外源鈣對(duì)蜜橘抗日灼生理病害的分子與生理機(jī)制研究

高志鍵，李春俠，周秋蓉，李江波，李 延，王 平*

(1 福建農(nóng)林大學(xué) 園藝學(xué)院,園藝植物遺傳育種研究所,福州 350002；2 撫州市南豐柑桔研究所,江西撫州 344100；3 福建農(nóng)林大學(xué) 資源與環(huán)境學(xué)院,福州 350002)

日灼病是由溫度過高和強(qiáng)直射太陽光所造成的一種生理病害，尤其是突發(fā)性的高溫與強(qiáng)光更容易導(dǎo)致日灼發(fā)生[1]。柑橘果實(shí)發(fā)生日灼后，果實(shí)畸形，灼傷部位果皮呈現(xiàn)黃色或深褐色，果肉呈現(xiàn)海綿狀，果汁變淡風(fēng)味差，失去食用價(jià)值[2]。柑橘適宜種植在溫暖且潮濕的氣候下，若陽光長(zhǎng)時(shí)間直射植株，使其表面溫度過高，會(huì)導(dǎo)致果實(shí)的灼傷，尤其是樹冠外圍結(jié)果較多的南豐蜜橘，其日灼果實(shí)發(fā)生率可達(dá)40%以上[3]。而樹冠內(nèi)膛果實(shí)由于枝葉的遮擋，一般不會(huì)發(fā)生日灼。

在強(qiáng)光和高溫脅迫下，果實(shí)表皮的生理代謝水平會(huì)失衡，產(chǎn)生大量的ROS分子，導(dǎo)致膜損傷和結(jié)構(gòu)改變，進(jìn)而引起酚類物質(zhì)的酶促和非酶促褐變，造成果皮日灼[4]。正常情況下，細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生ROS和抗氧化酶活性升高是處于一種動(dòng)態(tài)平衡，不會(huì)使植物受到傷害，但當(dāng)植物處于逆境中，這種平衡被打破，植物體自身的保護(hù)防御機(jī)制也隨之不斷變化[5]。由此可見，抗氧化酶防御機(jī)制對(duì)植物本身非常重要。張蓓等[6]研究發(fā)現(xiàn)，噴施螯合鈣可以減緩蜜廣橘果皮ROS的積累，增強(qiáng)抗氧化酶的活性，保持了抗氧化系統(tǒng)的動(dòng)態(tài)平衡。Ca2+作為胞內(nèi)的第二信使,在植物對(duì)各種逆境信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)中起著重要作用[7]。Ca2+信號(hào)通過與鈣調(diào)素(calmodulin,CaM)、依賴鈣激活的蛋白激酶(calcium-dependent protein kinases,CDPKs或CPKs)等相關(guān)靶蛋白結(jié)合而調(diào)節(jié)下游靶酶的活性，從而調(diào)節(jié)ROS的代謝[8]，提高植物對(duì)逆境的適應(yīng)性。前人研究發(fā)現(xiàn)CaM 拮抗劑處理可以明顯降低抗氧化酶超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、抗壞血酸過氧化物酶(APX)等酶活性，說明抗氧化酶活性受到鈣信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)[9-10]。已有研究表明，Ca2+參與多種逆境脅迫過程如低溫、鹽脅迫、氧脅迫等，施用外源鈣能提高植物的抗逆性[11-12]。而有關(guān)鈣信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)基因?qū)γ坶俟麑?shí)抗日灼作用的研究未見報(bào)道，為探討鈣信號(hào)系統(tǒng)對(duì)蜜橘抗氧化基因表達(dá)的影響，本研究以南豐蜜橘為試驗(yàn)材料，研究鈣處理下不同發(fā)育階段鈣信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相關(guān)基因和抗氧化酶基因的變化以及果皮抗氧化酶活性和ROS含量的變化，以期為生產(chǎn)上用鈣處理預(yù)防蜜橘日灼生理病害問題提供理論支持。

