近視發(fā)生發(fā)展過程中視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞內(nèi)分子作用機制的研究進展

賈仕玉，劉 勤,，張娜娜，錢美伶，楊 君

0 引言

近視作為目前世界范圍內(nèi)最為常見的人類眼部疾病之一，嚴(yán)重威脅患者的視力及生活質(zhì)量。流行病學(xué)研究顯示，至2030年預(yù)計全球近視人口數(shù)目將達到33.61億，約占全球總?cè)丝跀?shù)的39.9%[1-2]，而到了2050年，全球近視人口數(shù)目預(yù)計達到47.58億人，約占據(jù)全球人口數(shù)目的49.8%[3]。近視會引起患者發(fā)生視網(wǎng)膜脫落、脈絡(luò)膜新生血管以及黃斑萎縮等并發(fā)癥的發(fā)生，甚至導(dǎo)致患者出現(xiàn)不可逆性的視力喪失[4]。因此，明確近視的發(fā)生機制并從根本上抑制近視的發(fā)生發(fā)展是目前研究的熱點。視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelium, RPE)是位于視網(wǎng)膜光感受器細(xì)胞和脈絡(luò)膜血液供應(yīng)之間的有絲分裂細(xì)胞，主要起了維持視網(wǎng)膜穩(wěn)態(tài)的重要作用。研究表明，在近視患者的RPE細(xì)胞層中存在著RPE細(xì)胞的丟失，同時單個RPE細(xì)胞的面積較正常人眼中所含RPE細(xì)胞的面積明顯增大[5]。而RPE細(xì)胞在近視過程中的病理變化是一個復(fù)雜的過程，它受到細(xì)胞內(nèi)多種信號的調(diào)控。本文主要通過對近視發(fā)生發(fā)展過程中RPE細(xì)胞的分子調(diào)控機制進行歸納總結(jié)，從而為探究近視發(fā)病過程中的具體分子機制提供有效參考。

