糧食霉變和芽變快速檢測方法分析

張 艷，王 偉，喬澎波

（中儲(chǔ)糧河南質(zhì)量檢測中心有限公司，河南鄭州 450000）

糧食霉變和芽變檢測在糧食存儲(chǔ)和調(diào)運(yùn)管理中應(yīng)用頻繁，現(xiàn)行的霉變粒檢測法可實(shí)現(xiàn)糧食霉變快速檢測，但該方法對(duì)霉變初期發(fā)展階段的檢測效果較差?，F(xiàn)行的糧食芽變檢測方法為化學(xué)滴定法，其缺點(diǎn)為操作煩瑣、效率低下。因此，開發(fā)出快速、穩(wěn)定、可靠的糧食霉變和芽變檢測方法具有重要的現(xiàn)實(shí)意義，酶活性檢測原理為實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)創(chuàng)造了有利的條件，應(yīng)對(duì)其開展研究。

1 糧食霉變快速檢測方法

1.1 糧食霉變的快速檢測原理

糧食霉變主要由真菌引起，快速檢測的依據(jù)為霉菌產(chǎn)生的過氧化氫酶，該檢測原理具有間接性，不能判斷霉菌種類，但能夠有效反映糧食霉變的嚴(yán)重程度，在霉變發(fā)展的各個(gè)階段均能發(fā)揮作用。檢測設(shè)備為酶活性檢測儀，耗時(shí)約為30 min，符合快速檢測的要求[1]。

1.2 制備糧食籽粒外部洗滌液

糧食籽粒外部洗滌液對(duì)霉變檢測效果影響突出，在制備洗滌液時(shí)應(yīng)評(píng)估洗滌溶劑、洗滌轉(zhuǎn)速、洗滌時(shí)間以及糧食浸泡時(shí)間對(duì)過氧化氫酶活性的影響程度。分別針對(duì)以上4個(gè)影響因素開展實(shí)驗(yàn)探究。在洗滌轉(zhuǎn)速實(shí)驗(yàn)中，將轉(zhuǎn)速從0逐漸提升至2 500 r·min-1，同時(shí)檢測小麥樣品籽粒洗滌液中的過氧化氫酶活性，發(fā)現(xiàn)酶活性隨轉(zhuǎn)速先升高，后基本保持不變，在2 300 r·min-1時(shí)接近峰值960 U/100 g，故將其作為最佳轉(zhuǎn)速。蒸餾水對(duì)輕微霉變的糧食具有更強(qiáng)的洗滌效果，故選用蒸餾水。在糧食浸泡時(shí)間方面，為避免過度浸泡導(dǎo)致籽粒易破損，對(duì)比不同浸泡時(shí)長下的籽粒硬度，選擇20 min浸泡處理時(shí)長。綜合以上實(shí)驗(yàn)，最佳操作標(biāo)準(zhǔn)如表1。

表1 高速攪拌法制備糧食籽粒外部洗滌液的最佳操作標(biāo)準(zhǔn)

1.3 糧食霉變快速檢測技術(shù)應(yīng)用效果分析

1.3.1 霉變程度檢測的靈敏度分析

（1）制取不同霉變程度的糧食水。將糧食破碎后加入少量無菌水，形成糧食水，再吸取適量糧食水進(jìn)行霉變培養(yǎng)。培養(yǎng)箱溫度設(shè)定為30 ℃，隨著時(shí)間的延長，糧食水中的霉菌數(shù)量和過氧化氫酶含量不斷增加，從而得到不同霉變程度的糧食水。

（2）霉變檢測靈敏度對(duì)比。運(yùn)用快速檢測法和平板計(jì)數(shù)法在不同時(shí)間點(diǎn)檢測霉變的糧食水，重點(diǎn)觀察過氧化氫酶活性和霉菌的數(shù)量，將不同時(shí)間點(diǎn)的檢測結(jié)果繪制成曲線，如圖1所示。過氧化氫酶活性在0～3 d內(nèi)有所提升，但提升幅度較小。第6 d的檢測結(jié)果顯示酶活性顯著增強(qiáng)，第6～15 d小幅增強(qiáng)，但整體趨于穩(wěn)定。霉菌的數(shù)量在0～6 d內(nèi)小幅增加，在6～9 d內(nèi)發(fā)展速度最快，隨后增長速度有所放緩，但依然維持在較高的水平[2]。使用酶活性檢測儀檢測過氧化氫酶的活性，霉菌數(shù)量檢測運(yùn)用平板計(jì)數(shù)法。

