經(jīng)典名方陽和湯指紋圖譜及功效關聯(lián)物質預測分析

張澤康，張 晴，竇敏航，王昌海，趙玥瑛，席 鋮，張馨雨，孫 萌，董 爽，杜守穎，白 潔，陸 洋

經(jīng)典名方陽和湯指紋圖譜及功效關聯(lián)物質預測分析

張澤康，張 晴，竇敏航，王昌海，趙玥瑛，席 鋮，張馨雨，孫 萌，董 爽，杜守穎，白 潔*，陸 洋*

北京中醫(yī)藥大學中藥學院，北京 102488

基于指紋圖譜及網(wǎng)絡藥理學，建立陽和湯指紋圖譜檢測方法，并對其功效關聯(lián)物質進行預測分析，為陽和湯質量控制提供參考依據(jù)。采用HPLC建立陽和湯指紋圖譜，對共有峰進行歸屬和指認，并運用網(wǎng)絡藥理學構建陽和湯“成分-靶點-通路”網(wǎng)絡關系圖，進一步佐證陽和湯功效成分選擇的合理性。陽和湯的HPLC指紋圖譜共標定15個共有峰，通過對照品指認出2號峰5-羥甲基糠醛、5號峰芥子堿硫氰酸鹽、8號峰甘草苷、9號峰毛蕊花糖苷、11號峰肉桂酸、12號峰桂皮醛、13號峰甘草酸、15號峰鹽酸麻黃堿8個共有色譜峰，相似度均＞0.83，主要藥效物質群可以從藥材-飲片-基準樣品逐級較為完整的傳遞，且歸屬關系清晰明確；采用網(wǎng)絡藥理學對篩選出的8個活性成分進行“成分-靶點-通路”網(wǎng)絡構建與分析，富集的通路中包括癌癥信號通路、脂質和動脈粥樣硬化信號通路、鞘脂信號通路、甲狀腺激素信號通路等。根據(jù)成分、靶點以及通路之間的連接度，初步預測甘草酸、甘草苷、桂皮醛、肉桂酸、毛蕊花糖苷、芥子堿硫氰酸鹽、鹽酸麻黃堿7個活性成分可能通過調節(jié)這些信號通路達到溫陽補血、散寒通滯的作用。通過HPLC指紋圖譜結合網(wǎng)絡藥理學分析預測陽和湯治療疾病的潛在功效關聯(lián)物質，建立的方法操作便捷，穩(wěn)定性好，可用于陽和湯的質量控制，也為深入研究陽和湯的質量標準和作用機制提供參考。

經(jīng)典名方；陽和湯；指紋圖譜；網(wǎng)絡藥理學；功效關聯(lián)物質；芥子堿硫氰酸鹽；5-羥甲基糠醛；甘草苷；毛蕊花糖苷；肉桂酸；桂皮醛；甘草酸；鹽酸麻黃堿

經(jīng)典名方是我國歷代醫(yī)家智慧的結晶，為推動經(jīng)典名方現(xiàn)代化，國家藥品監(jiān)督管理局于2020年發(fā)布了《中藥注冊分類及申報資料要求》[1]通告，其中將中藥注冊分類中的第3類古代經(jīng)典名方中藥復方制劑細分為“3.1按古代經(jīng)典名方目錄管理的中藥復方制劑”及“3.2其他來源于古代經(jīng)典名方的中藥復方制劑（以下簡稱‘3.2類’）”，3.2類包括未按古代經(jīng)典名方目錄管理的古代經(jīng)典名方中藥復方制劑和基于古代經(jīng)典名方加減化裁的中藥復方制劑，加強了對古典醫(yī)籍精華的梳理和挖掘。為保證經(jīng)典名方復方制劑質量療效一致性，需構建藥材、飲片、基準樣品、制劑全過程的質量控制體系；為建立系統(tǒng)全面的質量檢測方法，指紋圖譜被列為質量評價的重要指標；為保障質量評價指標的科學性，需確認影響其品質的功效關聯(lián)物質[2]。陽和湯出自清代王洪緒所著《外科證治全生集》，由熟地黃、鹿角膠、肉桂、炒白芥子、麻黃、姜炭、甘草7味藥組成，具有溫陽補血、散寒通滯的功效，主治陰疽。在現(xiàn)代臨床中，陽和湯及其加減方常用于治療乳腺癌等惡性腫瘤。

近年來，對于陽和湯的研究主要集中在對乳腺癌、糖尿病足病、心血管系統(tǒng)疾病、骨關節(jié)疾病等患者臨床療效的研究以及治療機制的探討，而關于其質量控制方面的文獻報道較少，僅有竇建衛(wèi)等[3-6]從成分定量分析、薄層色譜定性鑒別等方法對陽和湯全方中的部分單味藥進行了質量研究，方法較為常規(guī)，且存在不足，如單味藥基原、處方劑量等均缺乏考證，質量控制研究僅從單味藥出發(fā)，缺乏對復方多成分、多靶點綜合作用的觀念等?；诖?，本課題借鑒《古代經(jīng)典名方中藥復方制劑及其物質基準的申報資料要求（征求意見稿）》[7]相關內容，從整體性出發(fā)建立了陽和湯藥材、飲片及基準樣品的HPLC指紋圖譜，并整合多學科技術方法，基于可測性、可追溯性、有效性綜合預測，分析陽和湯治療陽虛寒痰凝聚的功效關聯(lián)物質，為后期陽和湯復方制劑全方位的質量控制及其作用機制研究奠定基礎。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Thermo Fisher U3000高效液相色譜儀，DAD檢測器，CM7.2色譜工作站，賽默飛世爾科技（中國）有限公司；BSA 224S萬分之一電子分析天平，賽多利斯科學儀器北京有限公司；JM-B100002十萬分之一電子天平，余姚市紀銘稱重校驗設備有限公司；H22-X3型九陽電陶爐，杭州九陽生活電器有限公司；SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長城科工貿有限公司；KQ5200DA型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；FD-2A真空冷凍干燥機，北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司；DZF-6051型真空干燥器，北京利康達圣科技有限公司。

