心10 min，去除上清液，用無菌水重懸，反復離心重懸3次，將菌株制成1011CFU/mL的菌水劑，以108CFU/g的接種量接種至土壤，以接種滅菌菌水劑為對照處理，每個處理4個重復，調節(jié)含水量至田間持水量的60%[32]。每天澆無菌水以保持土壤含水量。30天后，采集土壤樣品用高效液相色譜(HPLC)法測定IAA含量[33]，鉬藍比色法測定有效磷含量，火焰分光光度法測定速效鉀含量。采集植株樣品測定相對葉綠素含量 (soil and plant analyzer develotrnent，SPAD)值、鮮重、株高、植株全氮磷鉀含量[34]。用根系掃描儀(LA1600+ scanner，Canada)掃描獲得根系圖像后，用根系分析軟件(Winrhizo2003b，Canada)進行相關根系指標分析。

1.7 田間試驗

大田試驗于河南省鄭州市農業(yè)農村部華北小麥玉米輪作營養(yǎng)與施肥科學觀測試驗站進行，將供試菌株用無菌水反復離心重懸3次，以滅菌骨粉為載體，將菌水劑制成有效活菌數(shù)為1011CFU/g的微生物菌劑。玉米供試品種為‘豫單9953’，花生供試品種為‘豫花9719’，玉米花生以2∶4∶2模式間作，玉米行間距為40 cm，花生行間距為30 cm，花生玉米間距為60 cm。試驗設置10個小區(qū)，小區(qū)面積為50 m2，施用 N 15%、P2O515%、K2O 15% 的復合肥作基肥，施用量650 kg/hm2，不追肥。微生物菌劑撒施，每個小區(qū)施用量為40.0 kg/hm2，對照處理為滅活的以滅菌骨粉為載體的微生物菌劑，每個處理5個重復，隨機區(qū)組排列。于收獲期采用5點取樣法，分別采集玉米側和花生側0—20 cm土壤樣品，混合后備用，測定土壤pH、IAA、有效氮、有效磷、速效鉀含量；玉米、花生均取2 m雙行，測定生物產量，各小區(qū)均取花生5株，測定單株飽果數(shù)、單株秕果數(shù)、單株飽果重、單株秕果重；取玉米3株測定穗長、穗粗、穗行數(shù)、行粒數(shù)、百粒重、單穗重、穗禿頂長。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

本試驗中所得數(shù)據(jù)采用 Microsoft Office 2016、SPSS 23.0進行相關分析統(tǒng)計，采用Origin 2017和Metabo Analyst作圖，單因素方差分析采用LSD法檢驗處理間的差異顯著性(P<0.05為差異顯著)，相關性采用Pearson相關性分析。

2 結果與分析

2.1 多功能促生菌的篩選

通過對根際土壤中細菌的分離與篩選，獲得一株命名為HS3的菌株，將其以OD600為1的菌懸液按1% (V/V)接種，培養(yǎng)24 h后，其產IAA能力達到45.82 mg/L；將其以OD600為1的菌懸液按1%(V/V)接種，培養(yǎng)72 h后，溶有機磷能力達到2.86 mg/L，解鉀能力達到19.88 mg/L。

2.2 促生菌形態(tài)及生理生化特性鑒定

通過平板劃線法獲得HS3單菌落，可見HS3菌落小暗色，扁平，表面干燥，不光滑，不透明，邊緣光滑(圖1A)。革蘭氏染色后在顯微鏡下觀察，菌體呈桿狀，革蘭氏染色呈陽性(圖1B)。菌體大小為(1.23～2.57) μm×(0.50～0.65) μm (圖 1C)。生理生化指標測定顯示該菌株為兼性厭氧菌，除接觸酶試驗為陰性，其他均為陽性(表2)。

表2 HS3菌株的生理生化特性Table 2 Physiological and biochemical characteristics of HS3 strain

圖1 菌株HS3的菌落圖(A)，革蘭氏染色圖(B)及電鏡圖(C)Fig. 1 Colony diagram (A), gram staining diagram (B) and electron microscope diagram (C) of HS3 strain