圖1 糧食霉變快速檢測技術(shù)對(duì)不同霉變程度的檢測結(jié)果圖

1.3.2 霉變程度檢測的穩(wěn)定性分析

（1）試驗(yàn)方案。選取3種糧食籽粒樣品，其霉變程度分別為輕微霉變（樣品1）、中度霉變（樣品2）、重度霉變（樣品3）。通過平板計(jì)數(shù)法檢測3種樣品的霉菌數(shù)量，運(yùn)用快速檢測法分別對(duì)這3類樣品各自開展8次過氧化氫酶活性檢測，并求得平均值，結(jié)果如表2所示。

表2 快速檢測技術(shù)對(duì)糧食霉變程度檢測的穩(wěn)定性分析數(shù)據(jù)

（2）試驗(yàn)結(jié)果分析。①過氧化氫酶活性與霉菌數(shù)量呈正相關(guān)，換言之，酶活性越高，霉菌數(shù)量也越多。②同種樣品多次檢測的結(jié)果較為穩(wěn)定，未出現(xiàn)嚴(yán)重偏離預(yù)期的異常數(shù)據(jù)，說明快速檢測法對(duì)糧食霉變嚴(yán)重程度的檢測效果具有穩(wěn)定性。以樣品2的檢測數(shù)據(jù)為例（表3），8次檢測的過氧化氫酶活性均在300 U/100 g左右。在理論研究中利用相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差（RSD）評(píng)價(jià)多次重復(fù)測定的離散程度，如果RSD值小于15%，說明檢測結(jié)果的可信度較高[3]。3種樣品8次檢測結(jié)果的RSD值分別為5.35%（樣品1）、3.21%（樣品2）、5.99%（樣品3），均低于15%，再次印證了快速檢測法的可靠性和穩(wěn)定性。

表3 樣品2過氧化氫酶8次檢測結(jié)果統(tǒng)計(jì)表

2 糧食芽變快速檢測方法

2.1 制備糧食籽粒勻漿提取液

2.1.1 糧食籽粒勻漿提取液的制備方法

過氧化氫酶在芽變糧食籽粒內(nèi)部，需通過破碎和離心操作制取籽粒勻漿，在籽粒勻漿內(nèi)存在一定濃度的過氧化氫酶。

2.1.2 糧食籽粒勻漿制備的影響因素控制

（1）破碎程度對(duì)勻漿制取效果的影響分析。糧食籽粒的破碎程度在一定程度上影響了勻漿中過氧化氫酶的含量，根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，籽粒破碎程度較高時(shí)，勻漿中過氧化氫酶的含量通常也更高[4]。分別選取3種攪拌轉(zhuǎn)速，轉(zhuǎn)速1為4 500～9 500 r·min-1，轉(zhuǎn)速2為9 500～16 000 r·min-1，轉(zhuǎn)速 3 為 16 000 ～ 20 000 r·min-1。檢測對(duì)應(yīng)的過氧化氫酶活性，轉(zhuǎn)速1對(duì)應(yīng)的酶活性為150 U/100 g，轉(zhuǎn)速2對(duì)應(yīng)的酶活性172 U/100 g，當(dāng)轉(zhuǎn)速大于18 500 r·min-1后，酶活性增加值不再明顯，因此，將最佳轉(zhuǎn)速確定為18 500 r·min-1，該轉(zhuǎn)速下可達(dá)到最佳破碎程度。

（2）溫度對(duì)勻漿制取效果的分析。溫度對(duì)過氧化氫酶的活性影響較大，高速攪拌機(jī)破碎糧食籽粒的過程中會(huì)因摩擦產(chǎn)生一定的熱量，進(jìn)而導(dǎo)致糧食籽粒勻漿升溫，影響酶活性。試驗(yàn)中需將勻漿溫度控制在30 ℃以內(nèi)，防止機(jī)器產(chǎn)生的熱量破壞酶活性。因此，將初始水溫設(shè)定為5 ℃，同時(shí)在攪拌混合物中加入適量冰塊，實(shí)施降溫。

