茶樹CsbHLH71基因克隆及轉(zhuǎn)錄活性分析

吳應奇，宋小鳳，鄧見田燁，白思蕾,3，李 娟,3，王坤波,3*

(1 湖南農(nóng)業(yè)大學 教育部茶學重點實驗室，長沙 410128；2 湖南農(nóng)業(yè)大學 國家植物功能成分利用工程技術研究中心，植物功能成分利用省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，長沙 410128；3 湖南農(nóng)業(yè)大學 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部園藝作物基因資源評價利用重點實驗室，長沙 410128)

茶樹[Camelliasinensis(L.)O.Kuntze]起源于中國西南地區(qū)，是世界廣泛種植的一種葉用經(jīng)濟作物[1]。茶樹中積累的次生代謝產(chǎn)物對茶葉的品質(zhì)具有十分重要的作用[2]。兒茶素是茶樹中一種主要的類黃酮次生代謝產(chǎn)物，是茶葉中造成苦、澀味的主要物質(zhì)[3]。研究發(fā)現(xiàn)，向茶樹葉面噴施微生物肥，有利于提高茶葉中氨基酸含量，降低酚氨比，提升茶葉的感官品質(zhì)[4]和產(chǎn)量[5]。解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)是一種根際促生菌和有益內(nèi)生菌，常被制成微生物菌肥用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)[6]。然而，目前關于解淀粉芽孢桿菌微生物肥影響茶樹中兒茶素生物合成的分子調(diào)控機制尚不明晰。

轉(zhuǎn)錄因子(transcription factors)，也稱為反式作用因子，是一組能夠與靶基因啟動子區(qū)域中順式作用元件發(fā)生特異性相互作用從而調(diào)控靶基因表達的蛋白質(zhì)[7]。堿性螺旋環(huán)螺旋(basic helix-loop-helix，bHLH)是植物體內(nèi)僅次于MYB的第二大類真核轉(zhuǎn)錄因子家族[8]，廣泛參與植物的生長發(fā)育[9]、次生代謝生物合成[10]、非生物脅迫響應[11]和新陳代謝[12]等過程。研究發(fā)現(xiàn)，bHLH蛋白在茶樹類黃酮次生代謝過程中扮演重要角色[13]，能調(diào)控茶樹類黃酮次生代謝產(chǎn)物如兒茶素的合成[14]，從而影響茶葉的感官品質(zhì)。茶樹是一個遺傳性十分復雜的植物，轉(zhuǎn)錄因子在茶樹中的研究起步較晚，bHLH轉(zhuǎn)錄因子在茶樹體內(nèi)轉(zhuǎn)錄調(diào)控的分子機理還不清晰。因此明確茶樹類黃酮代謝途徑中的分子機理、挖掘茶樹轉(zhuǎn)錄調(diào)控相關基因，對于闡明兒茶素生物合成的分子機制，進一步推動茶樹轉(zhuǎn)錄水平的代謝調(diào)控機制和推動特異性茶樹種質(zhì)資源的開發(fā)利用具有重要意義[15]。

本研究以葉面噴施不同濃度微生物肥的茶樹鮮葉為原料，結(jié)合茶樹中兒茶素含量與轉(zhuǎn)錄組(RNA-seq)數(shù)據(jù)，篩選出了一個與兒茶素含量高度負相關的bHLH家族轉(zhuǎn)錄因子CsbHLH71。通過PCR克隆得到茶樹CsbHLH71轉(zhuǎn)錄因子的全長CDS序列，并利用生物信息學分析該基因的結(jié)構(gòu)、理化特征、進化關系及轉(zhuǎn)錄活性等，為進一步探究bHLH轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控茶樹中兒茶素生物合成的分子機制奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