1.2 試藥

對照品5-羥甲基糠醛（批號H12M9Z61023，質量分數(shù)≥98.0%），購自上海源葉生物科技有限公司；對照品毛蕊花糖苷（批號111530-201914，質量分數(shù)95.2%）、桂皮醛（批號110710-202022，質量分數(shù)98.7%）、肉桂酸（批號110786-201604，質量分數(shù)98.8%）、芥子堿硫氰酸鹽（批號111702- 202006，質量分數(shù)99.0%）、鹽酸麻黃堿（批號171241-201809，質量分數(shù)100.0%）、甘草苷（批號111610-201908，質量分數(shù)95.0%）、甘草酸銨（批號110731-202021，質量分數(shù)96.2%），均購自中國食品藥品檢定研究院。乙腈、磷酸，色譜純，美國Fisher公司；甲醇、三乙胺，分析純，北京化工廠；純凈水，杭州娃哈哈集團有限公司；其他試劑均為分析純。

陽和湯由熟地黃、鹿角膠、肉桂、炒白芥子、麻黃、姜炭和甘草7味藥組成，其藥材均購自道地產(chǎn)區(qū)或主產(chǎn)區(qū)。生地黃、肉桂、芥子、麻黃、干姜和甘草藥材經(jīng)北京中醫(yī)藥大學劉春生教授鑒定，分別為玄參科地黃屬植物地黃Libosch.的新鮮或干燥塊根、樟科樟屬植物肉桂Presl的干燥樹皮、十字花科白芥屬植物白芥L.的干燥成熟種子、麻黃科麻黃屬植物草麻黃Stapf的干燥草質莖、姜科姜屬植物姜Rosc.的干燥根莖、豆科甘草屬植物甘草Fisch.的干燥根和根莖。

本實驗前期已按照《中國藥典》2020年版各單味藥材項下的檢測方法對藥材進行檢測，含量均符合要求。按照《中國藥典》2020年版各單味藥材項下的飲片炮制要求炮制成肉桂、炒白芥子、麻黃、姜炭及甘草飲片（熟地黃、鹿角膠飲片由健民藥業(yè)集團股份有限公司提供）。經(jīng)檢測飲片均符合《中國藥典》2020年版項下相關規(guī)定。利用隨機數(shù)表法將熟地黃、肉桂、炒白芥子、麻黃、姜炭、甘草6味飲片的不同批次隨機組合，陽和湯批次組合具體信息見表1（其中15批次陽和湯組合信息中鹿角膠的批號均為20210901）。

表1 陽和湯組合信息

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱為Zorbax SB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為乙腈-0.05%磷酸水溶液（含0.05%三乙胺溶液），梯度洗脫：0～5 min，2%～3%乙腈；5～15 min，3%～5%乙腈；15～65 min，5%～30%乙腈；65～90 min，30%～70%乙腈；體積流量1.0 mL/min；檢測波長210、260 nm；柱溫35 ℃；進樣量10 μL。

2.2 對照品溶液的制備

取各對照品適量，精密稱定，加50%甲醇配制成含5-羥甲基糠醛17.90 μg/mL、毛蕊花糖苷17.72 μg/mL、桂皮醛22.64 μg/mL、肉桂酸13.47 μg/mL、芥子堿硫氰酸鹽19.88 μg/mL、鹽酸麻黃堿19.78 μg/mL、甘草苷15.60 μg/mL、甘草酸14.60 μg/mL的混合對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

根據(jù)本課題組前期確定的處方比例[8]稱取7味飲片量：熟地黃37.3 g、鹿角膠11.2 g、肉桂3.7 g、炒白芥子7.5 g、麻黃1.9 g、姜炭1.9 g、甘草3.7 g。置陶瓷鍋中，加水450 mL，以武火（600 W）煮沸后，調節(jié)火力至200 W煎煮30 min，趁熱用300目無紡布濾過，藥渣再加水336 mL，同法煎煮30 min，合并2次濾液（將鹿角膠烊化至濾液中），放涼后加水調整體積至600 mL，精密移取煎液5 mL于20 mL西林瓶中，置于冷凍干燥機中冷凍干燥48 h，凍干溫度?80 ℃，真空度（5±1）Pa。取出壓蓋密塞，即得陽和湯基準樣品凍干粉。

取陽和湯基準樣品凍干粉適量，置10 mL容量瓶中，加50%甲醇至刻度，搖勻，室溫放置10 min，于10 000 r/min離心5 min，濾過，取續(xù)濾液，即得陽和湯基準樣品供試品溶液。

2.4 方法學考察

2.4.1 參照峰選擇 在本實驗所建立的指紋圖譜中，芥子堿硫氰酸鹽化學性質穩(wěn)定，峰面積居中且穩(wěn)定、分離度佳、峰形對稱、保留時間適中，因此，選擇芥子堿硫氰酸鹽為參照峰（s），以計算其余峰的相對峰面積和相對保留時間。

2.4.2 精密度試驗 取陽和湯基準樣品凍干粉適量，按照“2.3”項下方法制備供試品溶液，連續(xù)進樣6次，按照“2.1”項下色譜條件進行測定，記錄色譜圖。以芥子堿硫氰酸鹽為參照峰，計算各個共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結果表明，各共有峰的相對保留時間RSD均＜0.75%，相對峰面積RSD均＜2.10%，表明儀器精密度良好。

2.4.3 重復性試驗 取陽和湯基準樣品凍干粉適量，按照“2.3”項下方法制備供試品溶液，平行制備6份，按照“2.1”項下色譜條件進行測定，記錄色譜圖。以芥子堿硫氰酸鹽為參照峰，計算各個共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結果表明，各共有峰的相對保留時間RSD均＜小于0.23%，相對峰面積RSD均＜3.05%，表明該方法的重復性良好，可用于陽和湯指紋圖譜的檢測。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗 取陽和湯基準樣品凍干粉適量，按照“2.3”項下方法制備供試品溶液，分別在制備后0、2、4、6、8、10、12、24 h進樣，按照“2.1”項下色譜條件進行測定，記錄色譜圖。以芥子堿硫氰酸鹽為參照峰，計算各個共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結果表明，各共有峰的相對保留時間RSD均＜0.12%，相對峰面積RSD均＜2.34%，表明供試品溶液在24 h內穩(wěn)定。

