加速溶劑萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定嬰幼兒配方乳粉中17種磺胺類藥物殘留

吉小鳳，王小驪，呂文濤，周忠靜，吳鈺瀟，楊 華，*

(1.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與營養(yǎng)研究所，浙江 杭州 310021； 2.農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全危害因子與風(fēng)險(xiǎn)防控國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310021； 3.浙江工業(yè)大學(xué) 化學(xué)工程學(xué)院，浙江 杭州 310014)

隨著人們生活水平提高和安全意識增強(qiáng)，動(dòng)物源食品中獸藥殘留已逐漸成為人們關(guān)注的質(zhì)量安全焦點(diǎn)之一。根據(jù)作用機(jī)理，獸藥種類分為磺胺類(SAs)、喹諾酮類(Qs)、大環(huán)內(nèi)酯類(MLs)、四環(huán)素類(TCs)、氨基糖苷類(AGs)、β-內(nèi)酰胺類等[1]。磺胺類藥物是一種廣譜抗菌藥，性質(zhì)穩(wěn)定，由于其抑制細(xì)菌生長的作用，被廣泛應(yīng)用于人類和動(dòng)物胃腸道和呼吸系統(tǒng)疾病的預(yù)防和治療[1-2]。由于磺胺類藥物的半衰期較長，通過任何途徑攝入的磺胺類藥物均會在人體中蓄積，對人體產(chǎn)生一定的毒副作用，如造血紊亂，過敏反應(yīng)，引起腸道菌群失調(diào)，影響人體免疫功能等[3]，這些危害對嬰幼兒的影響更大。因此，很多國家對磺胺類藥物的使用范圍及其在動(dòng)物源性食品中的殘留限度進(jìn)行了嚴(yán)格的規(guī)定。我國《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中獸藥最大殘留限量》(GB 31650—2019)中規(guī)定乳中磺胺類藥物最大殘留限量為100 μg·kg-1，其中磺胺二甲基嘧啶最大殘留限量為25 μg·kg-1[4]。近些年來，磺胺類藥物在國內(nèi)外牛奶和奶粉中均有殘留檢出。2019年，Moudgil等[5]對從印度旁遮普省9個(gè)區(qū)奶牛場的動(dòng)物中采集的生奶樣本進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)牛奶樣品中磺胺甲噁唑檢出率為0.6%。任孟偉[6]采用超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法對30份不同品牌的奶粉和牛奶進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)在3批樣品中檢出磺胺硝苯，其測定值分別為0.05 μg·kg-1、0.16 μg·kg-1和0.18 μg·kg-1。

現(xiàn)有的奶粉中磺胺類藥物殘留檢測前處理方法主要有固相萃取[7-8]和QuEChERS法[9-10]等。其中，固相萃取小柱價(jià)格高，操作繁瑣，不適合于復(fù)雜樣品基質(zhì)的分析。QuEChERS法雖可用于多殘留分析，但是吸附劑不能重復(fù)使用。加速溶劑萃取法通過使用少量有機(jī)溶劑及提高溫度和壓力來提高樣品中化合物的萃取效率，與其他樣品前處理技術(shù)相比具有自動(dòng)化程度高、費(fèi)時(shí)短、消耗溶劑少等優(yōu)點(diǎn)。前期研究中加速溶劑萃取法用于各類基質(zhì)中磺胺類藥物的萃取已有報(bào)道。王靜等[11]建立了加速溶劑萃取-全自動(dòng)凝膠滲透色譜-高效液相色譜聯(lián)用檢測水產(chǎn)品中13種磺胺類藥物的方法，13 種磺胺類化合物在0.01～1.00 mg·L-1線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.999 9；添加100、200、400 μg·kg-1，3個(gè)濃度水平的平均回收率為77.9%～98.6%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.4%～13.4%。Zhu等[12]用加速溶劑萃取-萃取池內(nèi)凈化與超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用的方法分析了海參中21種抗生素(10種磺胺類藥物、4種氟喹諾酮類藥物、3種兩性藥物、2種β-內(nèi)酰胺、1種林可酰胺和1種甲氧芐啶)。通過優(yōu)化處理獲得最佳工藝參數(shù)，使得目標(biāo)分析物的回收率為50.1%～129.2%(RSD小于20%)，方法檢出限在0.03～2.9 μg·kg-1。Alessandra等[13]用加速溶劑萃取-液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用的方法分析了生肉和嬰幼兒食品中13種磺胺類藥物，樣品中磺胺類藥物加標(biāo)回收率為70%～101%，檢出限低于2.6 μg·kg-1。Konak等[14]分別用QuEChERS和加速溶劑萃取兩種方法對嬰兒食品中12種磺胺類藥物及其衍生物進(jìn)行分析，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，QuEChERS方法的回收率范圍為60.9%～85.9%，RSD≤ 19.1%；加速溶劑萃取方法回收率為75.5%～96.6%，RSD ≤ 10.1%。

