基于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及相互作用的羊乳熱凝聚物形成分析

薛海燕，李晶瑩，趙嫻慧，賀寶元，伊美霞，宋宏新

1(陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，陜西 西安，710021)2(陜西科技大學(xué) 輕工科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 西安，710021)

羊乳與牛乳相比，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，脂肪球小，更易于人體吸收，且蛋白質(zhì)組成更接近于人乳，是1種健康、安全、營(yíng)養(yǎng)的重要代替乳源[1]。乳中酪蛋白占總蛋白含量的80%左右，主要以酪蛋白膠束形式存在，清蛋白主要由β-乳球蛋白(β-lactoglobulin，β-Lg)、α-乳白蛋白(α-lactalbumin，α-La)、免疫球蛋白(immunoglobulins，Ig)、血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)、乳鐵蛋白(lactoferrin，LF)等組成。山羊乳的酪蛋白膠束較小，直徑在160 nm左右，等電點(diǎn)約在4.1。相比于牛乳，山羊乳酪蛋白膠束結(jié)構(gòu)較疏松，穩(wěn)定性較低。乳清中含量最高的清蛋白是α-La和β-Lg，約占清蛋白含量的70%以上。α-La分子為球狀單體蛋白，由123個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成，其中包含8個(gè)半胱氨酸，形成4個(gè)分子內(nèi)的二硫鍵，相對(duì)分子質(zhì)量?jī)H為14 kDa。其二級(jí)結(jié)構(gòu)及三級(jí)結(jié)構(gòu)有序緊密。山羊乳相較于牛乳，α-La缺乏蛋氨酸。山羊乳的β-Lg單體由162個(gè)氨基酸殘基組成，含5個(gè)半胱氨酸殘基，兩兩形成二硫鍵后，剩余1個(gè)游離的巰基基團(tuán)[2]，相對(duì)分子質(zhì)量為18.3 kDa，易被氧化與其他蛋白質(zhì)結(jié)合。熱處理是乳品加工中最常用的方法，其目的主要是殺死乳中存在及滋生的致病菌及大部分微生物，使乳品達(dá)到衛(wèi)生安全標(biāo)準(zhǔn)。但經(jīng)熱處理可能導(dǎo)致乳清蛋白的變性與流失。DEETH等[3]研究發(fā)現(xiàn)，牛乳經(jīng)超高溫瞬時(shí)滅菌(ultra-high temperature instantaneous sterilization，UHT)處理后，乳清蛋白與酪蛋白發(fā)生相互作用，特別是位于膠束表面的κ-酪蛋白。羊乳與牛乳在蛋白組成、含量及結(jié)構(gòu)等方面都存在一定差異，在pH 5～9，山羊乳的β-Lg比牛乳少3個(gè)負(fù)電荷，多1個(gè)正電荷殘基，在堿性下電泳遷移率不同[4]。因此羊乳使用牛乳常用殺菌方式并不適合，有研究發(fā)現(xiàn)，羊乳熱穩(wěn)定性低于牛乳，尤其是在UHT處理時(shí)，羊乳極易發(fā)生凝聚、沉淀，甚至發(fā)生變性[5]。針對(duì)羊乳熱穩(wěn)定性低，在選擇熱殺菌溫度時(shí)，羊乳應(yīng)相應(yīng)降低處理溫度。目前對(duì)于羊乳蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及熱加工穩(wěn)定性的研究較為薄弱，故研究羊乳的熱凝聚行為，為大規(guī)模液態(tài)羊乳生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮羊乳，陜西金牛乳業(yè)有限公司；N’N-亞甲基雙丙烯酰胺，美國(guó)Sigma公司；丙烯酰胺、四甲基乙二胺、甘氨酸、Tris-base，美國(guó)Amresco公司；其他化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

BP-Power電泳儀，北京百晶生物技術(shù)有限公司；HC-3018R高速冷凍離心機(jī)，安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；GIS400凝膠成像分析系統(tǒng)，南京馳順科技有限公司；傅里葉紅外光譜儀，德國(guó)布魯克公司；納米粒度及Zeta電位儀，奧地利安東帕公司；環(huán)境掃描電子顯微鏡，捷克TESCAN公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 脫脂乳的制備及熱處理羊乳樣品制備

將新鮮羊乳采取常用商業(yè)殺菌方式進(jìn)行熱處理，處理方式設(shè)定如下：63 ℃/30 min、75 ℃/15～20 s、85 ℃/15～20 s、100 ℃/300 s、121 ℃/4 s，不進(jìn)行熱處理的乳樣作為對(duì)照組。