2.5 陽和湯基準樣品指紋圖譜的建立及相似度評價

取15批陽和湯基準樣品供試品溶液與對照品溶液按色譜條件進行測定，記錄色譜圖。通過《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2012版）軟件，以S1為參照峰，采用中位數(shù)法，進行多點校正和色譜峰匹配，得到15批陽和湯基準樣品指紋圖譜疊加圖、共有模式圖和混合對照品圖，共確認15個共有峰，指認8個色譜峰。結果見圖1、2。

與對照指紋圖譜相比，11批陽和湯基準樣品指紋圖譜的相似度均＞0.90，表明陽和湯基準樣品的相似度良好，主要物質群差異性小，制備工藝較為科學合理，形成的基準樣品對照圖譜能夠作為衡量陽和湯基準樣品的標準參照物，結果見表2。其中S1、S5、S6、S15相似度較低，本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)[8]，熟地黃飲片中5-羥甲基糠醛的含量對相似度結果影響較大，因此，后期研究中需嚴格控制熟地黃飲片的質量，從而保證陽和湯基準樣品的整體質量。

2.6 陽和湯基準樣品指紋圖譜共有峰的歸屬

按供試品制備方法分別制備單味飲片供試品溶液、缺單味飲片供試品溶液和陽和湯基準樣品供試品溶液。取陽和湯基準樣品、單味飲片、缺單味飲片供試品溶液按“2.1”項色譜條件進行測定，記錄色譜圖。分別將陽和湯基準樣品、單味飲片、缺單味飲片供試品溶液的色譜圖進行疊加比較，對陽和湯基準樣品指紋圖譜的色譜峰進行歸屬分析，結果見圖3和表3。

圖1 15批陽和湯基準樣品的指紋圖譜疊加圖

2-5-羥甲基糠醛 5-芥子堿硫氰酸鹽 8-甘草苷 9-毛蕊花糖苷 11-肉桂酸 12-桂皮醛 13-甘草酸 15-鹽酸麻黃堿

表2 15批陽和湯基準樣品HPLC指紋圖譜相似度

根據(jù)圖3和表3對陽和湯基準樣品指紋圖譜中各共有峰進行歸屬分析，陽和湯基準樣品指紋圖譜共確認15個色譜峰，均可以在原料飲片中找到明確歸屬。具體歸屬情況為1、2、9號峰歸屬于熟地黃飲片；11、12號峰歸屬于肉桂飲片；3～7號峰歸屬于炒白芥子飲片；15號峰歸屬于麻黃飲片；8、10、13、14號峰歸屬于甘草飲片。經(jīng)對照品比對指認8個色譜峰，分別為2號峰5-羥甲基糠醛、5號峰芥子堿硫氰酸鹽、8號峰甘草苷、9號峰毛蕊花糖苷、11號峰肉桂酸、12號峰桂皮醛、13號峰甘草酸和15號峰鹽酸麻黃堿，主要藥效成分的指認率為53.3%。綜上可知，陽和湯基準樣品的物質群可清晰的追溯到飲片，且色譜峰歸屬明確，指認率較高。

從色譜峰個數(shù)與峰強度看，炒白芥子對指紋圖譜的貢獻最大，甘草、熟地黃、肉桂和麻黃對指紋圖譜的貢獻度依次遞減，姜炭對指紋圖譜的貢獻最低。姜炭主要含揮發(fā)油類，其指標性成分6-姜辣素在飲片炮制過程中損失嚴重，導致含量大幅度下降，在陽和湯煎煮過程中由飲片轉移至凍干粉的量極少，在此色譜條件下未檢測出色譜峰。因此，姜炭飲片在本實驗色譜條件下難以獲得指紋圖譜信息。

2.7 基于網(wǎng)絡藥理學的陽和湯功效關聯(lián)物質預測分析

2.7.1 基于可測性及可追溯性的活性成分篩選 根據(jù)文獻研究，熟地黃為陽和湯君藥，其主要活性成分為環(huán)烯醚萜類和苯乙醇類化合物，包括梓醇、毛蕊花糖苷、地黃苷D、5-羥甲基糠醛、地黃多糖等，具有抗腫瘤、調節(jié)血糖血脂、提高免疫、抗心肌缺血及保護中樞神經(jīng)等藥理作用[9]；鹿角膠的主要活性成分為動物蛋白、氨基酸和微量元素（鈣、鎂、鋅、鐵、銅、錳等）等，具有補血活血、抗骨質疏松等藥理作用[10]；肉桂的主要活性成分為揮發(fā)油類，具有抗菌抗炎、抗病毒等藥理作用[11]；炒白芥子的主要活性成分為白芥子苷及其衍生物和脂肪酸類等，具有鎮(zhèn)咳、祛痰、平喘、抗炎鎮(zhèn)痛等藥理作用[12]；麻黃的主要活性成分為生物堿類，具有發(fā)汗、鎮(zhèn)咳平喘、抗菌等藥理作用[13]；姜炭的主要活性成分為姜辣素類，具有止嘔等藥理作用[14]；甘草的主要活性成分為三萜類和黃酮類，具有抗腫瘤、抗菌抗炎、抗動脈粥樣硬化等藥理作用[15]。

圖3 陽和湯專屬性色譜圖

表3 陽和湯共有峰歸屬

《中國藥典》2020年版對于組方藥的控制主要為熟地黃的地黃苷D，鹿角膠的-羥脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、-脯氨酸，肉桂的桂皮醛，炒白芥子的芥子堿硫氰酸鹽，麻黃的鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿，姜炭的6-姜辣素，甘草的甘草苷、甘草酸。基于文獻研究及指紋圖譜的可測性和可追溯性，確定指紋圖譜中指認出的5-羥甲基糠醛、毛蕊花糖苷、桂皮醛、肉桂酸、芥子堿硫氰酸鹽、鹽酸麻黃堿、甘草苷、甘草酸8個活性成分為候選化合物。通過Pubchem Compound化合物數(shù)據(jù)庫（https://pubchem. ncbi.nlm.nih.gov/）獲取8個候選化合物的Canonical SMILES編號，為后續(xù)陽和湯“成分-靶點-通路”網(wǎng)絡的構建做準備。