目前，運(yùn)用加速溶劑萃取法測定嬰幼兒配方乳粉中的磺胺類藥物殘留卻鮮有報(bào)道，因此，建立加速溶劑萃取前處理方法同時(shí)結(jié)合高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜實(shí)現(xiàn)高通量檢測嬰幼兒配方乳粉中的磺胺類藥物殘留的方法，對保障嬰幼兒的食品安全具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

1 材料與方法

1.1 儀器、材料與試劑

ASE 350加速溶劑萃取儀(美國Thermo Fisher Scientific公司)；高效液相色譜儀(日本島津公司)；三重四極桿-線性離子QTRAP?6500阱復(fù)合質(zhì)譜儀(美國AB Sciex公司)；TurboVap?LV自動(dòng)氮吹儀(美國Biotage公司)；BS2202S電子天平(德國Sartorius公司)；SORVALL?Heraeus Biofuge冷凍高速離心機(jī)(德國Sartorius公司)；Talboys數(shù)顯渦旋混合儀(美國Troemner公司)；KQ5200B型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

萃取池為34 mL，購自美國Thermo Fisher Scientific公司；接收瓶，購自上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；玻璃纖維紙直徑為47 mm，購自英國Whatman公司；PTFE濾膜孔徑為0.22 μm，購自北京迪科馬科技有限公司；一次性使用無菌注射器為1 mL，購自上?？档氯R企業(yè)發(fā)展股份有限公司；離心管為1.5 mL，購自德國Eppendorf公司；進(jìn)樣瓶為2 mL，購自北京迪科馬科技有限公司；硅藻土為80～100目，購自美國Thermo Fisher Scientific公司。

甲醇為HPLC級，購自德國Merck公司；乙腈為HPLC級，購自德國Merck公司；甲酸為HPLC級，購自美國ANAQUA公司；甲酸銨為HPLC級，購自美國ACROS Organics公司；實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q純水儀制備的超純水(≥18 MΩ·cm)；17種磺胺類藥物標(biāo)準(zhǔn)品購自德國Dr.Ehrenstorfer公司，基本信息如表1所示。

表1 十七種磺胺目標(biāo)抗生素基本信息表

1.2 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液：分別準(zhǔn)確稱取適量各標(biāo)準(zhǔn)品，甲醇溶解，用甲醇(HPLC級)配制成含各磺胺類藥物10 mg·L-1的混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液，于-20 ℃避光保存。

溶劑混合標(biāo)準(zhǔn)工作液：用甲醇-水(體積比1∶1)將混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液配制成系列濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：用空白樣品基質(zhì)萃取液將混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液配制成系列濃度的基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3 樣品前處理

基于前期加速溶劑萃取方法[13]，優(yōu)化后的樣品前處理方法如下：準(zhǔn)確稱取0.5 g樣品(精確至0.01 g)。不銹鋼萃取池(規(guī)格：34 mL)內(nèi)墊入1張玻璃纖維紙，依次裝入2 g硅藻土，0.5 g樣品，3 g硅藻土。甲醇∶乙腈=1∶4(體積比)為萃取溶劑，萃取溫度為60 ℃，加熱時(shí)間為5 min，靜態(tài)萃取時(shí)間為5 min，萃取循環(huán)次數(shù)為3次，沖洗體積為40%的條件下對樣品進(jìn)行加速溶劑萃取。所得萃取液采用TurboVap?LV全自動(dòng)氮吹儀氮吹至干，然后用2 mL甲醇∶水=1∶1(體積比)復(fù)溶，利用Talboys數(shù)顯渦旋混合儀渦旋30 s，再用超聲波清洗器超聲5 min，然后取1 mL上清液于1.5 mL離心管中，利用冷凍高速離心機(jī)10 000 r·min-1離心3 min，取全部上清液過0.22 μm PTFE濾膜，上機(jī)檢測。

1.4 色譜條件

ACQUITY UPLC C18色譜柱(2.1 mm × 100 mm，1.7 μm)；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣體積：5 μL；流動(dòng)相A：甲醇，流動(dòng)相B：含0.1%甲酸和2 mmol·L-1甲酸銨的水溶液；流速：0.40 mL·min-1；梯度洗脫條件：0～2.0 min，95%～80% B；2.0～6.5 min，80%～1% B；6.5～8.0 min，1% B；8.0～8.1 min，1%～95% B；8.1～10.0 min，95% B。

1.5 質(zhì)譜條件

離子源為電噴霧離子源(ESI)；檢測方式為多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)；掃描方式為正離子掃描；噴霧電壓(IS)為 5 500 V；離子源溫度(TEM)為450 ℃；霧化氣(Gas1)壓力為55 psi；輔助氣(Gas2)壓力為50 psi；氣簾氣(CUR)壓力為40 psi；碰撞氣為Medium；目標(biāo)化合物多反應(yīng)監(jiān)測參數(shù)見表2。

表2 目標(biāo)化合物多反應(yīng)監(jiān)測參數(shù)

