非洲豬瘟疫苗研究進(jìn)展

鄧 昊，王 濤，趙建軍*

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，黑龍江 大慶 163319；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所，黑龍江 哈爾濱）

非洲豬瘟（African swine fever, ASF）是一種急性、高度傳染性和致死性疫病。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（World Organization for Animal Health,OIE）規(guī)定ASF 為必須上報(bào)的動(dòng)物疫病，被我國(guó)列為一類動(dòng)物傳染病[1]。1921 年，肯尼亞首次發(fā)現(xiàn)ASFV，其之后在非洲持續(xù)流行，最終影響多達(dá)35 個(gè)非洲國(guó)家。20 世紀(jì)50 年代末到80 年代初，ASFV 在歐洲、俄羅斯、加勒比海和南美洲相繼出現(xiàn)[2]。2018 年8 月，ASFV 首次傳入我國(guó)遼寧省沈陽(yáng)市[3]。ASFV 是非洲豬瘟相關(guān)病毒科（Asfarviridae）的唯一成員，含有囊膜包裹的二十面體結(jié)構(gòu)，是一種脫氧核糖核酸病毒，也是唯一已知的蟲媒DNA 病毒[4]。病毒粒子具有5 層結(jié)構(gòu)，從外向內(nèi)依次為囊膜、衣殼、內(nèi)膜、核心殼和基因組[5]，基因組全長(zhǎng)170~194 kb，編碼150~200 種病毒蛋白，包括68 種結(jié)構(gòu)蛋白和100多種非結(jié)構(gòu)蛋白[1]。

近一個(gè)世紀(jì)以來(lái)，盡管科研人員通過(guò)多種途徑創(chuàng)制ASF 疫苗，但研究表明，滅活疫苗不能提供免疫保護(hù)，亞單位疫苗、活載體疫苗和DNA疫苗只能提供部分的免疫保護(hù)。而減毒活疫苗（Live-attenuated vaccines, LAVs）中的基因缺失疫苗是目前最有效的方案，越南通過(guò)該途徑，在近日宣布成為世界首位發(fā)布ASF 商品化疫苗（ ASFV-G-?I177L 為 疫 苗 株） 的 國(guó) 家（https://en.vietnamplus.vn），說(shuō)明基因缺失疫苗有望成為“黑暗里的曙光”。

1 滅活疫苗

滅活疫苗主要通過(guò)物理（紫外線、高溫、低溫、高壓等）、化學(xué)（苯酚、福爾馬林、乙烯亞胺、焦碳酸二乙酯等）或兩者相結(jié)合的方式使病原體失活。由于其生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單且安全，被廣泛應(yīng)用于疾病防控[6]。Cadenas-Fernández E 等[7]將滅活的ASFV 與新型佐劑（MF59?、Silica oil、mGNE、MontanideTMISA201）進(jìn)行配伍，對(duì)豬采用皮內(nèi)和肌肉同時(shí)注射高劑量（6×109HAD50）的滅活疫苗，接種后豬群健康狀況正常。不幸的是，經(jīng)強(qiáng)毒攻毒后，均出現(xiàn)與ASF 相似的臨床癥狀，并發(fā)現(xiàn)存在疫苗接種豬臨床反應(yīng)滯后，因此，關(guān)于滅活疫苗抗體依賴性增強(qiáng)效應(yīng)（ADE）的推測(cè)[8]，還有待進(jìn)一步驗(yàn)證。ASF 滅活疫苗不能提供保護(hù)性免疫，這可能與滅活疫苗誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答有關(guān)。同時(shí)，也可能與ASFV 不同的感染性顆粒有關(guān)。

2 減毒活疫苗

2.1 自然弱毒疫苗株

篩選自然弱毒株是創(chuàng)制疫苗過(guò)程中常用的方法，其廣泛應(yīng)用于動(dòng)物傳染病的預(yù)防。Gallardo C 等[9]在2017 年從野豬體內(nèi)分離得到non-HAD特性的自然弱毒株（Lv17/WB/Rie1），免疫后，部分豬呈現(xiàn)亞臨床癥狀，低病毒血癥等。之后免疫豬與病毒感染豬同群飼養(yǎng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，疫苗接種豬無(wú)一例死亡。自然弱毒疫苗在誘發(fā)免疫保護(hù)的同時(shí)，也會(huì)使部分豬出現(xiàn)非特異性的反應(yīng)，包括瘀點(diǎn)、壞死灶、關(guān)節(jié)腫脹和肺炎等[10]。因此，解決自然弱毒疫苗的殘余毒力，是未來(lái)急需解決的問(wèn)題。