1近視發(fā)生過程中RPE細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)的變化

1.1mTOR信號通路雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)作為高分子量絲氨酸-蘇氨酸激酶、磷酸肌醇3-激酶相關(guān)激酶的家族成員之一，其包含特征性的羧基激酶同源區(qū)[6]。mTOR的主要功能為控制細(xì)胞的生長、活性與功能改變、細(xì)胞周期變化、DNA損傷的檢查以及端粒的重組與修復(fù)[7]。Rohrer等[8]通過建立RPE線粒體缺陷小鼠模型，發(fā)現(xiàn)小鼠RPE細(xì)胞內(nèi)氧化磷酸化被明顯抑制，而RPE細(xì)胞內(nèi)mTOR信號通路也同時被激活。Wu等[9]通過建立單眼形覺剝奪性近視小鼠模型，從單眼形覺剝奪和對側(cè)眼正常的小鼠模型的鞏膜中分離出93個單細(xì)胞，并對他們進行轉(zhuǎn)錄組的分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)差異表達基因明顯聚集于mTOR信號和心血管系統(tǒng)中的缺氧信號通路，這些信號通路均在缺氧中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，這提示缺氧相關(guān)的信號通路可能在形覺剝奪的眼中被激活。通過在形覺剝奪性近視小鼠結(jié)膜下注射mTOR信號通路特異性抑制劑后，發(fā)現(xiàn)小鼠近視程度明顯加重，具體表現(xiàn)為小鼠的眼軸延長加快，屈光度增大。這一研究結(jié)果顯示，RPE細(xì)胞損傷可能通過mTOR信號通路介導(dǎo)近視的發(fā)生發(fā)展。同時，為了明確mTOR信號通路在近視形成過程中的具體作用機制，Li等[10]通過胰島素處理RPE后發(fā)現(xiàn)，胰島素處理后RPE細(xì)胞內(nèi)mTOR信號通路被明顯激活，而RPE內(nèi)生長因子、MMP-2的表達水平也明顯提高，電鏡下觀察到RPE細(xì)胞內(nèi)可見內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張以及泡沫化，提示RPE細(xì)胞變性明顯。而加入了mTOR通路抑制劑后，生長因子的表達、細(xì)胞活性也相應(yīng)的降低。RPE的自噬與其自身的細(xì)胞活性與功能變化有著密切聯(lián)系，自噬是一種機體內(nèi)吞噬自身細(xì)胞質(zhì)蛋白或細(xì)胞器并使其包被進入囊泡，并與溶酶體融合形成自噬溶酶體，降解其所包裹的內(nèi)容物的過程，在維持細(xì)胞功能活性以及穩(wěn)定性方面發(fā)揮著重要的作用。研究顯示，細(xì)胞可以通過自噬機制消除損傷的蛋白質(zhì)分子或者細(xì)胞器，從而確保維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)。Feng等通過高糖誘導(dǎo)RPE細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，RPE細(xì)胞炎癥反應(yīng)明顯提升，凋亡事件的發(fā)生情況也明顯增加[11]。而通過調(diào)控細(xì)胞自噬后RPE細(xì)胞的炎癥得到明顯控制，細(xì)胞活性也得以恢復(fù)。Chang等[12]通過過氧化氫處理人RPE細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)氧化細(xì)胞死亡事件明顯提升，通過減弱氧化誘導(dǎo)的過度磷酸化細(xì)胞的活性，提升細(xì)胞自噬能力后，得以恢復(fù)細(xì)胞mTOR通路的水平，上調(diào)血紅素加氧酶-1的表達，對過氧化氫誘導(dǎo)的氧化細(xì)胞死亡發(fā)揮細(xì)胞保護作用。以上研究均表明，RPE細(xì)胞的功能活性與細(xì)胞自噬密切相關(guān)。而mTOR信號通路可能是調(diào)控RPE細(xì)胞活性及功能變化的主要信號通路。Go等[13]通過在RPE細(xì)胞內(nèi)敲除mTOR上游轉(zhuǎn)錄抑制因子(tuberous sclerosis 1, TSC1)的表達后顯示，mTOR的活性明顯提升，細(xì)胞內(nèi)糖代謝和脂肪代謝能力明顯提升。因此，mTOR也可能通過調(diào)控RPE的細(xì)胞代謝水平從而引起RPE細(xì)胞功能的改變。

1.2多巴胺信號通路以往的研究顯示，在形覺剝奪性近視動物模型中，視網(wǎng)膜多巴胺(dopamine, DA)的含量明顯減少，而通過對近視動物局部注射多巴胺受體激動劑后，動物的近視進展程度被明顯抑制[14-15]。因此說明多巴胺在近視發(fā)病過程中起著重要的調(diào)控作用。

多巴胺主要通過D1和D2兩個受體家族發(fā)揮其作用效果[16]。D1受體主要位于雙極細(xì)胞、水平細(xì)胞、神經(jīng)節(jié)細(xì)胞內(nèi)。D2受體主要位于視網(wǎng)膜感光細(xì)胞、RPE細(xì)胞內(nèi)。D1受體的作用效應(yīng)為激活腺苷酸環(huán)化酶(adenylate cyclase, AC)，繼而增加第二信使磷腺苷酸(cyclic adenosine monophosphate, cAMP)的含量；而D2受體的作用效果與D1受體相反，D2受體可以抑制AC的活性，減少cAMP的含量[17-18]。既往研究顯示，多巴胺受體激動劑主要通過激活D2受體從而實現(xiàn)其對于近視進展程度的抑制作用。而由于D2受體主要位于視網(wǎng)膜感光細(xì)胞、RPE細(xì)胞內(nèi)，因此RPE細(xì)胞就成為了多巴胺靶向作用位點之一[19]。Seko等[20]通過在有/無RPE細(xì)胞共培養(yǎng)的條件下分別培養(yǎng)鞏膜軟骨細(xì)胞，并于細(xì)胞環(huán)境下添加多巴胺非選擇性受體激動劑(apomorphine, APO)。結(jié)果顯示，當(dāng)存在RPE細(xì)胞共培養(yǎng)時，APO顯著抑制了鞏膜軟骨細(xì)胞的生長、增殖；而當(dāng)無APO共培養(yǎng)時，APO對于鞏膜軟骨細(xì)胞的增殖、生長能力無明顯抑制作用。以上結(jié)果表明，APO主要通過調(diào)控RPE細(xì)胞內(nèi)多巴胺的合成、分泌、釋放，從而調(diào)節(jié)鞏膜軟骨細(xì)胞的生長、增殖。