‘碧香早’茶樹種植于湖南農(nóng)業(yè)大學長安基地，微生物肥生態(tài)液(甘肅尚農(nóng)生物科技有限公司，白銀，甘肅，中國)有效成分為解淀粉芽孢桿菌EZ99，有效活菌數(shù)≥250億/mL。將微生物肥分別稀釋1 000(C1)和2 000(C2)倍，于夏季(6月)對統(tǒng)一修剪后的茶樹進行葉面噴施，共噴施3次，每次間隔7 d，對照組(CK)進行噴水處理。待新梢萌發(fā)后，采摘茶樹的一芽二葉葉片，迅速使用液氮冷凍處理，于-80 ℃儲藏備用。

1.2 方 法

1.2.1 茶樹CsbHLH71基因CDS序列克隆利用Primer Premier 5.0設計CDS克隆引物(表1)，委托北京擎科生物科技有限公司進行引物合成。采用植物總RNA提取試劑盒提取‘碧香早’茶樹鮮葉總RNA，逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，以cDNA為模板克隆目的基因，送北京擎科生物有限公司測序。

表1 本研究所用引物Table 1 Primers used in this study

1.2.2 茶樹CsbHLH71基因生物信息學分析利用NCBI在線工具對茶樹CsbHLH71蛋白氨基酸序列進行分析，在線軟件SOPMA和SWISS-MODEL分別預測蛋白序列的二、三級結(jié)構(gòu)。利用在線軟件ExPASy中的ProtParam tool工具分析蛋白的理化性質(zhì)，TMHMM server V.2.0在線工具分析CsbHLH71蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)。通過在線網(wǎng)站NCBI中Blast查找與茶樹CsbHLH71蛋白同源序列，多序列比對采用DNAMAN軟件，并利用MEGA 7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。Cell-PLoc 2.0在線預測CsbHLH71蛋白定位情況。

1.2.3 茶樹CsbHLH71基因表達分析以‘碧香早’茶樹鮮葉總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成的第一鏈cDNA為模板進行實時熒光定量PCR(引物見表1)，以β-actin為內(nèi)參基因，3次生物學重復，采用2-ΔΔCT法[16]分析CsbHLH71基因在不同處理中的相對表達量。

1.2.4 茶樹CsbHLH71蛋白的亞細胞定位為了驗證CsbHLH71蛋白的亞細胞定位情況，將其通過同源重組法構(gòu)建到pEAQ-GFP載體上并導入農(nóng)桿菌中，注射到本氏煙草葉片中，適宜條件下培養(yǎng)48～72 h后，通過熒光顯微鏡觀察GFP信號并拍照記錄。具體參照程美女[17]實驗方法。

1.2.5 茶樹CsbHLH71蛋白的轉(zhuǎn)錄活性分析采用酵母分析系統(tǒng)及DLR煙草瞬時表達試驗分析CsbHLH71蛋白的轉(zhuǎn)錄活性。1)酵母體內(nèi)轉(zhuǎn)錄活性分析：將CsbHLH71基因構(gòu)建到pGBKT載體上，將其轉(zhuǎn)入到酵母感受態(tài)中，涂布至SD/-Trp和SD/-Trp/-Ade/-His缺陷篩選培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)2～3 d。2)煙草體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄活性分析：將CsbHLH71基因構(gòu)建到35S驅(qū)動的pBD載體上，作為Effector質(zhì)粒，Reporter質(zhì)粒為35S驅(qū)動的REN。將構(gòu)建好的pBD-CsbHLH71質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中，將含有Reporter和Effector的農(nóng)桿菌按1∶9的比例充分混勻，注射到本氏煙草，培養(yǎng)2～3 d，檢測兩種熒光素酶的比值(LUC/REN)。具體實驗操作參照羅勇[18]的方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶樹CsbHLH71基因的CDS克隆與生物信息學分析

對噴施濃度梯度微生物肥的‘碧香早’茶樹一芽二葉進行RNA-seq測序，對RNA-seq數(shù)據(jù)(未公開)進行差異基因篩選，發(fā)現(xiàn)CsbHLH71基因(TEA030725.1)與CK組相比，基因的表達量明顯上升，且與葉片中兒茶素含量高度負相關。因此，我們設計了CsbHLH71的PCR特異性引物，從‘碧香早’茶樹中克隆了該轉(zhuǎn)錄因子，擴增后得到約912 bp大小的片段。