2.7.2 蛋白-蛋白互作（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡構建 將8個候選化合物的Canonical SMILES編號導入swiss target prediction數(shù)據(jù)庫（http://www.swisstargetprediction.ch/）進行對應的靶點預測，去除重復靶點，獲得8個候選化合物共涉及469個作用靶點。將篩選出的469個作用靶點，導入STRING數(shù)據(jù)庫（https://cn.string-db.org/），選擇物種為“Homo sapiens”，選擇最高置信度蛋白交互參數(shù)評分值＞0.9的蛋白互作數(shù)據(jù)，獲得PPI網(wǎng)絡圖，見圖4。

將PPI網(wǎng)絡圖以TSV格式導入Cytoscape 3.8.0軟件，并利用此軟件篩選出度值≥24，介數(shù)中心性和接近中心性均大于中位數(shù)的靶點作為核心靶點，經(jīng)篩選得到88個核心靶點，結果見表4。

2.7.3 基因本體（gene ontology，GO）功能富集分析和京都基因和基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路分析 將篩選得到的88個核心靶點利用Metascape數(shù)據(jù)庫（https://metascape.org/gp/index.html）對其進行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。選擇物種為“Homo sapiens”，富集分析均以＜0.01具有統(tǒng)計學意義。GO功能富集分析可以用于描述靶點在生物過程（biological process，BP）、細胞組分（cell component，CC）和分子功能（molecular function，MF）3大層面上的功能，共得到60個GO條目，如圖5所示，其中BP占20個，CC占20個，MF占20個。BP顯著富集在細胞對氮化合物的反應、對激素的反應、蛋白質磷酸化的正調節(jié)、細胞對有機環(huán)狀化合物的反應等過程；CC顯著富集在膜筏、細胞質核周區(qū)、突觸后、膜側、胞體等區(qū)域；MF顯著富集在激酶結合、蛋白質結構域特異性結合、蛋白絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸激酶活性等功能。在KEGG通路富集分析中，前20條與陽和湯相關度較高的通路如圖6所示，主要涉及癌癥信號通路、脂質和動脈粥樣硬化信號通路、鞘脂信號通路、甲狀腺激素信號通路、糖尿病性心肌病信號通路等，表明88個核心靶點可能是主要通過調節(jié)這些通路來起到治療或干預疾病的作用。

圖4 靶點PPI網(wǎng)絡圖

表4 核心靶點性質

續(xù)表4

靶點名稱度值介數(shù)中心性接近中心性 ADRB2腎上腺素能受體β（adrenergic receptor β）351 664.133 6330.001 034 PTGS2環(huán)氧合酶-2（cyclooxygenase-2）904 509.877 0620.001 176 F2凝血酶（thrombin）442 012.113 8390.001 068 MMP9基質金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinase 9）903 864.770 9270.001 160 ACHE乙酰膽堿酯酶（acetylcholinesterase）291 653.416 6710.001 024 PLG胞漿素原（plasminogen）41727.411 1400.001 035 TNF腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）16116 589.169 8230.001 333 DPP4二肽基肽酶IV（dipeptidyl peptidase IV）291 620.029 3710.001 009 NOS3內皮型一氧化氮合酶（nitric-oxide synthase, endothelial）712 279.959 3350.001 144 GSR谷胱甘肽還原酶（glutathione reductase）271 093.391 5050.001 038 SLC6A3多巴胺轉運蛋白（dopamine transporter）392 028.972 1150.000 995 HPGDS造血型前列腺素D合成酶（hematopoietic prostaglandin D synthase）684 227.105 1270.001 140 DRD2多巴胺D2受體（dopamine D2 receptor）381 902.568 9330.001 036 GRIN1谷氨酸［NMDA］受體蛋白（glutamate [NMDA] receptor protein）341 710.135 0300.001 019 CNR1大麻素受體1（cannabinoid receptor 1）424 116.451 9400.001 049 CHRM1毒蕈堿乙酰膽堿受體M1（muscarinic acetylcholine receptor M1）261 574.821 3370.000 969 MAOA單胺氧化酶A（monoamine oxidase A）361 134.263 9300.000 962 MAOB單胺氧化酶B（monoamine oxidase B）381 580.851 1770.000 978 GARTGAR轉甲酰酶（同源）［GAR transformylase (by homology)］311 244.991 9230.000 950 IL2白介素2（interleukin-2）691 567.120 0350.001 121 TYMS胸苷酸合酶（同源）［thymidylate synthase (by homology)］38930.104 6590.000 976 DHFR二氫葉酸還原酶（同源）［dihydrofolate reductase (by homology)］342 019.182 5120.001 004 LGALS4半乳糖凝集素4（galectin-4）281 557.122 8020.001 025 GSTP1谷胱甘肽S-轉移酶P1（glutathione S-transferase P1）421 555.662 2020.001 046 OPRM1μ阿片受體（μ opioid receptor）271 075.336 7980.000 995 PRKCB蛋白激酶C β（protein kinase C β）451 345.542 8470.001 050 PRKCA蛋白激酶C α（protein kinase C α）581 973.421 3310.001 109 CFTR囊性纖維化跨膜電導調節(jié)劑（cystic fibrosis transmembrane conductance regulator）273 077.063 5340.001 012 NR3C1糖皮質激素受體（glucocorticoid receptor）643 390.862 2380.001 129 DNMT1DNA（胞嘧啶-5）-甲基轉移酶1［DNA (cytosine-5)-methyltransferase 1］521 451.665 9610.001 066 AHR芳烴受體（aryl hydrocarbon receptor）341 302.863 0470.001 059 PGR孕激素受體（progesterone receptor）54992.412 1350.001 105 CYP19A1細胞色素P450 19A1（cytochrome P450 19A1）31756.166 2350.001 024 RELA核因子NF-κB p65亞基（nuclear factor NF-κB p65 subunit）722 203.598 2700.001 139 RXRA維甲酸X受體α（retinoid X receptor α）331 019.046 7860.001 020 PTK2黏著斑激酶1（focal adhesion kinase 1）54962.624 6800.001 068 CTSB組織蛋白（B和K）［cathepsin (B and K)］381 132.288 9600.001 021 BRD4含溴結構域蛋白4（bromodomain-containing protein 4）331 076.992 0860.001 003 PRKACAcAMP依賴性蛋白激酶α催化亞基（cAMP-dependent protein kinase α-catalytic subunit）491 996.515 8630.001 062 HDAC2組蛋白脫乙酰基酶2（histone deacetylase 2）48955.463 8070.001 044 HSPA1A熱休克70 kDa蛋白1（heat shock 70 kDa protein 1）411 108.427 3220.001 074 KDM1A賴氨酸特異性組蛋白去甲基化酶1（lysine-specific histone demethylase 1）381 360.475 4260.000 993 PPP2CA絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶2A，催化亞基，α亞型（serine/threonine protein phosphatase431 016.475 1950.001 034 2A, catalytic subunit, α isoform） KDM6B賴氨酸專一性脫甲基酶6B（lysine-specific demethylase 6B）281 451.180 6140.000 949 NOS2誘導型一氧化氮合酶（同源）［nitric oxide synthase, inducible (by homology)］36987.414 7940.001 048