1.3乙酰膽堿信號通路在近視的發(fā)生發(fā)展過程中，RPE細(xì)胞可以分泌多種細(xì)胞因子、蛋白如轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor beta, TGF-β)，TGF-β由RPE細(xì)胞分泌并作用于鞏膜組織，促進鞏膜成纖維細(xì)胞的增生以及膠原的產(chǎn)生，最終導(dǎo)致鞏膜重塑，進一步促進了近視的發(fā)展[21-22]。

研究發(fā)現(xiàn)低濃度阿托品可以有效地緩解近視進展[23]。阿托品作為乙酰膽堿M受體拮抗劑，主要通過與內(nèi)源性乙酰膽堿競爭性受體結(jié)合，從而抑制乙酰膽堿的釋放。乙酰膽堿作為中樞和外周神經(jīng)常見的遞質(zhì)之一，與近視的形成密切相關(guān)[24]。乙酰膽堿受體分為代謝型毒蕈堿乙酰膽堿受體(M型受體)和離子型煙堿乙酰膽堿受體(N型受體)。Shang等[25]通過反轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶鏈鎖反應(yīng)(reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR)技術(shù)檢測人RPE細(xì)胞內(nèi)M受體mRNA的表達情況，同時通過免疫組化檢測細(xì)胞內(nèi)M受體蛋白的表達情況，結(jié)果顯示人RPE細(xì)胞內(nèi)存在M受體。研究通過于小雞近視動物模型玻璃體內(nèi)以及球結(jié)膜下注射乙酰膽堿受體拮抗劑阿托品后發(fā)現(xiàn)近視的進程被明顯抑制[26]。上述研究均提示，在近視的發(fā)生發(fā)展過程中，乙酰膽堿可能通過促進RPE細(xì)胞分泌TGF-β等蛋白因子的分泌、釋放，促進鞏膜成纖維細(xì)胞增生以及膠原生成，引起鞏膜重塑，最終導(dǎo)致了近視病程的進展。

1.4γ-氨基丁酸信號通路He等[27]通過對近視小鼠RPE細(xì)胞進行單細(xì)胞測序后發(fā)現(xiàn)，近視小鼠的γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid, GABA)相關(guān)通道蛋白的表達量明顯降低，提示近視過程中GABA受體可能也存在相應(yīng)的調(diào)控作用。研究顯示，由于近視的發(fā)生發(fā)展，鞏膜細(xì)胞外基質(zhì)蛋白多糖發(fā)生重構(gòu)，使得鞏膜GABA的合成減少，最終導(dǎo)致了近視的加重[28]。

目前研究顯示GABA受體主要位于鞏膜成纖維細(xì)胞、軟骨細(xì)胞以及RPE細(xì)胞內(nèi)，而局部注射GABA后可以直接與鞏膜成纖維細(xì)胞相互作用，改變細(xì)胞內(nèi)DNA含量，從而對鞏膜的生長、增殖產(chǎn)生相應(yīng)的影響[29]。而在動物實驗中也顯示局部應(yīng)用GABA受體拮抗劑后近視的程度明顯加重[30]。上述實驗結(jié)果顯示，GABA信號通路可能在近視的病程進展中也起到了一定的調(diào)控作用。Platzl等[31]通過細(xì)胞實驗顯示在近視發(fā)生發(fā)展過程中，通過RPE介導(dǎo)GABA對于鞏膜的刺激作用后發(fā)現(xiàn)鞏膜細(xì)胞內(nèi)糖胺多糖(glycosaminoglycan, GAG)含量明顯增加，提示我們GABA可能通過RPE細(xì)胞對鞏膜成纖維細(xì)胞發(fā)揮作用。當(dāng)鞏膜成纖維細(xì)胞與RPE細(xì)胞共培養(yǎng)時，GABA對鞏膜的刺激作用效果明顯提升[32]。上述研究結(jié)果表明，GABA可能通過RPE細(xì)胞調(diào)控鞏膜成纖維細(xì)胞的增殖、分泌，從而引起細(xì)胞外基質(zhì)的重構(gòu)，最終導(dǎo)致了近視病程的發(fā)生發(fā)展。

