裂殖壺菌pks2基因啟動子序列擴增及其活性分析?

朱 清，臧曉南，王振東，馬 帥

(中國海洋大學 海洋生物遺傳學與育種教育部重點實驗室，山東 青島 266003)

啟動子作為基因表達調控中必不可少的順式作用元件，常用于基因重組表達等實驗研究中，在構建表達載體時占據(jù)著重要的地位。啟動子能夠提供RNA聚合酶結合位點，控制著轉錄的起始[1-2]。在基因表達過程中，啟動子的選擇也發(fā)揮了很大的作用[3]，選擇啟動活性高的強啟動子一直是人們追求的目標。

染色體步移技術是在聚合酶鏈式反應(PCR)的技術基礎上，從已知序列出發(fā)對鄰近未知的序列進行探尋的方法，主要包括反向PCR，接頭介導PCR以及半隨機引物PCR等[4]。TAIL-PCR由Liu和Whittier[5]率先提出并成功應用于自動擴增和測序P1與YAC克隆細胞的插入端序列，以及擬南芥(Arabidopsisthaliana)T-DNA插入位點側翼序列的分離和定位[6]。TAIL-PCR技術因其操作簡便快捷，高效準確性高等優(yōu)點在許多研究中被廣泛應用。因此，本實驗利用在半隨機引物PCR基礎上進行了改良的熱不對稱交錯PCR技術(TAIL-PCR)，使用3條方向相同且延伸溫度較高的特異性引物與溫度較低的兼并引物進行3次嵌套PCR反應，對基因未知序列進行擴增。

裂殖壺菌(Aurantiochytriumlimacinum)是一種海洋真菌，因其是DHA等多不飽和脂肪酸(PUFAs)高產菌而得到廣泛關注。目前已有許多外源啟動子運用于裂殖壺菌相關研究的實例，如鄭楚強構建了裂殖壺菌中丙二酸單?；D移酶(MAT)的過表達體系，利用TEF1啟動子實現(xiàn)了MAT基因的過表達[7]。楊瑞雄等[8]同樣利用外源TEF1啟動子將希瓦氏菌屬的Shewanellasp.SCRC2738的烯酰還原酶(ER)基因替換到裂殖壺菌(A.limacinum)SR21中異源表達，為調控裂殖壺菌中PUFAs的合成提供了新的思路。相較于外源啟動子的廣泛研究，對于裂殖壺菌內源啟動子的探索目前還處于初步階段，本實驗室劉暢對裂殖壺菌pks1、pks3基因的啟動子序列進行克隆重組，檢測了啟動子序列的活性，王振東在此基礎上對兩啟動子序列進一步完善，得到了更多的順式作用元件[9-10]。pks1、pks2和pks3是裂殖壺菌高效合成脂肪酸的PKS途徑基因簇的3個基因，其中pks2基因的啟動子序列目前尚未有研究。本研究擬對裂殖壺菌pks2基因的上游序列進行研究，探索裂殖壺菌的內源啟動子的啟動活性，為基因工程操作提供有效的基因元件。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

裂殖壺菌A.limacinumOUC168，大腸桿菌EscherichiacoliBL21及色氨酸缺陷型酵母SaccharomycescerevisiaeEBY100均為本實驗室保存菌種；啟動子檢測載體pAcGFP1-1(見圖1(a))以及genome walking試劑盒購自TAKARA公司，酵母表達載體pYD1(見圖1(b))來自Invitrogen公司?？寺≥d體pEASY-Blunt-T simple Cloning Vector及菌株感受態(tài)E.coliTrans-T1來自于北京全式金公司。pks2基因為實驗室前期克隆拼接獲得[11]。實驗中涉及到的引物列于表1。