根據(jù)16S rDNA的測序結果和GenBank中已登錄的核苷酸序列進行同源性比較，發(fā)現(xiàn)菌株HS3與Bacillus acidiceler CBD 119 (DQ374637)同源性達到99%，運用N-J方法構建HS3的16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)。結合菌株形態(tài)與生理生化特征，鑒定菌株HS3為酸快生芽孢桿菌(Bacillus acidiceler)，將其序列上傳至NCBI，獲得登錄號KP743120。

圖2 HS3菌株16S rDNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 2 Phylogenetic tree of 16S rDNA gene sequence of HS3 strain

2.3 不同培養(yǎng)條件對菌株促生能力的影響

不同培養(yǎng)條件對HS3生長和產IAA能力的單因素試驗結果表明，在30℃、接種時間為32 h、初始pH為6、裝液量在100 mL/250 mL、碳源為果糖、氮源為酵母粉條件下，HS3生長和產IAA能力均達到最大(圖3)。

圖3 不同培養(yǎng)條件下HS3菌株的產IAA能力和生長狀況(OD600)Fig. 3 The IAA production capacity and growth status (OD600) of HS3 strain under different cultural conditions

基于HS3生長的單因素試驗結果，分別選擇pH(6、7、8)，裝液量 (75、100、150 mL/250 mL)，碳源(果糖、蔗糖、葡萄糖)，氮源(酵母粉、尿素、蛋白胨)對HS3的不同促生功能進行正交試驗。極差R值比對結果表明，各因素對菌株HS3產IAA、溶有機磷、解鉀能力影響大小依次分別為碳源>pH>氮源>裝液量、pH>碳源>氮源>裝液量、碳源>pH>裝液量>氮源。綜合4個因素的均值(k值)和直觀分析比較，HS3產IAA、解鉀的最佳條件組合為pH=6、裝液量100 mL/250 mL、果糖、酵母粉，溶有機磷的最佳條件組合為pH=6、裝液量100 mL/250 mL、蔗糖、尿素(表3)。

表3 菌株促生能力培養(yǎng)條件正交試驗結果Table 3 The results of the orthogonal test on the culture conditions of the growth-promoting ability of HS3 strain

2.4 接種多功能促生菌對花生盆栽試驗促生效果的影響

在接種HS3菌株30天后，接菌處理長勢明顯優(yōu)于對照處理(圖4A)。與對照處理相比，土壤IAA含量增加80.95%，土壤速效磷含量增加14.24%，土壤速效鉀含量增加70.59% (表4)。與對照相比，花生鮮重、株高、SPAD、全氮、全磷、全鉀分別顯著增加45.06%、15.28%、7.87%、24.73%、95.32%、32.78% (圖4B)?；ㄉL、根表面積、根體積、根尖數(shù)、根分枝數(shù)分別顯著增加61.88%、46.65%、75.00%、100.89%、52.25%，根平均直徑增加6.15%(圖 4C)。

表4 接種菌株HS3培養(yǎng)30天后土壤IAA及有效磷、速效鉀含量 (mg/kg)Table 4 Soil IAA and available P and K contents after 30 days of inoculating HS3 strain

圖4 接種HS3對花生幼苗生長和養(yǎng)分含量的影響Fig. 4 Effects of HS3 inoculation on the growth and nutrient content of peanut seedlings

2.5 花生幼苗及土壤中各指標之間的主成分分析、熱圖分析、相關矩陣以及隨機森林分析

主成分分析結果顯示，PC1和PC2在幼苗和土壤指標的整體變異中分別占了91.7%和6.4%(圖5A)；CK和HS3處理顯著分離(圖5B)；PC1和PC2顯著影響了根分枝數(shù)、根表面積、植株全鉀、根平均直徑、總根長、植株氮(圖5C)。隨機森林(圖5D)分析結果表明，對于土壤營養(yǎng)指標，平均精度下降值由大到小依次為速效鉀、有效磷、IAA；對于地下部指標，平均精度下降值由大到小依次為根尖數(shù)、根體積、總根長、根平均直徑、根表面積、根分支數(shù)；對于地上部指標平均精度下降值由大到小依次為植株鉀、植株氮、株高、鮮重、SPAD值和植株磷。