1 材料和方法

1.1 材料與處理

試驗(yàn)分別于2017和2018年的6月1日到11月10日在江西省撫州市南豐縣明誠(chéng)果園進(jìn)行，以中熟南豐蜜橘(CitrusreticulataBlanco cv.Nanfeng tangerine) 20年結(jié)果樹為試驗(yàn)材料。選擇掛果量、樹勢(shì)相當(dāng)，朝向一致無遮擋的果樹作為試驗(yàn)樹，每個(gè)處理6株，常規(guī)管理。分別于6月1日和7月1日17:00后對(duì)不同處理試驗(yàn)果樹的果實(shí)進(jìn)行噴施處理，以果面滴水為度。2017年預(yù)試驗(yàn)使用螯合鈣(美國(guó)布蘭特股份有限公司) 噴施濃度梯度為0(清水對(duì)照)、0.10、0.14、0.18和0.22 g·L-1；2018年選擇預(yù)試驗(yàn)效果最好的螯合鈣濃度0.14 g·L-1噴施樹冠外圍頂部果實(shí)，以噴施清水的樹冠外圍頂部果實(shí)為對(duì)照。

7-11月的每月5日采樣1次，共計(jì)5次，每次每株在南和西南方向隨機(jī)采10個(gè)日灼果實(shí)和10個(gè)正常果實(shí)，每次每處理共采120個(gè)果實(shí)運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室后，40個(gè)果實(shí)為一個(gè)重復(fù)，共3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，日灼果取日灼處果皮，正常果取相同部位同等大小的果皮，稱取適當(dāng)重量的果皮，分別混合均勻，用錫箔紙分裝，液氮速凍，隨后置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方 法

1.2.1 日灼果發(fā)生率統(tǒng)計(jì)高溫結(jié)束后(11月10日)，分別統(tǒng)計(jì)鈣處理和對(duì)照的果實(shí)總數(shù)和日灼果數(shù)，計(jì)算果實(shí)日灼發(fā)生率。

果實(shí)日灼發(fā)生率(%)=日灼果數(shù)/果實(shí)總數(shù)×100%

1.2.2 果皮RNA提取及相關(guān)基因表達(dá)分析基因表達(dá)量測(cè)定：參照東盛生物通用RNA試劑盒進(jìn)行RNA的提取，參照諾唯贊HiScriptⅡ Q RT SperMix for qPCR試劑盒合成cDNA。

基因表達(dá)分析采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，在羅氏熒光定量PCR分析儀上完成。本研究選擇了柑橘Actin基因作為內(nèi)參基因，根據(jù)citrus HarvEST database(http://harvest.ucr.edu/)已知EST序列分別設(shè)計(jì)了內(nèi)參基因Actin、CsNADK、CsMPK8、CsCPK等特異性引物(表1)。

表1 熒光定量PCR引物Table 1 Fluorescent quantitative PCR primers

基因擴(kuò)增體系為：10 μL 2 × ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix,0.4 μL上/下游引物，2 μL cDNA，7.2 μL ddH2O?；驍U(kuò)增體系體積20 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性30 s；循環(huán)反應(yīng)：95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，45個(gè)循環(huán)；溶解曲線：95 ℃ 30 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s。試驗(yàn)重復(fù)3次，按照2-ΔΔCt法計(jì)算出基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.3 果皮活性氧熒光染色果皮活性氧的分布：每月每個(gè)處理分別取6個(gè)果實(shí)，用冷凍切片機(jī)對(duì)日灼處果皮(2 mm×2 mm)進(jìn)行切片，切片厚度為70μm，立即用氯甲基二氯二氫熒光素二乙酯(CM-H2DCFDA)對(duì)其染色，在黑暗環(huán)境下孵育20 min，放在載玻片上，用激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行觀察。

1.2.5 抗氧化酶活性測(cè)定酶液粗提取參照曹建康等[15]方法；SOD活性測(cè)定采用氮藍(lán)四唑光化還原法；CAT活性測(cè)定采用 H2O2紫外吸收法；POD活性測(cè)定采用愈創(chuàng)木酚法；APX活性的測(cè)定參考Yu等[16]的方法；谷胱甘肽還原酶(GR)活性測(cè)定參考Hasanuzzaman等[17]的方法；谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)活性測(cè)定參考Yu等[18]方法。

1.3 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用Microsoft excel 2019處理計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，采用SPSS 19.0進(jìn)行差異顯著性分析(P<0.05)，利用Excel 2019軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 鈣處理后南豐蜜橘果實(shí)日灼發(fā)生率的變化

在高溫結(jié)束后，對(duì)果實(shí)日灼發(fā)生率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，鈣處理的果實(shí)日灼發(fā)生率顯著低于清水處理，日灼發(fā)生率降低了13.76%(圖1)。結(jié)果表明鈣處理能顯著降低南豐蜜橘果實(shí)的日灼發(fā)生率。

不同小寫字母表示處理與對(duì)照間在0.05水平差異顯著,下同圖1 鈣處理后南豐蜜橘果實(shí)日灼發(fā)生率變化Different normal letters indicate significant difference between treatment and control at P<0.05,the same as belowFig.1 Change of the incidence of sunburn fruits in Nanfeng tangerine after calcium treatment