(MCS：多克隆位點；AcGFP1：綠色熒光蛋白基因；SV40 poly(A)signal：SV40早期mRNA多腺苷酸化信號；f1 ori：f1單鏈DNA來源，包裝AcGFP1-1的非編碼鏈；AmpR promoter：氨芐西林抗性(β-內酰胺酶)啟動子；SV40 ori：SV40復制起點；SV40 promoter：SV40早期啟動子；NeoR/KanR：新霉素/卡那霉素耐藥基因；HSV TK poly(A)signal：單純皰疹病毒胸苷激酶多腺苷酸化信號；ori：pUC質粒復制起源。MCS: multiple cloning site; AcGFP1: Aequorea coerulescens green fluorescent protein gene; SV40 poly(A)signal: SV40 early mRNA polyadenylation signal; f1 ori: f1 single-strand DNA origin, packages noncoding strand of AcGFP1-1; AmpR promoter: Ampicillin resistance(β-lactamase)promoter; SV40 ori: SV40 origin of replication; SV40 promoter: SV40 early promoter; NeoR/KanR: Neomycin/Kanamycin resistance gene; HSV TK poly(A)signal: Herpes simplex virus thymidine kinase polyadenylation signal; ori: pUC plasmid replication origin.)

表1 引物列表

1.2 方法

1.2.1pks2基因5’端側翼序列的獲取與分析 根據(jù)pks2基因5’端序列設計3條退火要求溫度較高且均為反向的特異性引物，分別命名為SP1、SP2與SP3(見表1)，與genome walking試劑盒中的兼并引物進行3次巢氏PCR反應，得到目的側翼序列。之后將序列通過PlantCARE[12]等進行分析預測，得到的pks2啟動子序列命名為p2。

1.2.2pks2啟動子的引物設計及連接克隆載體pEASY-Blunt-T simple Cloning Vector 根據(jù)得到的pks2啟動子序列設計引物，上、下游分別加上BamHⅠ和HindⅢ酶切位點。上游引物為p2-F，下游引物為p2-R(列于表1，下劃線為酶切位點序列)。以裂殖壺菌OUC168的DNA為模板擴得pks2啟動子序列，并將其連接至pEASY-Blunt-T simpleCloning Vector并轉入Trans-T1感受態(tài)細胞，測序準確的質粒命名為T-P2。

1.2.3pks2基因啟動子連接pAcGFP1-1載體及轉化大腸桿菌BL21 使用BamHⅠ和HindⅢ分別對T-P2和pAcGFP1-1載體進行雙酶切，膠回收后利用T4連接酶連接，命名為pAcGFP-P2，轉入制備好的E.coliBL21感受態(tài)細胞，篩選驗證后將測序準確的菌株命名為E.coliBL21-pAcGFP-P2，同時將空載體pAcGFP1-1轉化到E.coliBL21上，并將其命名為E.coliBL21-pAcGFP，用于后續(xù)對照。

1.2.4pks2基因啟動子連接pYD1載體及轉化S.cerevisiaeEBY100 使用NotⅠ和HindⅢ分別對pAcGFP-P2和pYD1載體雙酶切，膠回收后連接測序，構建好的載體命名為pYD1-GFP-P2。利用酵母轉化試劑盒將其轉化到S.cerevisiaeEBY100上，經(jīng)培養(yǎng)基平板篩選陽性轉化子，之后提取轉化子酵母基因組DNA，以其為模板進一步PCR驗證測序，轉化好的菌株命名為S.cerevisiaeEBY100-GFP-P2，同時使用NotⅠ和HindⅢ雙酶切空載體pAcGFP1-1，得到綠色熒光蛋白gfp基因片段，將其連接pYD1載體再轉入S.cerevisiaeEBY100用于后續(xù)對照，命名為S.cerevisiaeEBY100-GFP。

1.2.5 啟動子的原核啟動表達分析 將構建好的E.coliBL21-pAcGFP-P2和E.coliBL21-pAcGFP菌株與實驗室前期保藏的含有pks1和pks3啟動子的重組菌株(分別命名為E.coliBL21-pAcGFP-P1，E.coliBL21-pAcGFP-P3)一起接種至LB培養(yǎng)基中，37 ℃活化12 h，之后將活化好的菌液按1%的比例接種至新鮮培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)5 h后測OD600值，將培養(yǎng)好的菌液經(jīng)離心破碎后制備成蛋白上清樣品，進行熒光分析以及SDS-PAGE和Western Blot檢測。