2.2 細(xì)胞傳代培養(yǎng)弱毒疫苗株

上個(gè)世紀(jì)60 年代至90 年代，ASF 在西班牙和葡萄牙流行期間，研究人員成功分離ASFV 野毒株，經(jīng)細(xì)胞傳代培養(yǎng)后，其致病性減弱[10]。最近，研究學(xué)者將ASFV-G-?I177L 疫苗株[11]經(jīng)細(xì)胞傳代后，獲得其衍生毒株（ASFV-G-?I177L/?LVR）。動(dòng)物感染實(shí)驗(yàn)表明，ASFV-G-?I177L/?LVR 和ASFV-G-?I177L 一樣對(duì)豬只無(wú)致病性，并具有免疫原性和保護(hù)作用[12]。雖然細(xì)胞傳代致弱ASFV 是一種可行的方法，同時(shí)早期ASFV 弱毒株的研制主要通過(guò)細(xì)胞傳代，如 BA71v，E75CV1 等，但增加傳代次數(shù)會(huì)導(dǎo)致ASFV 免疫原性降低，難以提供對(duì)親本毒株的攻毒保護(hù)，因而很難找到準(zhǔn)確的傳代次數(shù)進(jìn)行后續(xù)動(dòng)物試驗(yàn)，具有一定的盲目性和隨機(jī)性[13]。因此，就目前而言，采用細(xì)胞傳代技術(shù)創(chuàng)制ASF 弱毒疫苗不是最理想的方式。

2.3 基因缺失弱毒疫苗株

相比于自然篩選和細(xì)胞傳代技術(shù)，目前最前沿和最主要的方法是采用反向遺傳操作，將親本強(qiáng)毒株毒力相關(guān)基因敲除，制備弱毒疫苗株（表1）。最新基因缺失活疫苗研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)基因Ⅱ型同源強(qiáng)毒株（HLJ/18、ASFV-G、SY18）的攻毒保護(hù)能達(dá)到100 %[11,14-17]，而對(duì)基因Ⅰ型同源弱毒株（BA71?CD2）和強(qiáng)毒株（Congo-a）卻無(wú)法提供保護(hù)作用[18-19]。我國(guó)學(xué)者合成的HLJ/18-7GD（缺失7 個(gè)毒力相關(guān)基因）疫苗株對(duì)商品豬，妊娠母豬都能提供較強(qiáng)的保護(hù)作用，疫苗持續(xù)周期長(zhǎng)，能保障商品豬順利出欄，且不會(huì)造成母豬流產(chǎn)以及影響仔豬的生長(zhǎng)發(fā)育[17]，是目前最有潛力的ASF 疫苗。Borca M V 等[11]利用反向遺傳操作技術(shù)，敲除ASFV（ASFV-G 株）I177L 基因，從而構(gòu)建的ASFV-G-?I177L 弱毒株對(duì)親代ASFV 攻毒具有良好的保護(hù)作用。經(jīng)抗體檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，口鼻接種或肌肉接種產(chǎn)生的由IgG1、IgG2和IgM 介導(dǎo)的特異性抗體反應(yīng)并沒(méi)有差異。然而ASFV-G-?I177L 和HLJ/18-7GD 并未涉及異源強(qiáng)毒株的攻毒實(shí)驗(yàn)，因此，上述疫苗株是否具有交叉保護(hù)作用還需要進(jìn)行臨床實(shí)驗(yàn)評(píng)估。Koltsova G 等[19]將Congo-a（一種適應(yīng)細(xì)胞培養(yǎng)的衍生毒株）缺失 CD2v（EP402R）基因所構(gòu)建的?CongoCD2v 弱毒株，對(duì)豬群進(jìn)行疫苗接種實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，所有豬群經(jīng)Congo-v 強(qiáng)毒株攻毒后，無(wú)一幸存。相反，用Congo-a 免疫豬群后，以同樣的方法進(jìn)行攻毒實(shí)驗(yàn)，豬群存活率為100 %。研究人員推斷CD2v 是一種能誘發(fā)機(jī)體對(duì)同源毒株產(chǎn)生免疫保護(hù)的重要抗原[19]?；谝陨涎芯勘砻?，疫苗的交叉保護(hù)性和病毒關(guān)鍵毒力基因的鑒定是決定著基因缺失活疫苗發(fā)展的關(guān)鍵因素，值得深入研究。

表1 基于親本ASF 毒株基因缺失活疫苗的最新研究進(jìn)展

3 基因工程疫苗

3.1 亞單位疫苗和活載體疫苗

ASF 亞單位疫苗的研發(fā)主要集中于ASFV 保護(hù)性抗原或抗原表位[20]。Lopera-Madrid J 等[21]首次在HEK 細(xì)胞中表達(dá)p72、p54 和p12 蛋白，進(jìn)行初次免疫和加強(qiáng)免疫。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，豬血清中含有特異性的抗體。接著用改良痘病毒（MVA）表達(dá)的B646L，EP153R 和EP402R 蛋白進(jìn)行初次免疫和加強(qiáng)免疫，以及用MVA 表達(dá)的蛋白進(jìn)行初免，HEK 細(xì)胞表達(dá)的蛋白進(jìn)行加強(qiáng)免疫，兩種方法均在血清中檢測(cè)到特異性的抗體，且混合免疫的豬產(chǎn)生了特異性的T 細(xì)胞。上述研究停留在免疫應(yīng)答，缺乏ASFV 強(qiáng)毒株的攻毒實(shí)驗(yàn)。亞單位疫苗同滅活疫苗一樣，具有很高的安全性，但缺少對(duì)ASFV 保護(hù)性抗原的認(rèn)知，以及如何誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫保護(hù)的機(jī)制尚未闡明，從而制約了ASF 亞單位疫苗的發(fā)展。