2.2 鈣處理后南豐蜜橘果皮鈣信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相關(guān)基因的表達(dá)

圖2顯示了蜜橘果皮的鈣信號(hào)途徑相關(guān)基因相對(duì)表達(dá)量。從7月日灼病害發(fā)生至11月果實(shí)完熟，鈣處理的果皮CsNADK相對(duì)表達(dá)量總體顯著高于對(duì)照，在9月達(dá)到峰值；鈣處理的果皮CsMPK8的相對(duì)表達(dá)量在整體上顯著高于對(duì)照。從8月日灼病發(fā)生前期開始至11月果實(shí)完熟，鈣處理的果皮CsCPK相對(duì)表達(dá)量始終顯著高于對(duì)照。在最易發(fā)生日灼時(shí)期的7-10月，鈣處理降低了蜜橘果皮CsRBOH的相對(duì)表達(dá)量。8-10月份，鈣處理的果皮CsCAMK1的相對(duì)表達(dá)量均顯著高于對(duì)照，在10月達(dá)到峰值。鈣處理的果皮CsGAD的相對(duì)表達(dá)量從整體上顯著高于對(duì)照，其中在7和8月鈣處理的果皮CsGAD的相對(duì)表達(dá)量最高。說明鈣處理可以顯著提高蜜橘果皮鈣信號(hào)途徑相關(guān)基因CsNADK、CsMPK8、CsCPK、CsCAMK1和CsGAD的相對(duì)表達(dá)水平，并抑制了調(diào)控ROS產(chǎn)生的CsRBOH相對(duì)表達(dá)。

圖2 南豐蜜橘不同發(fā)育時(shí)期果皮鈣信號(hào)途徑相關(guān)基因的表達(dá)Fig.2 Expressions of calcium signaling pathway related genes in peels of Nanfeng tangerine during different development stages

2.3 鈣處理后南豐蜜橘果皮抗氧化酶相關(guān)基因的表達(dá)

如圖3所示，對(duì)照處理和鈣處理的果皮CsSOD(Cu-Zn)的相對(duì)表達(dá)量在高溫和強(qiáng)直射光脅迫的初期(7-8月)整體較高，而后期(9-11月)顯著降低，但鈣處理的果皮CsSOD(Cu-Zn)相對(duì)表達(dá)量在7-11月均顯著高于對(duì)照。在7-10月，鈣處理果皮CsCAT的相對(duì)表達(dá)量始終高于對(duì)照。對(duì)照處理和鈣處理的果皮CsPOD的相對(duì)表達(dá)量呈現(xiàn)出先下降后上升的趨勢(shì)，但鈣處理果皮CsPOD的相對(duì)表達(dá)量在整個(gè)果實(shí)發(fā)育過程中一直顯著高于對(duì)照，在8月達(dá)到峰值。在蜜橘果實(shí)發(fā)育期間，對(duì)照處理和鈣處理的果皮CsAPX的相對(duì)表達(dá)量呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)，但鈣處理果皮CsAPX的相對(duì)表達(dá)量始終顯著高于對(duì)照，并于8月達(dá)到峰值。在蜜橘發(fā)育過程中，對(duì)照處理和鈣處理的果皮CsGSR的表達(dá)趨勢(shì)與CsSOD(Cu-Zn)的相似，鈣處理的果皮CsGSR的相對(duì)表達(dá)量整體上顯著高于對(duì)照。從7-9月日灼病害發(fā)生最嚴(yán)重時(shí)期，鈣處理果皮CsGPX的相對(duì)表達(dá)量顯著高于對(duì)照，在8月達(dá)到峰值。以上結(jié)果說明鈣處理顯著提高了蜜橘果皮抗氧化酶相關(guān)基因的表達(dá)。

圖3 南豐蜜橘不同發(fā)育時(shí)期果皮抗氧化酶相關(guān)基因的表達(dá)Fig.3 Expression of antioxidant enzyme related genes in peels of Nanfeng tangerine during different development stages

2.4 鈣處理南豐蜜橘果皮ROS和丙二醛含量的變化

圖4 南豐蜜橘不同發(fā)育時(shí)期果皮過氧化物和MDA含量的變化Fig.4 Changes of peroxide and MDA contents in peels of Nanfeng tangerine during different development stages