1.3.2 不同溫度熱處理羊乳組分膠束粒徑及電位分析

蛋白質(zhì)的聚集程度可以用粒徑來(lái)表示。不同熱處理后的羊乳樣品加入超純水稀釋20倍后用納米粒度儀進(jìn)行粒徑測(cè)量。

Zeta電位的大小可以用來(lái)表征蛋白質(zhì)在體系中的穩(wěn)定程度。不同熱處理后羊乳加入超純水稀釋10倍后進(jìn)行Zeta電位的測(cè)量。

1.3.3 不同溫度熱處理羊乳微觀結(jié)構(gòu)分析

利用掃描電鏡(scanning electron microscope，SEM)觀察熱處理后羊乳蛋白微觀結(jié)構(gòu)[6]。熱處理后羊乳樣品冷凍干燥，將干燥后粉末均勻置于導(dǎo)電膠上，樣品臺(tái)噴金處理。放入樣品臺(tái)后，調(diào)節(jié)到最佳視野后掃描圖像。

1.3.4 傅里葉紅外光譜二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

樣品處理：將1.3.1中不同熱處理后羊乳樣品，分別進(jìn)行真空冷凍干燥，于-20 ℃保存。傅里葉紅外光譜(Fourier transform infrared spectroscopy,FT-IR)分析蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)方法參照文獻(xiàn)[7]。

1.3.5 羊乳清蛋白的分離

分離方法如圖1所示。

圖1 羊乳清蛋白的分離及化學(xué)沉淀法分離β-乳球蛋白組分Fig.1 Separation of goat whey protein and separation of β-lactoglobulin by chemical precipitation

1.3.6 β-乳球蛋白與羊乳中其他蛋白組分相互作用

經(jīng)1.3.5中分離得到的羊乳β-Lg分別與標(biāo)準(zhǔn)品羊乳α-La、α-CN、β-CN和κ-CN按相應(yīng)組分在羊乳中含量(α-CN，20.6%；β-CN，47.3%；κ-CN，17.7%；α-La，4%；β-Lg，10.3%)溶解混勻，分別對(duì)其進(jìn)行熱處理，取樣后置于-20 ℃冰箱待測(cè)。

1.3.7 乳樣中蛋白質(zhì)SDS-PAGE分子質(zhì)量分析

取β-乳球蛋白樣品質(zhì)量濃度為1 mg/mL，選擇濃度15%的分離膠和濃度為5%的濃縮膠，分別加入還原性(含β-巰基乙醇，+β)與非還原性(無(wú)β-巰基乙醇，-β)的2倍蛋白樣品緩沖液，分析蛋白在巰基乙醇是否還原二硫鍵的情況下蛋白的電泳遷移行為變化。點(diǎn)樣量10 μL/孔。電泳結(jié)束后剝膠，放置搖床染色大約2～6 h。待染色完成后，更換脫色液至背景為無(wú)色。使用凝膠成像儀采集圖像，并采用Image J對(duì)蛋白質(zhì)條帶灰度值進(jìn)行分析，根據(jù)各條帶的百分含量計(jì)算蛋白質(zhì)純度。

2 結(jié)果與分析

2.1 羊乳β-Lg的分離純化結(jié)果

圖2為不同NaCl濃度條件下對(duì)乳清蛋白的分離結(jié)果，當(dāng)NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為9%時(shí)，即泳道3，能夠得到較純的β-Lg，采用Image J對(duì)蛋白質(zhì)條帶灰度值進(jìn)行分析，根據(jù)各條帶的百分含量計(jì)算β-Lg純度為95%以上，純度達(dá)到后續(xù)研究要求。

M-Marker；1～3為質(zhì)量分?jǐn)?shù)是5%，7%，9%NaCl溶液分離β-Lg上清；4～6為沉淀圖2 β-Lg分離的電泳結(jié)果Fig.2 Electrophoresis results of separation of β-Lg