ProtParam tool在線工具分析顯示，CsbHLH71基因編碼303個氨基酸，化學式為C1461H2371N419O455S15，蛋白分子量為33.6 kD，理論等電點為8.12，脂肪系數(shù)87.33，總平均親水指數(shù)(GRAVY)為-0.280，不穩(wěn)定系數(shù)59.00，是一種不穩(wěn)定的親水性蛋白。分析該基因編碼蛋白的氨基酸組成，發(fā)現(xiàn)Leu(10.3%)和Ser(8.9%)含量較多，Trp(0.3%)和Cys(2.3%)等含量相對較少，帶正電荷的殘基總數(shù)(Arg+Lys)有34個，帶負電荷的殘基總數(shù)(Asp+Glu)有32個。

CsbHLH71蛋白跨膜結(jié)構(gòu)分析表明，該蛋白的303個氨基酸都位于細胞膜，跨膜螺旋氨基酸殘基數(shù)量的期望值是0.538 08，跨膜螺旋數(shù)量為0，CsbHLH71蛋白不是跨膜蛋白。通過NCBI對氨基酸序列進行分析，發(fā)現(xiàn)CsbHLH71蛋白包含一個從101-160位的堿性螺旋-環(huán)-螺旋(bHLH)保守結(jié)構(gòu)域，屬于bHLH家族蛋白。

CsbHLH71蛋白的二級結(jié)構(gòu)預測表明，此蛋白303個氨基酸包含47.52%無規(guī)則卷曲，40.59%α-螺旋，9.24%的延長鏈，2.64%β轉(zhuǎn)角(圖1，A)。使用SWISS-MODEL預測CsbHLH71蛋白的三維結(jié)構(gòu)與二級結(jié)構(gòu)預測的結(jié)果一致，該蛋白的三維空間結(jié)構(gòu)主要是螺旋和卷曲(圖1，B)。

A(藍色.α螺旋；紅色.延伸帶；綠色.β轉(zhuǎn)角；紫色.無規(guī)則卷曲)圖1 CsbHLH71蛋白的二級結(jié)構(gòu)(A)和三級結(jié)構(gòu)(B)A(Alpha helix,extended strand,beta turn and random coil are represented by blue,red,green and purple,respectively)Fig.1 The prediction of secondary structure (A) and tertiary structure (B)

將CsbHLH71蛋白氨基酸序列上傳到NCBI數(shù)據(jù)庫進行Blast比對，發(fā)現(xiàn)CsbHLH71蛋白具有典型的bHLH結(jié)構(gòu)域，與其他植物bHLH氨基酸序列相似，這表明不同植物bHLH氨基酸序列保守性較高，只有少部分的結(jié)構(gòu)域發(fā)生了細微變異(圖2)。系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果(圖3)顯示，CsbHLH71蛋白與中國獼猴桃變種、杜鵑花的親緣關系最近，而與櫟木、核桃的進化距離較遠。

CsbHLH71.茶樹；AcbHLH71-like.中華獼猴桃變種；DzbHLH71-like.榴蓮；JrbHLH71-like.核桃；PtbHLH71.毛果楊；PvbHLH71-like.黃連木；QlbHLH71-like.櫟木；RgRHGRI-protein.杜鵑花；VrbHLH71-like.河濱葡萄；VvbHLH71.葡萄圖2 CsbHLH71蛋白與其他物種氨基酸序列同源比對CsbHLH71.Camellia sinensis；AcbHLH71-like.Actinidia chinensis var.chinensis；DzbHLH71-like.Durio zibethinus；JrbHLH71-like.Juglans regia；PtbHLH71.Populus trichocarpa；PvbHLH71-like.Pistacia vera；QlbHLH71-like.Quercus lobata；RgRHGRI-protein.Rhododendron griersonianum；VrbHLH71-like.Vitis riparia；VvbHLH71.Vitis viniferaFig.2 Multiple alignment of CsbHLH71 protein with other bHLH71 proteins of other species

圖3 CsbHLH71蛋白與不同植物進化關系Fig.3 Phylogenetic relationships between CsbHLH71 protein and other species bHLH71 proteins