2.5 鈣處理南豐蜜橘果皮ROS熒光強(qiáng)度分布的變化

由圖5可以看出，在果實(shí)遭受高溫脅迫初期(7月)，對(duì)照處理和鈣處理的外果皮和白皮層開始出現(xiàn)綠色熒光；在8-9月高溫期，對(duì)照處理和鈣處理的果皮的ROS綠色熒光已經(jīng)從外果皮漫延到中果皮，但鈣處理果皮ROS熒光分布擴(kuò)散面積較?。?0月，對(duì)照處理和鈣處理的外果皮ROS熒光繼續(xù)積累，鈣處理果皮白皮層綠色熒光分布面積逐漸減少；11月份對(duì)照處理和鈣處理的外果皮、中果皮細(xì)胞間隙急劇增大，白皮層細(xì)胞部分崩潰，ROS熒光信號(hào)部分大范圍消失。在蜜橘不同的發(fā)育時(shí)期，2個(gè)處理的ROS熒光強(qiáng)度均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)(圖5)。圖6表明，7-10月果實(shí)遭受高溫脅迫期，對(duì)照的外果皮ROS熒光強(qiáng)度最高，鈣處理的ROS熒光強(qiáng)度均顯著弱于對(duì)照，二者差異顯著。11月份果實(shí)進(jìn)入成熟期，對(duì)照處理和鈣處理果皮熒光強(qiáng)度急劇下降(圖6)。說明果皮細(xì)胞在經(jīng)過長(zhǎng)時(shí)間ROS的毒害作用，產(chǎn)生ROS的細(xì)胞器(線粒體和葉綠體)嚴(yán)重?fù)p傷，生成ROS能力下降，導(dǎo)致對(duì)照處理和鈣處理的果皮ROS熒光強(qiáng)度低于其他月份。

圖5 南豐蜜橘不同發(fā)育時(shí)期果皮ROS的熒光分布Fig.5 Distribution of ROS in the peels of Nanfeng tangerine during different developmental stages

圖6 南豐蜜橘不同發(fā)育時(shí)期果皮ROS的熒光強(qiáng)度Fig.6 Fluorescence intensity of ROS in the peels of Nanfeng tangerine during different developmental stages

2.6 鈣處理南豐蜜橘果皮抗氧化酶活性變化

圖7顯示，在7月日灼病害開始發(fā)生到11月果實(shí)完熟，對(duì)照處理和鈣處理果皮中的抗氧化酶活性均呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)。說明在果實(shí)日灼病害發(fā)生初期，高溫和強(qiáng)直射光脅迫激發(fā)了抗氧化酶活性，病害發(fā)生后期，隨著ROS的積累，膜脂過氧化，使抗氧化酶的活性受到抑制。在不同的發(fā)育時(shí)期，鈣處理果皮的抗氧化酶活性均高于對(duì)照。在8月份鈣處理果皮的SOD、CAT、POD、APX、GR、GPX活性最高，與對(duì)照相比分別增加了35.82%、47.96%、31.48%、31.01%、47.65%和123.19%。隨著時(shí)間延長(zhǎng)，鈣處理對(duì)抗氧化酶活性影響愈小。說明噴鈣能在一定程度上提高抗氧化酶的活性。

圖7 南豐蜜橘不同發(fā)育時(shí)期果皮抗氧化酶活性的變化Fig.7 Changes of antioxidant enzyme activities in peels of Nanfeng tangerine during different developmental stages

3 討 論

果皮日灼生理病害一直是蜜橘生產(chǎn)上的常見問題，尤其是近幾年全球氣溫的上升逐漸使日灼病害加重。目前生產(chǎn)上的防控措施主要是噴水降溫、果實(shí)套袋、遮陽網(wǎng)、噴石灰水和高嶺土以及果園生草等方式[2,19]，但這些方法不同程度上存在低效、可操縱性差和成本高等問題。本研究中，高溫來臨前期在果實(shí)表面噴施螯合鈣，是一種簡(jiǎn)便有效的預(yù)防蜜橘日灼病害的生產(chǎn)措施。