1.5全反視黃酸通路研究顯示，全反視黃酸(all-trans retinoic acid, ATRA)的表達情況與近視的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。Mertz[33]通過用ATRA喂養(yǎng)豚鼠后發(fā)現(xiàn)，小鼠眼軸明顯增加，近視程度明顯加重。張未娟等[34]于培養(yǎng)基中加入40×10-6mol/L的ATRA后培養(yǎng)RPE細(xì)胞，結(jié)果顯示RPE細(xì)胞的增殖能力受到了明顯的抑制作用。而加入10×10-6mol/L ATRA后，RPE細(xì)胞分泌的TGF-β含量也明顯增加。有關(guān)形覺剝奪性近視模型的研究發(fā)現(xiàn)，在近視模型的眼球后壁中，TGF-β和視黃酸及其受體的含量都可因近視的發(fā)生發(fā)展而改變。TGF-β作為重要的近視因子，可通過刺激鞏膜成纖維細(xì)胞的增殖、分泌，從而導(dǎo)致鞏膜細(xì)胞外基質(zhì)的重構(gòu)，最終促進了近視的發(fā)生發(fā)展[35]。Zhang等[36]通過進一步分析不同濃度、不同作用時間下ATRA對于RPE細(xì)胞的作用效果，結(jié)果顯示ATRA作用于RPE細(xì)胞后，RPE細(xì)胞內(nèi)TGF-β的表達和分泌呈劑量依賴式和時間依賴式增加。而在抑制了磷脂酶C信號通路后，TGF-β的分泌量明顯降低。上述研究結(jié)果表明，在近視的發(fā)生過程中，ATRA可能通過刺激RPE細(xì)胞分泌TGF-β，從而促進鞏膜成纖維細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的重構(gòu)，最終導(dǎo)致了近視的加速。

2 近視發(fā)生過程中RPE細(xì)胞內(nèi)microRNA的變化

2.1microRNA-328 microRNA-328作為細(xì)胞內(nèi)源性微小RNA，其成熟產(chǎn)物主要由約23個核苷酸組成，主要通過與蛋白質(zhì)編碼基因的mRNA相互配對從而抑制mRNA的翻譯進程，最終實現(xiàn)其自身的翻譯調(diào)控作用[37-38]。Chen等[39]在細(xì)胞實驗中證實，ATRA可以通過提升RPE細(xì)胞內(nèi)microRNA-328的增加從而抑制細(xì)胞內(nèi)PAX6(paired-box gene 6, PAX6)的表達。PAX6基因作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)以及眼球發(fā)育過程中的重要基因，在視網(wǎng)膜分化誘導(dǎo)過程中起著重要作用[40]。Edita等通過對112例近視患者(34例中度近視、8例重度近視以及70例健康成年人)進行全血采樣檢測，結(jié)果顯示隨著microRNA-328表達量的增加，RPE細(xì)胞的光密度明顯降低[41]。以上結(jié)果均顯示，microRNA-328可能在近視發(fā)生發(fā)展過程中起到了主要的調(diào)控作用。