2 結(jié)果與分析

2.1 方法驗(yàn)證

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍及檢出限

對于線性范圍確認(rèn)，配制濃度為0.1、0.5、1、5、10 、50、100 μg·L-1磺胺類藥物系列溶劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液及基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，在設(shè)定的色譜和質(zhì)譜條件下進(jìn)行測定。選擇空白嬰幼兒配方乳粉樣品，進(jìn)行加速溶劑萃取，所得的空白基質(zhì)溶液用于系列基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液配制。本研究以各目標(biāo)化合物保留時(shí)間對應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，分別得出溶劑和基質(zhì)加標(biāo)溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線(表3)，以3倍信噪比(S/N)和10倍信噪比確定方法的檢出限(LOD)和定量限(LOQ)[15]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3 所示，17種磺胺類藥物在各自的線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，線性相關(guān)系數(shù)均大于0.998。嬰幼兒配方乳粉中磺胺類藥物的檢出限為0.1～3.0 μg·kg-1，定量限為0.3～10 μg·kg-1(表3)，遠(yuǎn)低于國家標(biāo)準(zhǔn)對磺胺類藥物限量檢測要求和歐盟、日本等國家規(guī)定的最大殘留量。

表3 十七種磺胺類藥物的的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限

2.1.2 準(zhǔn)確度和精密度

采用標(biāo)準(zhǔn)溶液添加法，用嬰幼兒配方乳粉空白樣品作為基質(zhì)，添加3個(gè)不同水平的化合物，平行測定5次，計(jì)算回收率以及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，評價(jià)方法的準(zhǔn)確度和精密度(表4)。本研究分別添加10、20、50 μg·kg-1到空白基質(zhì)樣品中做添加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，不同添加濃度的回收率為75.3%～103.6%，RSD均小于11.0%，符合方法驗(yàn)證要求。

表4 十七種磺胺類藥物在嬰幼兒配方乳粉基質(zhì)中的回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=5)

2.1.3 基質(zhì)效應(yīng)

本研究通過配制濃度為0.1、0.5、1、5、10、50、100 μg·L-1的系列基質(zhì)加標(biāo)溶液，同時(shí)配制系列相同濃度的溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液，在設(shè)定的色譜和質(zhì)譜條件下進(jìn)行分析測定，考察基質(zhì)效應(yīng)對目標(biāo)化合物的干擾程度。通過比較基質(zhì)加標(biāo)溶液校準(zhǔn)曲線方程的斜率和溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液校準(zhǔn)曲線方程的斜率的比值，來判斷基質(zhì)效應(yīng)的強(qiáng)弱[15]。若斜率比值為1，無基質(zhì)效應(yīng)；若斜率比值小于1，基質(zhì)抑制效應(yīng)；若斜率比值大于1，基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)[16]。本研究中，磺胺類藥物在嬰幼兒配方乳粉中基質(zhì)效應(yīng)為0.4～1.0，多數(shù)化合物呈現(xiàn)基質(zhì)抑制現(xiàn)象，詳細(xì)信息見表3。為了準(zhǔn)確定量目標(biāo)化合物，減少質(zhì)譜分析中的基質(zhì)干擾，本研究采用基質(zhì)外標(biāo)法定量分析。

2.2 實(shí)際樣品測定

采用建立的方法對市場隨機(jī)采集的30批次嬰幼兒配方乳粉樣品進(jìn)行17種磺胺類藥物殘留測定。結(jié)果表明，2批次的嬰幼兒配方乳粉樣品檢出磺胺類藥物，其中1批次樣品檢測出磺胺甲噻二唑，含量為3.4 μg·kg-1，另一批次樣品同時(shí)檢出磺胺甲噻二唑 (2.8 μg·kg-1)、磺胺鄰二甲氧嘧啶 (1.5 μg·kg-1)和磺胺喹噁啉 (1.1 μg·kg-1)，樣品中藥物殘留量均小于我國GB 31650—2019中乳中磺胺類藥物殘留的限量規(guī)定(≤100 μg·kg-1)。溶劑標(biāo)準(zhǔn)品，溶劑和基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品以及陽性樣品色譜圖如圖1和圖2所示。

圖1 磺胺甲噻二唑標(biāo)準(zhǔn)品和實(shí)際樣品色譜圖

圖2 磺胺喹噁啉標(biāo)準(zhǔn)品和實(shí)際檢出樣品色譜圖

3 結(jié)論

本文建立一種基于ASE結(jié)合高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜同時(shí)檢測嬰幼兒配方乳粉中17種磺胺類藥物殘留的檢測方法。與傳統(tǒng)方法相比，ASE提取方法避免了前處理時(shí)間長，提取液易乳化等現(xiàn)象，實(shí)現(xiàn)全自動(dòng)提取，提高了檢測靈敏度，檢出限遠(yuǎn)低于國家限量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定。 通過方法學(xué)考察及實(shí)際樣品檢測分析，該方法具有萃取便捷、靈敏度和準(zhǔn)確度高等特點(diǎn)，能夠滿足國內(nèi)外對嬰幼兒配方乳粉中磺胺類藥物殘留的檢測要求。