活載體疫苗是將目的基因克隆到病毒基因組中，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)目的蛋白的表達(dá)。相應(yīng)的表達(dá)載體有腺病毒和改良痘病毒（MVA）等。Goatley L C 等[22]將B602L、B646L、CP204L、E183L、E199L、EP153R、F317L 和MGF505-5R 基因克隆到腺病毒載體上，并進(jìn)行初次免疫，同樣的基因亞克隆到MVA 載體作為加強(qiáng)免疫。首次免疫59d 后進(jìn)行攻毒實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，免疫豬群的存活率為100 %。為了探究那種抗原能夠誘導(dǎo)豬產(chǎn)生有效的細(xì)胞免疫，研究人員利用ELIspot 從133 種ASFV 蛋白中篩選出18 種蛋白，分別將其基因克隆到腺病毒和MVA，并進(jìn)行免疫實(shí)驗(yàn)。研究表明，表達(dá)上述蛋白的病毒載體并不能使豬免受ASFV 強(qiáng)毒株的攻擊[23]。ASFV 保護(hù)性抗原的鑒定是活載體疫苗成功的關(guān)鍵之一。同時(shí)，深入探究病毒抗原之間的相互作用，有利于發(fā)現(xiàn)新的免疫策略。

3.2 DNA 疫苗

DNA 疫苗是將病原體的基因片段克隆到表達(dá)載體上，通過(guò)在機(jī)體內(nèi)表達(dá)目的蛋白，從而達(dá)到免疫的效果。目前較多的研究表明，DNA 疫苗能夠引起豬強(qiáng)烈的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞（Cytotoxic T lymphocyte, CTL）應(yīng)答[23-24]。近期，國(guó)外學(xué)者將ASFV 的M488R 和MGF505-7R 基因克隆到pCMV 載體上，并與泛素相融合，構(gòu)建了新型質(zhì)粒（pCMV-Ub-M448R、pCM V-Ub-MGF505-7R）。兩種質(zhì)?；旌铣醮蚊庖哓i，用BA71?CD2 弱毒疫苗進(jìn)行加強(qiáng)免疫。在攻毒實(shí)驗(yàn)中，DNA 疫苗的初次免疫增強(qiáng)了BA71?CD2作為加強(qiáng)疫苗的保護(hù)作用。隨后研究人員通過(guò)ELIspot，證實(shí)M488R 和MGF505-7R 兩種蛋白是具有保護(hù)作用的T 細(xì)胞表位[24]。說(shuō)明T 細(xì)胞作為機(jī)體適應(yīng)性免疫的成員，在抵抗ASFV 中充當(dāng)著重要的角色。因此，還應(yīng)進(jìn)一步探究ASFV 誘導(dǎo)細(xì)胞免疫的機(jī)制。

4 小結(jié)與展望

ASF 在我國(guó)雖已得到有效控制，但其危害性仍然存在且不可忽略，研發(fā)安全有效的ASF 疫苗依舊是當(dāng)下亟需解決的問(wèn)題?，F(xiàn)有部分疫苗已在臨床實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出良好的保護(hù)作用，如我國(guó)研制的 HLJ/18-7GD 疫苗，口鼻免疫的 ASFV-G-?I177L 疫苗等，但基因缺失疫苗的交叉保護(hù)性還有待進(jìn)一步驗(yàn)證。眾多活載體疫苗、亞單位疫苗和DNA 疫苗項(xiàng)目并未進(jìn)行病毒攻毒實(shí)驗(yàn)，即使在豬群體內(nèi)產(chǎn)生了特異性的抗體或T 細(xì)胞，但其是否有效，還需要進(jìn)一步臨床實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。對(duì)于滅活疫苗，研究表明，無(wú)法提供有效保護(hù)。

未來(lái)，應(yīng)加強(qiáng)病毒與宿主相互作用以及復(fù)制過(guò)程中相關(guān)基因的研究。同時(shí)，利用好生物信息技術(shù)，對(duì)ASFV 潛在的靶點(diǎn)進(jìn)行篩選和評(píng)估，通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)和構(gòu)建動(dòng)物模型來(lái)論證靶點(diǎn)的有效性。除此之外，還需積極探究ASFV 相關(guān)蛋白抑制宿主免疫應(yīng)答的機(jī)制，深入挖掘體液免疫和細(xì)胞免疫在對(duì)抗ASFV 感染時(shí)所扮演的“角色”，探索新的疫苗類型（mRNA 疫苗）等。隨著對(duì)ASFV 結(jié)構(gòu)深入的解析，闡明與機(jī)體相互作用的方式，以及相關(guān)新產(chǎn)品新技術(shù)的支持等，期待能夠使ASF 疫苗實(shí)現(xiàn)新的突破。