2.2 不同溫度熱處理后脫脂山羊乳膠束粒徑分析

未經(jīng)熱處理羊乳的粒徑主要分布在100～1 000 nm，平均粒徑為209.6 nm(圖3-a)，由圖3-b可見，熱處理顯著改變?nèi)榈牧剑?jīng)低溫巴氏殺菌，平均粒徑增大為217.7 nm，75 ℃處理后，粒徑為219.7 nm，85 ℃的高溫巴氏殺菌使得粒徑增加到228.6 nm，當(dāng)121 ℃處理時(shí)，平均粒徑增加到289.2 nm，粒徑增加顯著。RAYNAL等[8]研究表明，在75 ℃/30 s加熱后，羊奶中的膠束平均粒徑增加不明顯，在85 ℃/30 s加熱后，膠束平均粒徑增加。熱處理使得乳清蛋白發(fā)生變性，且乳清蛋白與酪蛋白膠束也發(fā)生凝聚，故隨著處理溫度的增加，粒徑分布峰寬擴(kuò)大，平均粒徑也在不斷增大。

a-粒徑分布圖；b-平均粒徑分布圖圖3 不同熱處理羊乳粒徑圖Fig.3 The particle size of different heat-treated goat milk注：1～6分別為未熱處理、63 ℃/30 min、75 ℃/15 s、85 ℃/15 s、100 ℃/300 s、121 ℃/4 s處理羊乳，字母不同表示與對(duì)照組比具有顯著性差異(P<0.05)(下同)

2.3 不同溫度熱處理羊乳Zeta電位分析

Zeta電位可以用來(lái)表征膠體分散系的穩(wěn)定性，膠體粒子之間相互排斥或吸引，Zeta電位的絕對(duì)值越高，斥力越大，體系越穩(wěn)定。由圖4可知，鮮羊乳的電位為(-22.5±0.6) mV，經(jīng)100 ℃處理，羊乳電位為(-15.7±0.2) mV，經(jīng)121 ℃處理羊乳，平均電位為(-16.2±0.2) mV，較100 ℃的電位有所降低，隨熱處理強(qiáng)度增加，羊乳電位絕對(duì)值普遍降低，膠束穩(wěn)定性越弱。張雪喜[9]對(duì)熱處理后羊乳進(jìn)行電位測(cè)定，與生鮮羊乳相比，不同熱加工羊乳組的Zeta電位值均有不同程度地減小，85 ℃/15 s和125 ℃/4 s處理組間具有顯著性差異。熱處理使得乳清蛋白發(fā)生變性，并聚集在酪蛋白膠束表面，膠束表面的電荷下降，乳體系穩(wěn)定性降低。

圖4 不同熱處理羊乳平均Zeta電位圖Fig.4 The average Zeta potential diagram of different heat-treated goat milk

2.4 不同溫度熱處理羊乳掃描電鏡分析

圖5為不同溫度熱處理脫脂山羊乳冷凍干燥后的SEM圖，由圖5-a可知，未處理羊乳的結(jié)構(gòu)比較疏松，孔隙大小較均一，而經(jīng)63和100 ℃處理的顆粒較大且大小不一，表面多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)消失，開始產(chǎn)生聚集，75 ℃處理組的表觀來(lái)看呈片層結(jié)構(gòu)且無(wú)明顯網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，85 ℃處理后的乳蛋白相比于原料乳蛋白，明顯有部分凝集，可能是由于乳蛋白部分形成熱變性蛋白聚合物，表明蛋白質(zhì)分子間的結(jié)合更緊密。121 ℃熱處理的山羊乳乳粒表面平整孔隙明顯。ZHANG等[10]對(duì)奶牛及牦牛酪蛋白膠束微觀結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察，奶牛酪蛋白膠束結(jié)構(gòu)更為松散，孔隙較大。孫佳悅[11]對(duì)不同熱處理牛乳蛋白質(zhì)膠束結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀測(cè)，63及80 ℃處理牛乳后，相比于鮮牛乳，顆粒增大，且有部分凝集，形成蛋白聚合物。本實(shí)驗(yàn)中山羊乳在75和100 ℃熱處理的蛋白質(zhì)微觀結(jié)構(gòu)與上述牛乳有相似的結(jié)果。

a-未處理羊乳；b-63 ℃/30 min；c-75 ℃/15 s；d-85 ℃/15 s；e-100 ℃/300 s；f-121 ℃/4 s圖5 不同溫度熱處理羊乳掃描電鏡圖Fig.5 Scanning electron microscope images of goat milk treated at different temperatures