鈣是植物生長(zhǎng)發(fā)育必需的大量營(yíng)養(yǎng)元素之一，在植物細(xì)胞生理活動(dòng)中，它不僅能維持細(xì)胞壁、細(xì)胞膜和膜結(jié)合蛋白的穩(wěn)定性，還通過鈣信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相關(guān)基因參與調(diào)控許多重要的生理生化過程，從而影響植物對(duì)外界環(huán)境變化的響應(yīng)與適應(yīng)，以增強(qiáng)植物對(duì)逆境的抵抗能力[9,20]。本研究通過蜜橘果皮活性氧測(cè)定和活性氧的高質(zhì)熒光染色發(fā)現(xiàn)，在7—10月高溫和強(qiáng)直射光脅迫下，果皮細(xì)胞產(chǎn)生了過量的ROS，從而產(chǎn)生過多的丙二醛，細(xì)胞膜脂過氧化，細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞，細(xì)胞防御系統(tǒng)崩潰，導(dǎo)致了日灼果實(shí)的發(fā)生。前人研究表明，鈣信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)可以調(diào)節(jié)ROS的生成和清除，使細(xì)胞氧化-還原平衡，增加植物的抗逆性[8]。鈣信號(hào)可以通過CaM控制NAD激酶 (nicotinamide asenine dinucleotide kinase，NADK)的活性，調(diào)節(jié)ROS的產(chǎn)生[21]。水稻中AtNADK2的過表達(dá)提高了NADP/NAD比值，從而提高植物對(duì)氧化損傷的耐受性[22]。本研究結(jié)果表明，鈣處理能明顯刺激CsNADK基因，增加其表達(dá)量，增強(qiáng)植物對(duì)高溫和強(qiáng)直射光脅迫的抵抗力，這與前人研究結(jié)果一致。鈣信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)還可以通過調(diào)節(jié)植物呼吸爆發(fā)氧化酶(respiratory burst oxidase homologue，Rboh，又稱NADPH氧化酶)來間接影響ROS的產(chǎn)生，Rboh是參與植物ROS產(chǎn)生的關(guān)鍵酶，在調(diào)節(jié)NADPH氧化酶活性產(chǎn)生ROS中起到重要作用[23]。有絲分裂原激活的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)是真核生物中的信號(hào)分子，參與許多生物或非生物的脅迫反應(yīng)的過程[24]，MPK8是目前研究較多的MAPK激酶。前人發(fā)現(xiàn)擬南芥中 CAM 會(huì)激活 MPK8，被激活的MPK8 通過轉(zhuǎn)錄控制 RbohD 表達(dá)來負(fù)調(diào)控 ROS 積累，揭示了 CAM 介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)在脅迫下微調(diào) ROS 穩(wěn)態(tài)的新機(jī)制[25]。另外CPKs的磷酸化作用也可以調(diào)節(jié)RBOH的活性[26]，水稻中的OsCPK12通過誘導(dǎo)ROS清除基因OsAPX2/OsAPX8的上調(diào)，抑制OsRBOHI的表達(dá)，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)ROS的平衡，增加水稻的耐鹽性[27]。本研究發(fā)現(xiàn)，鈣處理顯著增加CSMPK8和CSCPK基因的表達(dá)，進(jìn)而顯著降低CSRBOH的相對(duì)表達(dá)量，從而降低了ROS的積累，提高了蜜橘抗日灼的能力。

鈣/鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶(calcium/calmodulin-dependent protein kinases,CaMKs)是真核生物鈣信號(hào)途徑中鈣調(diào)素下游的一類重要靶蛋白，能夠引起眾多代謝的關(guān)鍵酶或轉(zhuǎn)錄因子磷酸化，從而完成對(duì)細(xì)胞代謝活動(dòng)或某些基因表達(dá)的調(diào)節(jié)[28]。在植物中發(fā)現(xiàn)CaMKs有廣泛的作用。如玉米的ZmCCaMK基因可以激活抗氧化防御[29]。在本研究中，鈣處理使CsCAMK1基因顯著上調(diào)，且在逆境中后期表達(dá)量最強(qiáng)，說明CsCAMK1可能參與了蜜橘抗日灼的過程。

在強(qiáng)光和高溫脅迫下，鈣處理降低了南豐蜜橘果實(shí)的日灼發(fā)生率。本研究發(fā)現(xiàn)，鈣處理可促進(jìn)蜜橘果皮細(xì)胞鈣信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相關(guān)基因的表達(dá)，并通過調(diào)控抗氧化系統(tǒng)相關(guān)基因表達(dá)以及抗氧化酶活性，清除細(xì)胞中過量的ROS，維持果皮細(xì)胞ROS代謝相對(duì)平衡，防止或降低了細(xì)胞膜脂過氧化，從而提高蜜橘果實(shí)對(duì)高溫和強(qiáng)光的耐受性。本研究證明了果面噴施螯合鈣防控日灼病害的可行性，為生產(chǎn)上預(yù)防和減輕蜜橘果實(shí)的日灼傷害提供了理論依據(jù)。