圖5 陽和湯核心靶點GO功能富集分析

Fig. 5 Analysis of GO function enrichment of Yanghe Decoction core targets

2.7.4 “成分-靶點-通路”網(wǎng)絡構建及分析 將篩選得到的陽和湯中的8個活性成分、88個核心靶點和20條核心通路，運用Cytoscape 3.8.0軟件構建“成分-靶點-通路”網(wǎng)絡關系圖，見圖7。從圖中可以看出，陽和湯是通過多成分、多靶點、多通路的協(xié)同作用達到治療疾病的目的。在8個活性成分中，除5-羥甲基糠醛外，甘草酸、甘草苷、桂皮醛、肉桂酸、毛蕊花糖苷、芥子堿硫氰酸鹽和鹽酸麻黃堿7個成分有較高的連接度；在88個核心靶點中，絲裂原活化蛋白激酶1（mitogen-activated protein kinase 1，MAPK1）、轉錄因子p65（transcription factor p65，RELA）、半胱氨酸蛋白酶3（caspase 3，CASP3）、磷脂酰肌醇3-激酶催化亞基α（phosphatidylinositol 3-kinase catalytic subunit α，PIK3CA）、蛋白激酶cAMP激活催化亞基α（protein kinase cAMP- activated catalytic subunit α，PRKACA）、絲裂原活化蛋白激酶14（mitogen-activated protein kinase 14，MAPK14）、蛋白激酶Cα（protein kinase Cα，PRKCA）、蛋白激酶C-β（protein kinase C-β，PRKCB）、B細胞淋巴瘤2樣1（B-cell Lymphoma 2 Like 1，BCL2L1）、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）的連接度也高于其他靶點；在20條核心通路中，癌癥信號通路、脂質和動脈粥樣硬化信號通路、鞘脂信號通路、甲狀腺激素信號通路的連接度相對較高。

圖6 KEGG富集通路分析結果

圖7 “成分-靶點-通路”網(wǎng)絡圖

2.7.5 整合分析 陽和湯主治陰疽，現(xiàn)代臨床治療病癥較為廣泛，在惡性腫瘤[16]、神經(jīng)系統(tǒng)疾病[17]、內分泌系統(tǒng)疾病[18]、免疫系統(tǒng)疾病[19]、泌尿系統(tǒng)疾病[20]、骨科[21]及婦科疾病[22]等方面均有顯著療效。在KEGG通路富集分析中顯示，陽和湯主要涉及癌癥信號通路、脂質和動脈粥樣硬化信號通路、鞘脂信號通路、甲狀腺激素信號通路等。惡性腫瘤作為消耗性疾病，患者多以陽虛為主，故中醫(yī)治療惡性腫瘤以“溫陽通滯”為主[23-24]。

陽和湯作為溫陽散寒通滯的經(jīng)典方，臨床上治療惡性腫瘤應用廣泛，尤其在諸多“陽虛型”癌癥患者中療效顯著。研究發(fā)現(xiàn)，陽和湯通過抑制mTOR信號通路相關蛋白的磷酸化水平[25-26]、信號轉導和轉錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）信號通路[27]及負調控STAT3通路等[28]來抑制腫瘤增殖并促進癌細胞凋亡。此外表皮生長因子受體（epithelial growth factor receptor，EGFR）通路與細胞周期和代謝緊密相關[29]，缺氧誘導因子1α（hypoxia inducible factor 1α，HIF-1α）促進腫瘤的免疫逃逸[30]，絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）參與癌癥的轉移[31]等，而陽和湯復方均與上述通路有密切的關系。高永翔等[32]通過研究發(fā)現(xiàn)陽和湯含藥血清對乳腺癌MDA-MB-231、MCF-7、4T1、SK-BR-3細胞、胃癌MGC-803細胞均有抑制作用，并能影響細胞周期分布、誘導癌細胞凋亡，體內相關實驗也有明顯的抑瘤作用。

缺氧誘導因子（hypoxia inducible factor，HIF）信號通路可加速癌細胞生長，而陽和湯可顯著降低HIF-1α的mRNA及蛋白表達[33]，且能抑制乳腺癌細胞的跨內皮能力和血管生成能力，從而起到治療作用。動脈粥樣硬化是引起大多數(shù)心血管疾病的主因，發(fā)病機制復雜，目前越來越多的研究表明，鞘脂信號通路是脂質和動脈粥樣硬化疾病的相關作用通路[34]。神經(jīng)酰胺作為神經(jīng)鞘脂代謝通路的中心分子[35]，在動脈粥樣硬化的早期形成階段，神經(jīng)酰胺對血管內皮具有保護作用，能夠維持血管張力和血壓穩(wěn)態(tài)。