圖5 花生盆栽土壤及花生各指標變化的主成分分析 (A、B、C) 和隨機森林圖 (D)Fig. 5 Principal component analysis (A, B, C) and random forest map (D) of potted peanut soil and peanut indexes under HS3 treatment

相關性分析結果(表5)表明，土壤中IAA含量與根長、根體積、根尖數(shù)、鮮重、株高、SPDA、植株氮、植株磷、植株鉀呈顯著正相關。土壤中速效磷濃度與根體積、株高、SPAD、植株氮、植株磷呈極顯著正相關，與根長、植株鉀呈顯著正相關；土壤中速效鉀濃度與根長、根體積、根尖數(shù)、鮮重、SPAD、植株氮、植株磷、植株鉀呈極顯著正相關，與根表面積、株高呈顯著正相關。

表5 花生生長指標與土壤IAA和有效態(tài)磷鉀含量的相關性(r）Table 5 Correlation of peanut plant indexes with soil IAA and available P and K contents

2.6 促生菌田間試驗的促生效果

相比于不接種供試菌對照，施用菌劑花生土壤IAA、有效氮、有效磷、速效鉀含量分別顯著提高49.06%、22.64%、24.01%、52.89% (圖 6A)?；ㄉ鷨沃觑豕麛?shù)和單株秕果重分別顯著下降了54.26%和47.90%，增產率達到9.87% (圖6B)。土壤IAA含量和有效氮與花生產量呈極顯著正相關，有效磷和速效鉀與花生產量呈顯著正相關(表6)。

圖6 田間土壤接種HS3菌劑與對照處理的花生側土壤(A)和花生產量(B)比較Fig. 6 Comparison of soil and peanut yield between HS3 inoculation and the control

與對照相比，施用HS3菌劑使玉米土壤IAA、有效磷、速效鉀含量分別顯著提高67.83%、22.94%、14.17%，土壤有效氮提高了3.37%，但差異不顯著(圖7A)。玉米穗長、行粒數(shù)、單穗重分別顯著增加7.87%、23.49%、9.38%，穗禿頂長下降27.30%，增產率達到18.56% (圖7B)。土壤IAA、有效磷和速效鉀與玉米產量呈極顯著正相關(表6)。

圖7 田間土壤接種HS3菌劑與對照處理的玉米側土壤(A)和玉米產量(B)比較Fig. 7 Comparison of soil and maize yield between HS3 inoculation and the control

表6 大田試驗土壤養(yǎng)分及花生玉米產量指標變化相關性Table 6 Correlation of soil nutrients and yield indexes of peanut and maize under field trail

3 討論

植物根際作為一個特殊區(qū)域，是植物、微生物和土壤相互之間作用最為密切的區(qū)域，其中根際微生物扮演著重要的角色，是土壤肥力形成和持續(xù)發(fā)展的關鍵動力，對植物的生長有著重要的影響[35–36]。本研究在花生根際所篩選得到的酸快生芽孢桿菌HS3同時兼具產IAA、溶磷、解鉀能力，并且能同時在花生盆栽以及花生玉米間作大田應用中改善土壤養(yǎng)分環(huán)境，促進植株生長，表現(xiàn)出優(yōu)異的生產價值及廣譜性。目前針對酸快生芽孢桿菌在農業(yè)生產中的研究較少，且主要集中在其生防作用上[37–38]，針對其促生作用的研究也只是停留在單一作物溫室環(huán)境下[39]。本研究所篩選得到的菌株在間作這種更為復雜應用環(huán)境中，對兩種作物均表現(xiàn)出優(yōu)異的促生作用，而目前大多數(shù)研究篩選出的菌種只停留在寄主植物和實驗室條件下，在田間實際生產中往往難以達到試驗預期[16]，本研究與之相比更具優(yōu)越性。