2.2 茶樹CsbHLH71基因表達分析

為驗證轉(zhuǎn)錄組中CsbHLH71基因的表達結(jié)果，我們利用qRT-PCR進行了驗證。結(jié)果(圖4)表明，在不同濃度微生物肥處理后，CsbHLH71基因表達水平顯著上調(diào)，但在1 000倍中上調(diào)趨勢更為顯著，說明微生物稀釋1 000倍處理對CsbHLH71基因表達更加明顯，這與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)一致。

CK.對照，噴施蒸餾水；C1和C2分別指葉面噴施稀釋1 000倍和2 000倍的微生物肥；*與**分別表示與對照組(CK)相比差異顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)圖4 不同菌肥處理茶樹鮮葉中CsbHLH71基因的表達CK.Spraying with distilled water;C1 and C2.1 000 fold and 2 000 fold dilution;* and ** mean significant (P<0.05)and extremely significant (P<0.01) differences compared with CK,respectivelyFig.4 Expression of CsbHLH71 gene in leaves of Camellia sinensis under different microbial fertilizer treatments

2.3 茶樹CsbHLH71蛋白的亞細胞定位

Cell-PLoc 2.0在線預測表明CsbHLH71蛋白可能定位于細胞核。對浸染農(nóng)桿菌的煙草葉片拍照記錄，發(fā)現(xiàn)陽性對照GFP整個細胞都能觀察到綠色熒光，而侵染了CsbHLH71-GFP的煙草只在細胞核中觀察到綠色熒光(圖5)，說明CsbHLH71蛋白定位于細胞核，屬于核蛋白。

圖5 CsbHLH71蛋白亞細胞定位Fig.5 Subcellular localization of CsbHLH71 protein

2.4 茶樹CsbHLH71蛋白的轉(zhuǎn)錄活性分析

在酵母體內(nèi)(圖6，A)，轉(zhuǎn)化菌株在SD/-Trp缺素培養(yǎng)基上均正常生長，在SD/-Trp/-Ade/-His上只有陽性對照P-53的酵母菌株可以正常生長，且X-α-Gal活性檢測變藍，而陰性對照DBD-Empty和DBD-CsbHLH71的酵母菌株均不能正常生長，說明CsbHLH71蛋白在酵母內(nèi)為抑制活性；在煙草體內(nèi)(圖6，B、C)，pBD-CsbHLH71 LUC/REN數(shù)值比陰性對照pBD-Empty低。說明茶樹CsbHLH71蛋白在煙草體內(nèi)表現(xiàn)出轉(zhuǎn)錄抑制活性，屬于轉(zhuǎn)錄抑制子。這些結(jié)果表明CsbHLH71蛋白在茶樹中可能通過抑制下游基因的表達行使功能。

3 討 論

茶樹次生代謝過程中轉(zhuǎn)錄因子起著重要調(diào)控作用[19]。例如，Gong等[20]發(fā)現(xiàn)日照強度通過影響bHLH、MYB、NAC等轉(zhuǎn)錄因子影響黃酮類化合物合成途徑中重要基因，如CHS、F3′5′H、SCPL和DFR的表達，導致茶葉中兒茶素在三個季節(jié)的含量不同。Liu等[21]發(fā)現(xiàn)遮陰降低了茶樹中兒茶素和黃酮醇的含量，與其生物合成相關的功能基因F3′H、FLS、ANS、ANR、LAR、DFR和CHS及轉(zhuǎn)錄因子MYB4、MYB12、MYB14和MYB111表達水平同時下調(diào)。

**表示與陰性對照比差異顯著(P<0.05)圖6 CsbHLH71蛋白在酵母(A)和煙草(B、C)的轉(zhuǎn)錄活性分析** means significant difference compared with contrast (P<0.05)Fig.6 Transcriptional activity analysis of CsbHLH71 protein in yeast cell assays (A) and tobacco (B,C)