2.5 不同溫度熱處理羊乳紅外光譜分析

為分析經(jīng)不同熱處理后羊乳中蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化，對(duì)羊乳樣品進(jìn)行傅里葉紅外光譜分析，結(jié)果如圖6所示，經(jīng)不同程度熱處理羊乳與未經(jīng)熱處理羊乳的譜圖差異較小。不同熱處理?xiàng)l件下羊乳的透光度發(fā)生變化，特征吸收峰產(chǎn)生了不同程度的紅移或藍(lán)移，變化最明顯的波段為3 600～3 100 cm-1和1 700～1 600 cm-1。

圖6 不同熱處理?xiàng)l件下羊乳蛋白FT-IR光譜圖Fig.6 FT-IR spectra of goat milk protein under different heat treatment conditions

研究表明，游離羥基的吸收峰位于3 600～3 500 cm-1，當(dāng)其由游離態(tài)向結(jié)合態(tài)轉(zhuǎn)化形成分子內(nèi)或分子間氫鍵時(shí)，它的吸收峰也會(huì)隨之紅移并與N—H(譜帶范圍3 500～3 200 cm-1)的吸收峰重疊，從而會(huì)在3 400 cm-1左右形成吸收峰。在乳蛋白分子多聚體中存在大量分子內(nèi)或分子間氫鍵時(shí)，在紅外光譜圖中表示為在3 400 cm-1左右波段吸收峰寬而強(qiáng)[12]。

由圖6可知，未處理原料羊乳的紅外譜帶在3 321 cm-1處存在明顯的特征吸收峰，說(shuō)明氫鍵在分子內(nèi)和分子間大量存在。經(jīng)熱處理后羊乳的吸收峰均發(fā)生一定程度的紅移，說(shuō)明蛋白分子間氫鍵斷裂與重新締合，羊乳蛋白的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。在121 ℃的超高溫處理下，羊乳吸收峰紅移至3 416 cm-1，移動(dòng)幅度最大，表明氫鍵破壞最為嚴(yán)重。

圖7為羊乳經(jīng)不同熱處理后的酰胺Ⅰ帶紅外光譜圖，經(jīng)熱處理后均有不同程度紅移。對(duì)該圖做二階導(dǎo)數(shù)并進(jìn)行高斯擬合，根據(jù)各子峰位置確定其與二級(jí)結(jié)構(gòu)的對(duì)應(yīng)關(guān)系，計(jì)算各峰的積分面積，得到各二級(jí)結(jié)構(gòu)含量。

圖7 羊乳蛋白經(jīng)不同熱處理酰胺Ⅰ帶FT-IR光譜圖Fig.7 FT-IR spectra of goat milk protein amide Ⅰ with different heat treatment conditions

圖8為不同熱處理后羊乳蛋白酰胺Ⅰ帶經(jīng)高斯擬合處理得到的擬合圖譜，擬合后的二級(jí)結(jié)構(gòu)含量變化見表1，未處理羊乳蛋白α-螺旋結(jié)構(gòu)占37.14%，羊乳蛋白經(jīng)熱處理后α-螺旋結(jié)構(gòu)均有不同程度的減少，其中經(jīng)121 ℃熱處理的α-螺旋結(jié)構(gòu)減少最為顯著，達(dá)到14.47%。α-螺旋是蛋白質(zhì)中常見且最為穩(wěn)定的二級(jí)結(jié)構(gòu)，靠鏈內(nèi)氫鍵維持。熱處理程度增大，使α-螺旋中的氫鍵逐漸斷裂，發(fā)生解螺旋，乳蛋白發(fā)生熱變性。故蛋白的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性與蛋白α-螺旋結(jié)構(gòu)呈正比例關(guān)系。

a～f分別為未熱處理、63 ℃/30 min、75 ℃/15 s、85 ℃/15 s、100 ℃/300 s、121 ℃/4 s熱處理羊乳圖8 經(jīng)不同熱處理后羊乳蛋白酰胺Ⅰ帶高斯曲線擬合圖Fig.8 Gaussian curve fitting diagram of goat milk protein amide Ⅰ under different heat treatment conditions

β-轉(zhuǎn)角含量表現(xiàn)為先增加后降低，但總體呈現(xiàn)為增加趨勢(shì)，未處理羊乳β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)占30.66%，經(jīng)85 ℃熱處理后增加到45.35%，經(jīng)100 ℃以上處理又減少到30%以上。β-折疊結(jié)構(gòu)在原乳中為16.38%，經(jīng)63及100 ℃處理的β-折疊結(jié)構(gòu)含量增加，高溫短時(shí)處理的羊乳β-折疊結(jié)構(gòu)含量減少，含量處于波動(dòng)狀態(tài)。β-折疊結(jié)構(gòu)常見于蛋白質(zhì)內(nèi)部折疊區(qū)域，經(jīng)熱處理后羊乳蛋白形成熱聚集體，分子間的β-折疊結(jié)構(gòu)易轉(zhuǎn)變?yōu)棣?轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)，且部分β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)闊o(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)[13]。