IAA作為對植物生長影響最重要的激素之一，低濃度外源IAA可以誘導植株初生根的生長，高濃度的IAA可以誘導側根和不定根的生長。這有利于提高植株根系與土壤的接觸面積，改善根際環(huán)境，進而促進根系對養(yǎng)分的吸收利用。提高植物生長量[40–41]。Araújo 等[39]發(fā)現(xiàn)一株分離自辣椒果實的酸快生芽孢桿菌具有溶磷、分泌蛋白、固氮能力，但并未表現(xiàn)出產IAA能力，與之相比本研究所篩選得到的菌株HS3具有產IAA能力以及解鉀能力。在盆栽試驗中，在接種HS3的情況下，土壤中IAA含量顯著提高了80.95%，同時花生的根變得更長、更粗且有更多的分枝。張東艷等[42]在花生根際篩選到一株產IAA菌特基拉芽孢桿菌(Bacillus tequilensis)，在對花生的盆栽促生試驗中顯著提高了土壤中IAA含量，并且對根系的生長、發(fā)育具有顯著的促生作用，與本研究結果相符。相關性分析結果表明，土壤IAA含量與根長、根體積、根尖數(shù)呈顯著正相關，說明多功能促生菌HS3在施入土壤后可有效提高土壤中IAA含量，進一步促進花生根系的生長發(fā)育，提高其對養(yǎng)分的吸收利用。

磷、鉀元素作為植株生長必需的營養(yǎng)元素，磷是形成細胞核蛋白、卵磷脂等不可缺少的元素，能加速細胞分裂，促使根系和地上部加快生長；鉀元素的營養(yǎng)功效可以提高光合作用的強度，促進作物體內淀粉和糖的形成，增強作物的抗逆性和抗病能力，還能提高作物對氮的吸收利用[43]。除了產激素能力外，根際促生菌的溶磷能力和解鉀能力可以將土壤中植株難以吸收的固定態(tài)磷、固定態(tài)鉀轉化為植株易于吸收的可溶態(tài)磷和可溶態(tài)鉀[44]，提高土壤中養(yǎng)分的利用率，減少化學肥料不合理施用。姜瑛等[45]將一株貪噬菌屬(Variovorax sp.)接種在花生盆栽之中，其溶磷能力將土壤中有效磷含量提升了18.41%。

鄭文波等[46]在江西紅壤花生地中篩選到一株多功能促生菌巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)，在花生盆栽試驗中有效促進了花生根系的生長。本研究在花生盆栽中接種多功能促生菌酸快生芽孢桿菌，使土壤中有效磷和速效鉀含量分別提高了14.24%和70.59%。同時HS3對花生根表面積、根體積和根尖數(shù)的影響效果更優(yōu)，對根系生長的促進又進一步提高了根系對養(yǎng)分的吸收利用，使花生鮮重、株高、全氮、全磷、全鉀含量分別增加45.06%、15.28%、24.73%、95.32%、32.78%，有效促進了花生的生長發(fā)育，對后期花生的長勢以及產量的提高具有較為積極的影響。