1.2.6 啟動子的真核啟動表達分析 將構建好的S.cerevisiaeEBY100-GFP-P2，S.cerevisiaeEBY100-GFP菌株以及實驗室前期構建好的含有pks1以及pks3啟動子序列的重組酵母菌株(分別命名為S.cerevisiaeEBY100-GFP-P1，S.cerevisiaeEBY100-GFP-P3)一起進行表達。因pYD1質粒自身攜帶半乳糖誘導型啟動子PGAL，而pks2為組成型啟動子，所以為了避免PGAL啟動子啟動綠色熒光蛋白表達，重組菌株使用含2%葡萄糖的YNB-CAA培養(yǎng)基進行活化，30 ℃振蕩培養(yǎng)24 h后，按10%比例進行轉接，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后經(jīng)離心破碎，取蛋白上清樣品進行熒光分析，最后用SDS-PAGE和Western Blot檢測。

2 結果與分析

2.1 pks2基因5’端側翼序列的獲取與分析

利用設計好的特異性引物與兼并引物進行3次PCR反應后，對第3次PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，電泳結果如圖2。其中M泳道為marker,第1、2、3、4泳道分別為與試劑盒中4種兼并引物反應結果，除了第1泳道未出現(xiàn)條帶外，其余3個泳道均出現(xiàn)了大小不一的條帶，對這些條帶進行膠回收后測序，通過與pks2基因5’端序列比對，最終確定得到了長度為409 bp的pks2基因5’端側翼序列。

(M: Marker；1、2、3、4: 4種不同兼并引物PCR產物Reaction results of four different degenerate primers.)

將得到的pks2基因5’端側翼序列運用PlantCARE進行預測分析(見圖3)，發(fā)現(xiàn)在序列中存在CAAT-box和TATA-box等常見的真核生物啟動子作用元件，TATA-box具有確保轉錄準確開始的作用，而CAAT-box元件能有效的控制轉錄過程的速率[2,12]。此外，還發(fā)現(xiàn)有參與光響應的調節(jié)元件CAG-motif和G-box，以及MYB轉錄因子結合位點核心序列，厭氧誘導中重要的調節(jié)元件ARE等，初步推測這段序列可能具有啟動活性，不僅是一個組成型啟動子，還具備誘導型啟動子的特點，在特定誘導條件下能夠發(fā)揮功能。

圖3 pks2基因啟動子序列預測

2.2 原核表達載體構建及重組菌株轉化

以裂殖壺菌OUC168的基因組DNA為模板，從pks2基因ATG前409 bp處開始擴得啟動子序列。膠回收后連接克隆載體，進一步酶切后連接啟動子檢測載體pAcGFP1-1得到重組原核表達載體pAcGFP-P2，重組質粒圖譜如圖4所示。將pAcGFP-P2與空載體pAcGFP1-1分別轉入提前制備好的E.coliBL21感受態(tài)細胞，對單一菌落轉化子進行菌液PCR檢測，檢測結果如圖5所示。圖5(a)為載體pAcGFP-P2轉E.coliBL21檢測結果，使用引物P2-F和GFP-R分別對轉化子和E.coliBL21進行PCR，除了泳道4E.coliBL21沒有出現(xiàn)條帶以外，其余3個泳道均出現(xiàn)了單一且清晰條帶，且大小與pks2基因啟動子和綠色熒光蛋白gfp基因兩片段加起來的大小一致(1 129 bp)，證明表達載體pAcGFP-P2成功轉化到E.coliBL21中。圖5(b)為使用綠色熒光蛋白gfp基因的上下游引物GFP-F與GFP-R對載體pAcGFP1-1轉化檢測結果，結果顯示除泳道5以E.coliBL21為模板未出現(xiàn)條帶外，泳道6、7均出現(xiàn)單一清晰條帶，大小與gfp基因長度一致(720 bp),證明載體pAcGFP1-1也成功轉化到E.coliBL21中，經(jīng)進一步測序得到重組菌株E.coliBL21-pAcGFP-P2和E.coliBL21-pAcGFP。