此外，抑制神經(jīng)鞘磷脂合成酶（sphingomyelin synthase，SMS）活性可降低神經(jīng)鞘磷脂水平，并能有效抑制炎癥刺激下核因子-кB（nuclear factor-кB，NF-кB）的激活，而NF-кB是多種致動脈粥樣硬化相關炎癥基因的關鍵調控因子[36]。相關動物實驗也表明，高脂飲食背景下的載脂蛋白E基因缺陷小鼠敲除SMS基因后，在降低炎癥反應的同時，也能有效減少動脈粥樣硬化病變[37]。自身免疫性甲狀腺炎又稱橋本甲狀腺炎（Hashimoto’s thyroiditis，HT），HT病變過程也是炎性細胞因子異常表達的過程，現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)[38]，陽和湯加減方中所含主要活性成分能增加HT患者血清甲狀腺激素濃度，可有效維持甲狀腺激素水平穩(wěn)定，且可顯著降低血清炎性因子表達水平，抑制炎癥反應。馬丙娥等[39]實驗研究已經(jīng)證明陽和湯可抑制實驗性自身免疫性甲狀腺炎（experimental autoimmune thyroiditis，EAT）大鼠外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMC）中STAT3通路激活并改善EAT大鼠的甲狀腺功能，有效降低EAT大鼠血清中甲狀腺抗體水平，緩解甲狀腺炎癥狀。

上述文獻研究表明，網(wǎng)絡藥理學預測的結果與現(xiàn)有相關文獻較為接近，說明該研究方法具有一定的科學性和可靠性，為近一步闡述陽和湯的作用機制提供了依據(jù)。同時也與中藥整體性的觀念相吻合，陽和湯中多個活性成分可作用于多個核心靶點，從而干預多個作用通路，起到干預或治療疾病的作用?；谥讣y圖譜和網(wǎng)絡藥理學研究，甘草酸、甘草苷、桂皮醛、肉桂酸、毛蕊花糖苷、芥子堿硫氰酸鹽和鹽酸麻黃堿7個成分具有傳遞性和溯源性，且與陽和湯的功能屬性密切相關，可預測其為影響陽和湯品質的潛在功效關聯(lián)物質。

3 討論

本實驗采用凍干粉形式保存基準樣品，在優(yōu)化供試品溶液條件時，分別以水、不同比例甲醇（25%、50%、75%）作為復溶溶劑考察凍干粉的復溶效果，結果發(fā)現(xiàn)50%甲醇作為復溶溶劑時，可使凍干粉完全溶解，各成分的相對峰面積最為接近，因此選擇50%甲醇作為陽和湯基準樣品凍干粉的復溶溶劑；在優(yōu)化色譜條件時，考察了不同檢測波長，不同流動相體系［乙腈-水、甲醇-水、甲醇-0.05%磷酸水溶液（含0.05%三乙胺）、乙腈-0.05%磷酸水溶液（0.05%三乙胺）］，不同柱溫（25、30、35 ℃）對色譜峰的影響。通過以上研究，確立陽和湯指紋圖譜的分析方法：選取檢測波長260 nm（5-羥甲基糠醛、毛蕊花糖苷、桂皮醛、肉桂酸、芥子堿硫氰酸鹽、甘草苷、甘草酸）、210 nm（鹽酸麻黃堿），流動相乙腈-0.05%磷酸水溶液（含0.05%三乙胺），柱溫35 ℃。

經(jīng)典名方藥味眾多，成分復雜，本實驗以指紋圖譜為指標，全面考察陽和湯原料飲片-基準樣品的關鍵質量屬性的傳遞性。結果顯示，陽和湯基準樣品共確認15個峰，指認8個色譜峰，均能在原料飲片中找到明確歸屬。但部分《中國藥典》2020年版單味藥項下規(guī)定的指標性成分未能檢出，其中地黃苷D和鹽酸偽麻黃堿在上述色譜條件下互相干擾，單獨建立色譜條件進行全波長掃描，分析其3D圖譜，2種成分仍彼此干擾，無法有效分離；鹿角膠主要成分為氨基酸類物質，水溶性大，含量低，且不具備HPLC-UV檢測的結構特點，致使在上述色譜條件下不能檢出；6-姜辣素對照品在上述色譜條件下可被檢識，但其飲片在陽和湯基準樣品指紋圖譜中貢獻度較低，可能是干姜在炒炭過程中揮發(fā)性成分極不穩(wěn)定，逐漸揮發(fā)散失。對于上述存在的問題，本課題組后期將進一步深入研究，結合其他質量控制方法如超高效液相色譜-串聯(lián)質譜（針對熟地黃、鹿角膠、麻黃中未檢出的成分）、頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜（針對姜炭中揮發(fā)性成分）等進行全面的質量控制。

中藥復方具有“多成分、多靶點和多途徑”協(xié)同作用的特點，而網(wǎng)絡藥理學基于“疾病-基因-靶標-藥物”相互作用網(wǎng)絡，系統(tǒng)觀察藥物對疾病網(wǎng)絡的干預與影響，這與中藥復方多成分、多途徑和多靶點協(xié)同作用的原理殊途同歸[40]。本實驗將指紋圖譜與網(wǎng)絡藥理學相結合，通過對經(jīng)典名方陽和湯進行指紋圖譜研究，并采用網(wǎng)絡藥理學構建陽和湯的“成分-靶點-通路”網(wǎng)絡，不僅對陽和湯質量控制指標成分的合理性進行了驗證，而且揭示了陽和湯功效關聯(lián)性的物質基礎，為陽和湯發(fā)揮功效及藥理作用機制的闡釋提供了思路。但網(wǎng)絡藥理學仍存在一些局限性，后續(xù)仍需要通過一些藥理實驗進行驗證以促進陽和湯質量標準的建立。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] 國家藥品監(jiān)督管理局. 關于發(fā)布《中藥注冊分類及申報資料要求》的通告(2020年第68號) [EB/OL]. [2020-09-27]. https://www.nmpa.gov.cn/xxgk/ggtg/qtggtg/2020092 8164311143.html.