花生玉米間作是河南省黃泛區(qū)平原常見的一種種植方式，與連續(xù)單作系統(tǒng)相比，間作系統(tǒng)在更大程度上提高了生物多樣性，提高養(yǎng)分利用效率、土壤固碳能力和土地利用效率，并降低了病原體的感染，可以更加有效利用農田空間環(huán)境資源[47–49]。但這并不意味著可以避免化學肥料的過量施用，并且在單一地塊上同時對兩種作物施用配比合適的化學肥料反而是困難的。在傳統(tǒng)的間作實踐中，過多施肥和過度灌溉導致作物產量下降和環(huán)境惡化仍舊是十分常見的問題[24]。由根際促生菌制成的綠色可持續(xù)的生物肥料在現(xiàn)代農業(yè)生產中的應用，可以減少化學肥料的施用，提高養(yǎng)分利用率，這也更符合我國綠色農業(yè)化肥“減施增效”的發(fā)展趨勢。在間作條件下應用根際促生菌必然要滿足菌株對兩種作物同時產生促生效能。目前已有相關研究表明，根際促生菌在非寄主作物條件下也能發(fā)揮作用。王歡等[50]從茶樹根際篩選得到的彎曲芽孢桿菌(Bacillus flexus)GD12應用在白菜、空心菜、莧菜同樣也能表現(xiàn)出促生作用。李永斌等[51]在玉米、番茄、黃瓜等根際土壤中篩選到3株根際促生菌，在小麥大田應用中也可以有效提高小麥產量。不過這項研究依舊停留在單一地塊、單一作物、單一菌種的情況下。本研究在間作條件下探究HS3在實際應用中的效果，同時針對兩種作物，在施用菌劑HS3的情況下，土壤速效養(yǎng)分含量以及花生玉米的產量均得到顯著提升，花生單株秕果數(shù)顯著下降，玉米穗禿頂長顯著下降，在一定程度上改善了花生玉米的品質。該菌株使玉米產量提高了18.56%，花生產量提升9.87%，對非寄主生物玉米也表現(xiàn)出了優(yōu)異的促生效果，也證明了該菌株在應用生產中的廣譜性。Rezaei-Chiyaneh等[21]在茴香和菜豆間作條件下施用固氮(Azotobacter vinelandii + Rhizobium phaseoli)溶磷(Pseudomonas putida + Pantoea agglomerans)解鉀 (Pseudomonas koreensis + P. vancouverensis)混合菌劑，使菜豆和茴香的種子產量分別提高了5.0%和2.86%，香精油EO的產量增加39.3%，提升了兩種作物的生產率和質量特性。表明根際促生菌具有在間作環(huán)境下改善土壤養(yǎng)分狀況，提高作物產量，改善作物品質的潛力和能力。相關研究表明在間作條件下不同作物根系間的影響更加復雜密切，花生玉米間作比單一種植的根系能產生更多的側根，同時玉米和花生具有明顯的根系空間分布差異，在有效降低對養(yǎng)分資源競爭的同時，花生的固氮作用還可以促進玉米對氮素的利用[52–53]。二者間作根系在土層之中的分布更加廣泛，為根際微生物提供更加立體豐富的生存空間，能夠提高土壤生物群落多樣性，促進根際微生物的多樣性[54]，無疑也為外源根際促生菌在間作環(huán)境下根系的定植及應用提供了更有利的環(huán)境。

有關植物根際促生菌篩選應用的報道已有很多，本研究將目光聚集在花生玉米間作這一應用環(huán)境下，針對化肥的“減施增效”這一生產問題，在花生根際分離篩選出的酸快生芽孢桿菌HS3，兼具多種促生功能于一身，在花生盆栽和花生玉米間作試驗中對不同的作物均表現(xiàn)出了優(yōu)異的促生性能。為微生物菌劑在花生玉米間作的應用提供了理論依據(jù)的同時也提供了一株優(yōu)質微生物資源。也有相關研究表明酸快生芽孢桿菌具有生防功能[38]。菌株HS3是否具有分泌蛋白等促生能力以及生防功能，在實際生產中針對其它作物間作，如大豆/玉米，以及在輪作狀況下，對小麥是否也有較好的促生效果，同樣值得進一步探究。

4 結論

本研究篩選的一株酸快生芽孢桿菌‘HS3’具有較好的產IAA、溶有機磷、解鉀能力。其產IAA和最大解鉀能力的培養(yǎng)條件為：30℃、接種時間32 h，pH 6、裝液量 100 mL/250 mL、果糖、酵母粉，實現(xiàn)最大溶有機磷能力的培養(yǎng)條件為pH 6、裝液量100 mL/250 mL、蔗糖、尿素。土壤接種‘HS3’可顯著提高速效磷、速效鉀、IAA含量。土壤IAA含量、有效磷和速效鉀含量的增加是其提高花生和玉米產量及產量構成因素的主要原因。