圖4 重組質粒pAcGFP-P2圖譜

((a)載體pAcGFP-P2轉化E. coli BL21菌PCR檢測圖。M：Marker；泳道1、2、3：pAcGFP-P2轉化E. coliBL21陽性轉化子；泳道4.：E. coli BL21菌株。(b)載體pAcGFP1-1轉化E. coli BL21菌PCR檢測圖。M：Marker；泳道5：E. coliBL21菌株；泳道6、7：pAcGFP1-1轉化E. coliBL21陽性轉化子。(a)PCR result of E. coli BL21 transformed by vector pAcGFP-P2.M: Marker; Lanes 1, 2, 3: pAcGFP-P2 transformed E. coli BL21 positive transformant; Lane 4: E. coli BL21.(b)PCR result of E. coli BL21 transformed by vector pAcGFP1-1.M: Marker; Lane 5: E. coli BL21; Lanes 6, 7: pAcGFP1-1 transformed E. coli BL21 positive transformant.)

2.3 真核表達載體構建及酵母轉化

對之前構建好的原核表達載體使用NotⅠ和HindⅢ雙酶切，連接同樣酶切后的pYD1載體，得到重組真核表達載體(見圖6)，之后進行酵母轉化。以提取的轉化子基因組DNA為模板進行PCR檢測，檢測結果如圖7所示。圖7(a)中使用引物P2-F和GFP-R，除第4泳道由于使用S.cerevisiaeEBY100的DNA為模板而未有條帶外，其余3個泳道利用載體pYD1-GFP-P2轉酵母的陽性轉化子基因組DNA為模板均出現(xiàn)單一、明亮的條帶，且大小與預期長度一致(pks2啟動子和gfp基因共計約1 129 bp)，證明載體pYD1-GFP-P2成功轉化到S.cerevisiaeEBY100中，并插入其基因組中；圖7(b)中使用引物GFP-F和GFP-R，除泳道5由于同樣使用S.cerevisiaeEBY100為模板而未出現(xiàn)條帶外，使用載體pYD1-GFP轉化酵母的陽性轉化子基因組DNA為模板的泳道6、7均出現(xiàn)了與綠色熒光蛋白gfp基因長度相符的單一條帶(720 bp)，證明載體pYD1-GFP也成功轉入S.cerevisiaeEBY100中，通過進一步測序確定重組菌株S.cerevisiaeEBY100-GFP-P2和S.cerevisiaeEBY100-GFP。

圖6 重組質粒pYD1-GFP-P2圖譜

((a)載體pYD1-GFP-P2轉化S. cerevisiae EBY100檢測圖。M：Marker；泳道1、2、3：pYD1-GFP-P2轉化S. cerevisiae EBY100陽性轉化子；泳道4：S. cerevisiae EBY100菌株。(b)載體pYD1-GFP轉化S. cerevisiae EBY100檢測圖。M：marker；泳道5：S. cerevisiae EBY100菌株；泳道6、7：載體pYD1-GFP轉化S. cerevisiae EBY100陽性轉化子。(a)Detection diagram of vector pYD1-GFP-P2 transformed S. cerevisiae EBY100.M: Marker; Lanes 1,2,3: pYD1-GFP-P2 transformed S. cerevisiae EBY100 positive transformant; Lane 4: S. cerevisiae EBY100.(b)Detection diagram of vector pYD1-GFP transformed S. cerevisiae EBY100.M: Marker; Lane 5: S. cerevisiae EBY100; Lanes 6, 7: pYD1-GFP transformed S. cerevisiae EBY100 positive transformant.)