[2] 王璐, 張禮欣, 賈奧蒙, 等. 基于指紋圖譜和網(wǎng)絡藥理學對經(jīng)典名方竹茹湯中葛根的質量標志物（Q-Marker）預測分析[J]. 中草藥, 2021, 52(20): 6197-6207.

[3] 竇建衛(wèi), 尚榮國, 彭湃, 等. 提高陽和湯質量標準研究 [J]. 中醫(yī)藥信息, 2018, 35(1): 27-29.

[4] 竇建衛(wèi), 朱宇紅, 王紅英, 等. 陽和湯的質量標準研究 [J]. 陜西中醫(yī), 2017, 38(11): 1598-1599.

[5] 朱宇紅, 劉甲平, 尚榮國, 等. 陽和湯質量控制研究 [J]. 陜西中醫(yī), 2017, 38(9): 1286-1287.

[6] 任晉茹, 李康樂, 尚榮國, 等. 高效液相色譜法測定陽和湯中毛蕊花糖苷和甘草苷兩種成分 [J]. 西部中醫(yī)藥, 2019, 32(12): 20-22.

[7] 國家藥監(jiān)局綜合司. 古代經(jīng)典名方中藥復方制劑及其物質基準的申報資料要求(征求意見稿) [EB/OL]. [2019-03-22]. https://www.nmpa.gov.cn/xxgk/zhqyj/ zhqyjyp/20190327150101694.html.

[8] 張澤康, 王昌海, 趙玥瑛, 等. 經(jīng)典名方陽和湯基準樣品的HPLC指紋圖譜分析 [J/OL]. 中國實驗方劑學雜志: 1-12. [2022-09-13]. https://kns.cnki.net/kcms/detail/ 11.3495.R.20220816.1222.015.html.

[9] 陳金鵬, 張克霞, 劉毅, 等. 地黃化學成分和藥理作用的研究進展 [J]. 中草藥, 2021, 52(6): 1772-1784.

[10] 李娜, 胡亞楠, 王曉雪, 等. 鹿角膠化學成分、藥理作用及質量控制研究進展 [J]. 中藥材, 2021, 44(7): 1777-1783.

[11] 高銘哲, 李婷, 田晨琪, 等. 肉桂化學成分與藥理作用研究進展 [J]. 亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥, 2021, 17(11): 201-205.

[12] 孫銀芳. 中藥白芥子最新研究進展 [J]. 新中醫(yī), 2015, 47(10): 209-211.

[13] 卓小玉, 陳晶, 田明, 等. 麻黃的化學成分與藥理作用研究進展 [J]. 中醫(yī)藥信息, 2021, 38(2): 80-83.

[14] 杜晶, 黃傳輝. 姜炭的研究進展 [J]. 云南化工, 2021, 48(2): 8-11.

[15] 李娜, 張晨, 鐘贛生, 等. 不同品種甘草化學成分、藥理作用的研究進展及質量標志物（Q-Marker）預測分析[J]. 中草藥, 2021, 52(24): 7680-7692.

[16] 韓懿存, 武穎爍, 尚藝婉, 等. 陽和湯治療惡性腫瘤的研究進展 [J]. 中國比較醫(yī)學雜志, 2022, 32(7): 109-117.

[17] 步兵. 加味陽和湯治療化療性周圍神經(jīng)病變的臨床研究 [D]. 濟南: 山東中醫(yī)藥大學, 2018.

[18] 郭建清. 分析陽和湯治療早期糖尿病足的臨床價值 [J]. 糖尿病新世界, 2021, 24(3): 186-188.

[19] 葉美杏, 陳君立, 黃艷華. 中藥熏蒸聯(lián)合陽和湯治療中軸型脊柱關節(jié)炎的臨床觀察 [J]. 深圳中西醫(yī)結合雜志, 2020, 30(20): 63-65.

[20] 劉永浩. 陽和湯治療更年期尿道綜合征療效及對患者排尿情況和性激素水平的影響 [J]. 陜西中醫(yī), 2021, 42(5): 604-607.

[21] 劉偉恒, 黃其滿, 吳劍強. 陽和湯聯(lián)合塞來昔布治療膝關節(jié)骨性關節(jié)炎的療效及機制分析 [J]. 世界復合醫(yī)學, 2022, 8(4): 105-108.

[22] 陳紫薇, 任夢雪, 郭利, 等. 淺談陽和湯加減治療陽虛寒凝型不孕癥 [J]. 中國臨床醫(yī)生雜志, 2022, 50(9): 1128-1130.

[23] 許博文, 李杰, 曹璐暢, 等. 基于“陽化氣, 陰成形”理論探討扶陽消陰法在腫瘤臨證中的應用 [J]. 中醫(yī)雜志, 2020, 61(9): 772-775.

[24] 王紅玲, 康斐, 黃興. 基于“陽化氣, 陰成形”理論探討溫陽法在惡性腫瘤中的應用 [J]. 中國中醫(yī)基礎醫(yī)學雜志, 2019, 25(7): 999-1002.

[25] 趙天一. 基于PI3K/AKT/mTOR信號通路探討陽和湯含藥血清對人乳腺癌細胞增殖、凋亡的影響 [D]. 蘭州: 甘肅中醫(yī)藥大學, 2017.

[26] 孫雪, 徐茜茜, 王星宇, 等. 陽和化巖湯對mTOR低表達型乳腺癌內分泌耐藥細胞ER-PI3K/Akt/mTOR通路的作用機制 [J]. 海南醫(yī)學院學報, 2020, 26(14): 1068-1073.

[27] 楊碩, 李康樂, 朱中博, 等. 陽和湯含藥血清通過p38/STAT3信號通路對乳腺癌MCF-7細胞凋亡的影響 [J]. 中國實驗方劑學雜志, 2020, 26(5): 6-10.