無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)在未處理羊乳中為15.83%；隨著熱處理溫度升高，無(wú)規(guī)則卷曲含量逐漸升高，其中100 ℃熱處理的乳蛋白中無(wú)規(guī)則卷曲含量顯著增加到30.73%，這是由于熱處理破壞了部分蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)。且隨著熱處理程度的增強(qiáng)，部分有序的乳蛋白結(jié)構(gòu)逐漸向無(wú)序轉(zhuǎn)化，無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)含量也就不斷增加。孫佳悅等[14]對(duì)牛乳蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的研究結(jié)果與本研究中山羊乳的變化趨勢(shì)一致。

表1 不同熱處理?xiàng)l件下羊乳蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)含量變化Table 1 The secondary structure content of goat milk protein under different heat treatment conditions

2.6 不同溫度熱處理羊乳SDS-PAGE結(jié)果

用SDS-PAGE對(duì)不同溫度熱處理的羊乳樣品的分子質(zhì)量進(jìn)行分析，羊乳蛋白經(jīng)不同溫度的熱處理，蛋白發(fā)生變性、聚集、凝結(jié)的程度也不同。

不同熱處理脫脂羊乳電泳結(jié)果見圖9，對(duì)非還原性樣品與還原性樣品電泳結(jié)果作對(duì)比。

M-Marker；1-未處理羊乳；2～6分別為63 ℃/30 min、75 ℃/15 s、85 ℃/15 s、100 ℃/300 s、121 ℃/4 s處理羊乳a圖(-β)表示非還原性樣品，不含有β-巰基乙醇；b圖(+β)為還原性樣品，含有β-巰基乙醇圖9 不同熱處理羊乳SDS-PAGE(-β) (+β)結(jié)果Fig.9 SDS-PAGE (-β) (+β) results of different heat-treated goat milk

與鮮羊乳相比，脫脂羊乳經(jīng)63 ℃低溫長(zhǎng)時(shí)巴氏殺菌與75和85 ℃的高溫瞬時(shí)巴氏殺菌，蛋白電泳條帶未發(fā)生明顯變化，當(dāng)熱處理溫度為100 ℃時(shí)，電泳條帶發(fā)生明顯變化，清蛋白變淺，且β-Lg較α-La蛋白條帶更淺，且非還原性電泳κ-CN條帶可明顯觀察到消失，比較還原和非還原電泳圖可以發(fā)現(xiàn)，三者可能通過(guò)二硫鍵結(jié)合，當(dāng)羊乳經(jīng)121 ℃處理時(shí)，清蛋白與κ-CN變性，條帶變淺。羊乳經(jīng)85 ℃以上溫度處理時(shí)，蛋白即聚集形成大分子物質(zhì)無(wú)法通過(guò)濃縮膠，在加樣口形成條帶。

將熱處理后的羊乳5 000 r/min離心分離出乳清，由上清液電泳可看出(圖10)，非還原性樣品85 ℃處理后κ-CN條帶就已消失，100 ℃以上處理β-Lg，κ-CN以及血清白蛋白條帶都消失，α-La條帶明顯變淺，而上方上樣孔存在不能遷移的大分子；故α-La的熱穩(wěn)定性比β-Lg的要高，β-Lg在85 ℃左右發(fā)生蛋白變性，α-La在90 ℃左右發(fā)生較大程度變性。結(jié)合還原性樣品電泳圖(+β)，100 ℃處理后α-La和β-Lg條帶變淺但未消失，故清蛋白β-Lg與部分的α-La經(jīng)較高溫度熱處理可能與部分酪蛋白如κ-CN等發(fā)生交聯(lián)聚集形成大分子蛋白。HOVJECKI等[15]研究熱處理羊乳的電泳結(jié)果顯示，經(jīng)72 ℃/30 s以上處理后的樣品中乳清蛋白顯著聚集，85 ℃/5 min處理的樣品中存在高分子質(zhì)量二硫鍵蛋白復(fù)合物，不能擴(kuò)散到凝膠中。本研究顯示羊乳蛋白質(zhì)對(duì)熱敏感，85 ℃處理較短時(shí)間即發(fā)生變性。