2.2microRNA-29a microRNA-29家族主要由microRNA-29a、microRNA-29b、microRNA-29c三個亞家族組成，其中microRNA-29a作為ECM所產(chǎn)生的調(diào)節(jié)劑，可通過經(jīng)典的RNA沉默機制對細(xì)胞內(nèi)的信號傳導(dǎo)產(chǎn)生影響，從而發(fā)揮其作用效果[42]。在調(diào)節(jié)眼球生長的過程中，鞏膜ECM的重塑可導(dǎo)致眼軸長度及屈光狀態(tài)發(fā)生變化。Chen等[43]通過在RPE細(xì)胞內(nèi)分別沉默/過表達microRNA-29a后發(fā)現(xiàn)，沉默microRNA-29a后MMP-2蛋白的表達明顯上調(diào)，細(xì)胞增殖能力也明顯好轉(zhuǎn)。Martins等[44]提出脈絡(luò)膜新生血管形成過程中，其機制可能是RPE細(xì)胞中信號傳導(dǎo)通路的活動增強，從而抑制了microRNA-29a的表達，此過程會導(dǎo)致MMP-2蛋白水平的上調(diào)從而有利于新生血管形成。這進一步為本研究探討microRNA-29a對RPE細(xì)胞分泌MMP-2的調(diào)控作用提供理論依據(jù)。Emily等發(fā)現(xiàn)在中國高度近視人群存在microRNA-29a中rs157907A/G的基因多態(tài)性現(xiàn)象[45]。因此，microRNA-29a可能通過調(diào)控細(xì)胞內(nèi)MMP-2蛋白的表達從而調(diào)控RPE細(xì)胞的功能變化，最終導(dǎo)致近視的發(fā)生發(fā)展。RPE細(xì)胞分泌MMP-2的變化從而引起ECM含量的改變，可能是視網(wǎng)膜正常功能出現(xiàn)病理變化的核心環(huán)節(jié)。RPE細(xì)胞內(nèi)MMP蛋白表達失衡是近視發(fā)生發(fā)展的主要病理變化。曾愛萍等[46]通過用TGF-β刺激人RPE細(xì)胞后，MMP-2表達明顯提升，引起MMP-2/1比例失衡，最終引起RPE細(xì)胞功能障礙。Yuan等[47]通過上調(diào)RPE細(xì)胞內(nèi)MMP-2的表達后發(fā)現(xiàn)，RPE細(xì)胞的上調(diào)可以促進RPE ECM的重塑，進一步削弱RPE細(xì)胞之間的鏈接。上述研究顯示，MMP-2含量是近視發(fā)生過程中的重要分子機制，而microRNA-29a可以通過調(diào)控細(xì)胞內(nèi)MMP-2的表達進一步調(diào)控近視的發(fā)生發(fā)展。

3 小結(jié)

通過對既往研究的歸納總結(jié)，本研究發(fā)現(xiàn)RPE細(xì)胞內(nèi)復(fù)雜的信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)與近視的發(fā)生發(fā)展都具有密不可分的聯(lián)系。mTOR主要通過調(diào)控RPE的代謝水平從而調(diào)控近視的發(fā)生發(fā)展；RPE細(xì)胞合成、分泌DA增加后主要通過調(diào)節(jié)鞏膜軟骨細(xì)胞增殖調(diào)控近視病程；乙酰膽堿可以促進RPE分泌TGF-β從而引起鞏膜重塑，最終調(diào)控近視病程發(fā)展；而GABA和ATRA可以通過RPE促進鞏膜成纖維細(xì)胞的功能活性最終調(diào)控近視病程進展。同時，RPE內(nèi)microRNA的差異表達變化與近視的發(fā)生發(fā)展也密切相關(guān)。microRNA-328可以通過抑制RPE細(xì)胞內(nèi)PAX6的表達從而抑制視網(wǎng)膜的誘導(dǎo)分化，最終促進近視的病程發(fā)展；而microRNA-29a可以通過調(diào)控RPE細(xì)胞內(nèi)MMP-2的表達實現(xiàn)對于RPE ECM分泌的調(diào)控，最終實現(xiàn)對于近視的調(diào)控。本項綜述通過總結(jié)既往RPE在近視中的分子機制研究，為后期基于RPE細(xì)胞有效防控近視提供充足的參考依據(jù)。