本研究通過RNA-seq測序并從中篩選獲得一個茶樹CsbHLH71基因，生物信息學分析表明，CsbHLH71蛋白長度為303個氨基酸，含有一個59位的堿性螺旋-環(huán)-螺旋(bHLH)保守結(jié)構(gòu)域，屬于bHLH蛋白家族。氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn)，在不同植物中bHLH家族氨基酸序列相似性較高，只有少數(shù)有細微變異，說明CsbHLH71蛋白在進化中相對保守，但不同植物的bHLH蛋白在進化過程中呈現(xiàn)出了多樣性。qRT-PCR分析表明，茶樹在微生物肥稀釋噴施處理下，CsbHLH71基因表達水平明顯高于未施肥的CK組，但在稀釋2 000倍處理中CsbHLH71基因的表達水平雖然較CK組有所上升，但不如1 000倍處理下效果顯著，說明高濃度的微生物肥可能促進茶樹CsbHLH71基因的表達。

亞細胞定位顯示CsbHLH71蛋白和大多數(shù)轉(zhuǎn)錄因子蛋白一樣定位于細胞核，是一個核蛋白，在細胞核內(nèi)行使轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能。研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄因子并非都是轉(zhuǎn)錄激活因子，也會阻遏目的基因的表達，起負調(diào)控作用。Xu等[22]在銀杏中發(fā)現(xiàn)了GbMYBF2負調(diào)控類黃酮合成，并通過遺傳轉(zhuǎn)化證實了它的功能。Luo等[23-24]在茶樹中發(fā)現(xiàn)CsbHLH62、CsWRKY31和CsWRKY48能夠抑制CsLAR、CsDFR和CCoAOMT，從而負調(diào)控EGCG3″Me的積累。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)CsbHLH71蛋白在酵母細胞中具有轉(zhuǎn)錄抑制活性，并通過在煙草的轉(zhuǎn)錄活性分析驗證了這一結(jié)果，證實了CsbHLH71蛋白具有轉(zhuǎn)錄抑制劑的功能，可能負調(diào)控茶樹類黃酮代謝合成產(chǎn)物兒茶素積累。CsbHLH71基因的表達水平與兒茶素含量呈負相關，猜測CsbHLH71基因可能參與了茶樹類黃酮代謝調(diào)控兒茶素的生物合成。通過分析本課題組前期運用高效液相色譜法檢測不同濃度微生物肥噴施處理下茶樹類黃酮代謝產(chǎn)物兒茶素含量發(fā)現(xiàn)，部分兒茶素合成相關功能基因的表達水平受到了明顯抑制。因此推測，CsbHLH71基因通過參與茶樹類黃酮次生代謝，影響兒茶素合成相關基因的合成通路，但其與茶樹兒茶素合成功能基因之間的調(diào)控關系還需要進一步研究。

研究發(fā)現(xiàn)，bHLH轉(zhuǎn)錄因子還能與MYB、WD40合作形成三元MBW復合體來參與調(diào)控次生代謝產(chǎn)物的合成。Zhao等[25]發(fā)現(xiàn)MBW三元復合體可控制黃酮類化合物合成途徑中的多個酶促步驟。Chen等[26]發(fā)現(xiàn)R2R3-MYB蛋白可以直接結(jié)合靶基因的啟動子或作用于MBW復合物以抑制花青素的生物合成。Liu等[27]發(fā)現(xiàn)茶樹中MBW復合體能調(diào)節(jié)花青素和原花青素的積累。通過分析兒茶素合成的一些關鍵功能基因啟動子發(fā)現(xiàn)，序列中包含大量可以與bHLH、MYB、WRKY等轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的元素，如G-Box、E-Box、W-Box等，推測CsbHLH71蛋白可能存在與其他轉(zhuǎn)錄因子蛋白之間相互作用，形成復合體共同調(diào)控兒茶素的合成。未來將繼續(xù)通過凝膠阻滯遷移實驗(EMSA)、染色質(zhì)免疫共沉淀(CHIP-qPCR)等方法，對CsbHLH71基因進行深入研究，以揭示CsbHLH71基因調(diào)控兒茶素合成的分子機制。