2.4 啟動子的原核啟動表達分析

2.4.1 重組菌株的熒光檢測分析 對構建好的重組菌株E.coliBL21-pAcGFP-P2，E.coliBL21-pAcGFP以及實驗室保存的E.coliBL21-pAcGFP-P1，E.coliBL21-pAcGFP-P3活化后進行熒光檢測分析，結果如圖8所示，在488 nm波長激發(fā)光下，菌株均呈現(xiàn)不同程度熒光發(fā)射峰，且在520 nm左右處出現(xiàn)最高峰，其中重組菌株E.coliBL21-pAcGFP-P2熒光活性最高，菌株E.coliBL21-pAcGFP-P3次之，然后為E.coliBL21-pAcGFP-P1菌株，而E.coliBL21-pAcGFP的熒光強度最低，表明pks1、pks2和pks3基因啟動子都具有一定的啟動活性，并不同程度啟動了綠色熒光蛋白gfp基因的表達，其中pks2基因啟動子活性最高，與其他結果間差異顯著(P<0.01)。

(GFP：E. coli BL21-pAcGFP菌株；1-GFP：E. coli BL21-pAcGFP-P1菌株；2-GFP：E. coli BL21-pAcGFP-P2菌株；3-GFP：E. coli BL21-pAcGFP-P3菌株GFP: E. coli BL21-pAcGFP strain; 1-GFP: E. coli BL21-pAcGFP-P1 strain; 2-GFP: E. coli BL21-pAcGFP-P2 strain; 3-GFP: E. coli BL21-pAcGFP-P3 strain.)

2.4.2 重組菌株的SDS-PAGE分析以及Western Blot檢測 對重組菌株經(jīng)破碎離心后的蛋白上清樣品制樣后進行SDS-PAGE分析，結果如圖9(a)所示，其中泳道1為E.coliBL21的總蛋白上清樣品，泳道2、3、4分別為重組的E.coliBL21-pAcGFP-P1、E.coliBL21-pAcGFP-P2和E.coliBL21-pAcGFP-P3菌株總蛋白上清樣品，與泳道1相比，其余3個泳道并無明顯特異性條帶出現(xiàn)，推測是由于表達量不高，因此SDS-PAGE條帶不易辨認，進一步對樣品使用綠色熒光蛋白gfp基因的特異性抗體進行Western Blot檢測，結果如圖9(b)所示，除泳道5E.coliBL21的總蛋白上清樣品未出現(xiàn)明顯條帶外，其余3個泳道重組的E.coliBL21-pAcGFP-P1、E.coliBL21-pAcGFP-P2和E.coliBL21-pAcGFP-P3菌株總蛋白上清樣品均在25～30 kDa之間出現(xiàn)一條明顯的條帶，與綠色熒光蛋白大小(26.7 kDa)相符，證明在原核菌株E.coliBL21中，pks1、pks2和pks3基因啟動子均啟動了綠色熒光蛋白gfp基因的表達。

((a)原核重組菌株蛋白上清樣品SDS-PAGE圖。M：Marker；泳道1：E. coli BL21上清樣品；泳道2：E. coli BL21-pAcGFP-P1上清樣品；泳道3：E. coli BL21-pAcGFP-P2上清樣品；泳道4：E. coli BL21-pAcGFP-P3上清樣品。(b)原核重組菌株蛋白上清樣品Western Blot圖。M：Marker；泳道5：E. coli BL21上清樣品；泳道6：E. coli BL21-pAcGFP-P1上清樣品；泳道7：E. coli BL21-pAcGFP-P2上清樣品；泳道8：E. coli BL21-pAcGFP-P3上清樣品。(a)SDS-PAGE of prokaryotic recombinant strains protein supernatant sample.M: Marker; Lane 1: E. coli BL21supernatant sample; Lane 2: E. coli BL21-pAcGFP-P1 supernatant sample; Lane 3: E. coli BL21-pAcGFP-P2 supernatant sample; Lane 4: E. coli BL21-pAcGFP-P3supernatant sample.(b)Western Blot of prokaryotic recombinant strains protein supernatant sample.M: Marker; Lane 5: E. coli BL21 supernatant sample; Lane 6: E. coli BL21-pAcGFP-P1supernatant sample; Lane 7: E. coli BL21-pAcGFP-P2 supernatant sample; Lane 8: E. coli BL21-pAcGFP-P3supernatant sample.)