（3）離心操作對(duì)勻漿制取效果的分析。離心過程涉及兩個(gè)關(guān)鍵參數(shù)，分別是離心機(jī)轉(zhuǎn)速和離心操作時(shí)長。通過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)離心機(jī)轉(zhuǎn)速為4 500 r·min-1時(shí)，過氧化氫酶的活性達(dá)到峰值，繼續(xù)增加轉(zhuǎn)速幾乎不能再提高酶活性，因此最佳離心轉(zhuǎn)速確定為4 500 r·min-1。以 18 500 r·min-1破碎糧食籽粒，以 4 500 r·min-1做離心處理，檢測不同離心時(shí)長下的過氧化氫酶活性，發(fā)現(xiàn)離心操作的最佳時(shí)長為2 min。

2.2 糧食芽變快速檢測實(shí)踐

2.2.1 快速檢測法對(duì)不同糧食品種的適應(yīng)性分析

選取眾信麥998、鄭麥136和百農(nóng)307作為試驗(yàn)對(duì)象，在適宜溫度下進(jìn)行發(fā)芽培養(yǎng)，以相同的時(shí)間點(diǎn)檢測樣品中過氧化氫酶的活性，繪制3種試驗(yàn)對(duì)象在芽變狀態(tài)下的酶活性曲線（圖2）。經(jīng)過初始檢測，3種小麥未芽變時(shí)的過氧化氫酶活性分別為（301±5）U·g-1、（150±5）U·g-1、（85±5）U·g-1。芽變監(jiān)測時(shí)長為48 h，每6 h檢測一次酶活性。3種糧食籽粒芽變后的酶活性曲線均呈增長趨勢，眾信麥998的酶活性在0～12 h內(nèi)小幅增長，鄭麥136和百農(nóng)307在這一時(shí)段內(nèi)的酶活性增幅低于眾信麥998。芽變12 h后，3種小麥樣本的酶活性均顯著提升，且增速較為平穩(wěn)，3條曲線的走向基本保持一致,說明快速檢測法能夠滿足不同糧食品種的芽變檢測需求。

圖2 不同糧食過氧化氫酶活性對(duì)發(fā)芽時(shí)間的檢測曲線

2.2.2 檢測糧食的不同芽變階段

糧食的芽變過程可人為地劃分為多個(gè)階段，包括初始階段、體積膨脹階段、籽粒破裂階段以及出芽階段，不同階段的酶活性水平存在差異，需借助試驗(yàn)判斷快速檢測法對(duì)不同芽變階段的檢測效果。分別對(duì)粳米、秈米、小麥進(jìn)行檢測，獲取過氧化氫酶和α-淀粉酶的活性指標(biāo)，后者的檢測方法為3,5-二硝基水楊酸滴定法[5]。將同一品種的酶活性數(shù)據(jù)繪制在坐標(biāo)系中。例如，圖3為小麥品種矮抗58對(duì)應(yīng)的酶活性折線圖。結(jié)果顯示，小麥的過氧化氫酶活性從芽變的初始階段即開始增加，直到發(fā)芽期，酶活性始終保持較快的增長，粳米和秈米也呈現(xiàn)出類似的特點(diǎn)。3種糧食α-淀粉酶活性的增長區(qū)間有所差異，但總體都晚于過氧化氫酶。說明利用過氧化氫酶檢測芽變的靈敏度更高。

圖3 小麥矮抗58芽變過程中的酶活性檢測

3 結(jié)語

糧食霉變和芽變的快速檢測方法在原理上基本相同，霉變糧食和芽變糧食內(nèi)存在高于正常水平的過氧化氫酶。利用高速攪拌機(jī)處理糧食，分別制備霉變糧食的籽粒洗滌液和芽變糧食的勻漿提取液，再使用酶活性檢測儀獲取過氧化氫酶活性數(shù)據(jù)，與正常值進(jìn)行對(duì)比。快速檢測法的整體耗時(shí)約為30 min，其檢測精度、可靠度、靈敏度以及穩(wěn)定性均能滿足要求。在不同品種的糧食檢測中也能表現(xiàn)出良好的適應(yīng)性。