注：1～6分別為未熱處理、63 ℃/30 min、75 ℃/15 s、85 ℃/15 s、100 ℃/300 s、121 ℃/4 s處理羊乳離心后的上清液a-非還原性樣品，不含有β-巰基乙醇；b-還原性樣品，含有β-巰基乙醇圖10 不同熱處理羊乳乳清部分SDS-PAGE(-β) (+β)結(jié)果Fig.10 SDS-PAGE (-β) (+β) results of different heat-treated goat milk whey parts

2.7 酪蛋白與羊β-Lg間相互作用分析

經(jīng)熱處理后羊乳蛋白間存在聚集與交聯(lián)，但交聯(lián)方式與參與蛋白尚不清楚，故利用分離純化的單組分蛋白進(jìn)行熱處理，探索蛋白間的聚集行為及相互作用。

熱處理羊β-Lg與酪蛋白組分非還原性(-β)與還原性(+β)蛋白質(zhì)電泳圖見圖11、圖12。羊β-Lg與ɑ-CN混合熱處理后，β-Lg條帶顏色淺，由于β-Lg 分子含有游離巰基和二硫鍵容易發(fā)生熱變性[16]，經(jīng)121 ℃處理，β-Lg與ɑ-CN條帶都變淺，且有大分子蛋白生成，β-Lg與ɑ-CN可能發(fā)生二硫鍵的交聯(lián)與轉(zhuǎn)換而相互結(jié)合。羊β-Lg與β-CN混合熱處理后，β-Lg條帶未發(fā)生明顯變化，β-Lg與β-CN可能未發(fā)生蛋白間的交聯(lián)，且β-CN作為疏水性最強(qiáng)的蛋白，不能與β-Lg結(jié)合。羊β-Lg與κ-CN混合熱處理，可觀察到在121 ℃熱處理時(shí)κ-CN有拖尾現(xiàn)象(圖11-b)，上方加樣孔有條帶，說(shuō)明有大分子蛋白生成，可能是β-Lg與κ-CN形成了大小不一的蛋白質(zhì)聚集物，β-Lg與κ-CN發(fā)生二硫鍵的結(jié)合[17-20]。PARRIS等[21]的研究表明牛乳在溫度高于90 ℃，其中β-Lg也可通過(guò)二硫鍵與κ-CN形成大分子絡(luò)合物。

M-Marker；圖a中1～6為β-Lg與ɑ-CN混合物；圖a中7～9和圖b中1～3為β-Lg與β-CN混合物；圖b中4～9為β-Lg與κ-CN混合物；各組樣本按順序分別為：未熱處理、63 ℃/30 min、75 ℃/15 s、85 ℃/15 s、100 ℃/300 s、121 ℃/4 s圖11 熱處理羊β-Lg與酪蛋白組分的電泳結(jié)果(-β)Fig.11 Electrophoresis results of heat-treated goat β-Lg and casein components (-β)

圖12 熱處理羊β-Lg與酪蛋白組分的電泳結(jié)果(+β)Fig.12 Electrophoresis results of heat-treated goat β-Lg and casein components (+β)

3 結(jié)論

本研究對(duì)羊乳進(jìn)行不同程度熱處理，研究羊乳在熱處理后蛋白變性，聚合及蛋白間相互作用關(guān)系，結(jié)果表明，經(jīng)熱處理后羊乳蛋白粒徑增大，Zeta電位絕對(duì)值降低，乳體系穩(wěn)定性下降；經(jīng)紅外光譜分析，蛋白質(zhì)分子氫鍵斷裂，二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋含量降低，無(wú)規(guī)則卷曲含量升高，乳蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)由有序向無(wú)序轉(zhuǎn)變。羊乳經(jīng)85 ℃處理，乳清蛋白發(fā)生變性，100 ℃處理后乳清蛋白完全變性，并交聯(lián)產(chǎn)生蛋白聚合物；經(jīng)單組分蛋白質(zhì)間相互作用分析發(fā)現(xiàn)，山羊乳中β-Lg極易與膠束外圍的κ-CN發(fā)生二硫鍵的交聯(lián)與轉(zhuǎn)化，使蛋白間凝聚，而α-CN則表現(xiàn)出與β-Lg有較低程度的結(jié)合。因此，在乳制品生產(chǎn)過(guò)程中，應(yīng)選用合適的加工方式，使乳蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)能保持較高的穩(wěn)定性。