[28] Mao D, Feng L, Gong H. The antitumor and immunomodulatory effect of Yanghe Decoction in breast cancer is related to the modulation of the JAK/STAT signaling pathway [J]., 2018, 2018: 8460526.

[29] Lui V W Y, Grandis J R. EGFR-mediated cell cycle regulation [J]., 2002, 22(1A): 1-11.

[30] You L, Wu W D, Wang X,. The role of hypoxia-inducible factor 1 in tumor immune evasion [J]., 2021, 41(3): 1622-1643.

[31] del Barco Barrantes I, Nebreda A R. Roles of p38 MAPKs in invasion and metastasis [J]., 2012, 40(1): 79-84.

[32] 高永翔, 沈欣, 宗桂珍, 等. 陽和湯對裸鼠人癌移植瘤的抗腫瘤作用研究 [J]. 中國實驗方劑學雜志, 2006, 12(7): 57-59.

[33] 肖玉潔, 王婷, 陳州華, 等. 陽和湯含藥血清對缺氧乳腺癌干細胞MDA-MB-231增殖的抑制作用及其機制[J]. 中南藥學, 2019, 17(8): 1219-1223.

[34] 廖思聰, 邱志東, 金俊飛. 神經(jīng)鞘脂在動脈粥樣硬化中的研究進展 [J]. 中國動脈硬化雜志, 2022, 30(8): 661-668.

[35] Yu Z M, Peng Q, Huang Y N. Potential therapeutic targets for atherosclerosis in sphingolipid metabolism [J].(), 2019, 133(6): 763-776.

[36] Hailemariam T K, Huan C M, Liu J,. Sphingomyelin synthase 2 deficiency attenuates NFkappaB activation [J]., 2008, 28(8): 1519-1526.

[37] Fan Y F, Shi F J, Liu J,. Selective reduction in the sphingomyelin content of atherogenic lipoproteins inhibits their retention in murine aortas and the subsequent development of atherosclerosis [J]., 2010, 30(11): 2114-2120.

[38] 楊凡, 莫濤, 周李芳, 等. 陽和湯加減治療橋本甲狀腺炎臨床療效及對血清炎性指標的影響 [J]. 現(xiàn)代中西醫(yī)結合雜志, 2021, 30(24): 2700-2703.

[39] 馬丙娥, 王建華, 趙正平, 等. 陽和湯對實驗性自身免疫性甲狀腺炎大鼠的治療作用 [J]. 中醫(yī)藥導報, 2021, 27(1): 16-19.

[40] 牛明, 張斯琴, 張博, 等.《網(wǎng)絡藥理學評價方法指南》解讀[J]. 中草藥, 2021, 52(14): 4119-4129.

Fingerprints of classical prescription Yanghe Decoction and predictive analysis of its efficacy related substance

ZHANG Ze-kang, ZHANG Qing, DOU Min-hang, WANG Chang-hai, ZHAO Yue-ying, XI Cheng,ZHANG Xin-yu, SUN Meng, DONG Shuang, DU Shou-ying, BAI Jie, LU Yang

School of Chinese Materia Medica, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 102488, China

Based on fingerprint and network pharmacology, a fingerprint detection method of Yanghe Decoction (陽和湯) was established, and its efficacy related substances were predicted and analyzed to provide a reference basis for Yanghe Decoction quality control.The Yanghe Decoction fingerprint was established by HPLC, the common peaks were assigned and identified, and the “component-target-pathway” network diagram of Yanghe Decoction was constructed by network pharmacology to further prove the rationality of the selection of functional components of Yanghe Decoction.A total of 15 common peaks were calibrated by HPLC fingerprint of Yanghe Decoction. Eight common peaks of 5-hydroxymethylfurfural (peak 2), sinapine thiocyanate (peak 5), glycyrrhizin (peak 8), verbascoside (peak 9), cinnamic acid (peak 11), cinnamaldehyde (peak 12), glycyrrhizic acid (peak 13) and ephedrine hydrochloride (peak 15) were identified by the reference substance, and the similarity was more than 0.83. The main groups of pharmacodynamic substances can be transferred from raw materials, decoction pieces to benchmark samples step by step, with a clear affiliation relationship; The “component-target-pathway” network of eight selected active components was constructed and analyzed by network pharmacology, the enriched pathways included cancer signal pathway, lipid and atherosclerosis signal pathway, sphingolipid signal pathway, thyroid hormone signal pathway and so on. According to the connectivity between compounds, targets and pathways, it was preliminarily predicted that glycyrrhizic acid, glycyrrhizin, cinnamaldehyde, cinnamic acid, verbascoside, sinapine thiocyanate and ephedrine hydrochloride may achieve the effects of warmingand tonifying blood, dispelling cold and dredging stagnation by regulating these signal pathways.HPLC fingerprint combined with network pharmacology analysis is used to predict the potential efficacy related substances of Yanghe Decoction in the treatment of diseases. The established method is convenient and stable, and can be used for the quality control of Yanghe Decoction. It also provides a reference for the further study of the quality standard and action mechanism of Yanghe Decoction.

classic prescription; Yanghe Decoction; fingerprint; network pharmacology; efficacy related substances;sinapine thiocyanate; 5-hydroxymethylfurfural; glycyrrhizin; verbascoside; cinnamic acid; cinnamaldehyde; glycyrrhizic acid; ephedrine hydrochloride

R283.6

A

0253 - 2670(2023)04 - 1106 - 14

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.04.010

2022-08-16

國家自然科學基金項目（82173989）

張澤康（1999—），男，碩士研究生，研究方向為中藥新劑型、新技術。Tel: 18189512019 E-mail: 2557158263@qq.com

白 潔，女，副教授，碩士生導師，從事中藥新劑型與新技術研究。Tel: (010)84738657 E-mail: baijie22811@163.com

陸 洋，男，教授，博士生導師，從事中藥新劑型與新技術研究。Tel: (010)83912123 E-mail: landocean28@163.com

[責任編輯 鄭禮勝]