2.5 啟動子系列重組菌株的真核表達分析

2.5.1 重組菌株的熒光檢測分析 將構建好的酵母重組菌株S.cerevisiaeEBY100-GFP-P2和S.cerevisiaeEBY100-GFP以及之前保存的菌株S.cerevisiaeEBY100-GFP-P1和S.cerevisiaeEBY100-GFP-P3活化后表達制樣，對得到的蛋白上清樣進行熒光檢測分析，結果如圖10，在488 nm激發(fā)光下，菌株出現(xiàn)不同程度熒光發(fā)射峰，且在520 nm左右處出現(xiàn)最高峰。與對照菌株S.cerevisiaeEBY100-GFP相比，3種啟動子均不同程度的啟動了GFP的表達，其中菌株S.cerevisiaeEBY100-GFP-P2熒光略強，與其他結果間差異顯著(P<0.05)，證明pks2基因啟動子活性最高，pks3基因啟動子次之，pks1基因啟動子活性最低，與在原核表達系統(tǒng)中熒光檢測結果一致。

(GFP：S. cerevisiae EBY100-GFP菌株；1-GFP：S. cerevisiae EBY100-GFP-P1菌株；2-GFP：S. cerevisiae EBY100-GFP-P2菌株；3-GFP：S. cerevisiae EBY100-GFP-P3菌株。GFP: S. cerevisiae EBY100-GFP strain; 1-GFP: S. cerevisiae EBY100-GFP-P1 strain; 2-GFP: S. cerevisiae EBY100-GFP-P2 strain; 3-GFP: S. cerevisiae EBY100-GFP-P3 strain.)

2.5.2 重組菌株的SDS-PAGE分析以及Western Blot檢測 將真核重組菌株蛋白上清制樣后同樣進行SDS-PAGE分析和Western Blot檢測，結果如圖11所示。圖11(a)為真核重組菌株SDS-PAGE圖，泳道1為S.cerevisiaeEBY100蛋白樣，泳道2、3、4分別為重組菌株S.cerevisiaeEBY100-GFP-P1，S.cerevisiaeEBY100-GFP-P2，S.cerevisiaeEBY100-GFP-P3的蛋白上清樣。SDS-PAGE結果顯示，在25～30 kDa之間，條帶較為緊密，重組菌株無法判斷出有明顯區(qū)別于S.cerevisiaeEBY100的條帶出現(xiàn)。圖11(b)為利用綠色熒光蛋白gfp基因特異性抗體進一步進行的Western Blot檢測，與S.cerevisiaeEBY100菌株上清樣(泳道5)相比，重組菌株S.cerevisiaeEBY100-GFP-P1(泳道6)、S.cerevisiaeEBY100-GFP-P2(泳道7)和S.cerevisiaeEBY100-GFP-P3(泳道8)均出現(xiàn)條帶，且大小與綠色熒光蛋白大小一致(26.7 kDa)，證明pks1、pks2和pks3基因啟動子都啟動了gfp基因的表達，具有啟動活性。

((a)真核重組菌株蛋白上清樣品SDS-PAGE圖。M：Marker；泳道1：S. cerevisiae EBY100上清樣品；泳道2：S. cerevisiae EBY100-GFP-P1上清樣品；泳道3：S. cerevisiae EBY100-GFP-P2上清樣品；泳道4：S. cerevisiae EBY100-GFP-P3上清樣品。(b)真核重組菌株蛋白上清樣品Western Blot圖。M：Marker；泳道5：S. cerevisiae EBY100上清樣品；泳道6：S. cerevisiae EBY100-GFP-P1上清樣品；泳道7：S. cerevisiae EBY100-GFP-P2上清樣品；泳道8：S. cerevisiae EBY100-GFP-P3上清樣品。(a)SDS-PAGE of eukaryotic recombinant strains protein supernatant sample.M: marker; Lane 1: S. cerevisiae EBY100 supernatant sample; Lane 2: S. cerevisiae EBY100-GFP-P1 supernatant sample; Lane 3: S. cerevisiae EBY100-GFP-P2 supernatant sample; Lane 4: S. cerevisiae EBY100-GFP-P3 supernatant sample.(b)Western Blot of prokaryotic recombinant strains protein supernatant sample.M: Marker; Lane 5: S. cerevisiae EBY100 supernatant sample; Lane 6: S. cerevisiae EBY100-GFP-P1 supernatant sample; Lane 7: S. cerevisiae EBY100-GFP-P2 supernatant sample; Lane 8: S. cerevisiae EBY100-GFP-P3 supernatant sample.)

3 討論

本研究利用TAIL-PCR技術，通過3次巢氏PCR反應，擴增出了pks2基因5’端側翼序列，經(jīng)分析初步確定了這段序列具有啟動子活性。在對pks2基因啟動子序列活性的進一步研究中，選用了綠色熒光蛋白gfp基因，為探索在不同宿主中啟動子的活性提供了便利條件；同時通過選擇常用的原核大腸桿菌表達系統(tǒng)以及真核釀酒酵母表達系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)在E.coliBL21和S.cerevisiaeEBY100中，pks2基因啟動子均不同程度的啟動了綠色熒光蛋白gfp基因的表達，這說明pks2在原核表達系統(tǒng)和真核表達系統(tǒng)中都具有啟動活性。

裂殖壺菌具有高效合成脂肪酸的聚酮合酶途徑(PKS途徑)，pks1、pks2和pks3組成了PKS途徑相關酶的基因簇。目前已有許多針對參與PKS途徑關鍵基因和結構酶域的研究，揭示了參與PKS途徑的基因的具體功能以及改造可能性，為構建高產DHA的優(yōu)勢菌株奠定了理論基礎。本實驗室劉暢[9]克隆了裂殖壺菌pks1、pks3基因的啟動子序列，王振東[10]在此基礎上對兩啟動子序列進一步延長，發(fā)現(xiàn)這兩個啟動子的啟動活性并不高，而pks2基因的啟動子目前還沒有被研究。在對裂殖壺菌進行基因改造獲得高產DHA菌株的研究中，常常存在外源基因表達不夠理想的情況，選擇一個合適的強啟動子，往往能夠提高重組蛋白的表達[13]。Han等[14]通過建立β-半乳糖苷酶報告系統(tǒng)，比較了在裂殖壺菌中4種啟動子的啟動活性，利用活性最強的ccg1p啟動子，實現(xiàn)了裂殖壺菌中ATP-檸檬酸裂解酶和乙酰輔酶a羧化酶的過量表達。除了外源啟動子的篩選，選用比外源啟動子活性更高的內源性啟動子往往能達到事半功倍的效果。李杰等[15]在對轉基因鹽藻外源基因表達的研究中發(fā)現(xiàn)，利用鹽藻的誘導型內源啟動子比外源啟動子更有利于外源基因的表達；譚瑋[16]在對藍藻中外源基因人粒-巨噬細胞集落刺激因子的表達研究中，使用了藍藻的2種內源啟動子，與使用外源啟動子相比，均在一定程度上提高了基因的表達。江賢章等[17]通過對海洋破囊壺菌Thraustochytriumsp.FJN-10的Δ4-脂肪酸脫飽和酶5’端側翼序列擴增分析，得到具有啟動子活性的序列；夏曉峰[18]又針對破囊壺菌Thraustochytriumsp.FJN-10的Δ5-脂肪酸脫飽和酶5’端側翼序列進行擴增，同樣得到了一段具有啟動子活性的序列，為從基因水平研究破囊壺菌Thraustochytrium中DHA的生物合成奠定了基礎。實驗中擴得的pks2基因啟動子，作為裂殖壺菌的內源啟動子或許可以用于后續(xù)的研究。

在對啟動子活性的進一步比較分析中，發(fā)現(xiàn)新得到的pks2基因啟動子具有比pks1、pks3基因啟動子更高的啟動活性。經(jīng)過序列比對分析發(fā)現(xiàn)pks1、pks2和pks3基因的啟動子序列中都具有CAAT-box，但是CAAT-box的位置有所不同。其中pks2啟動子序列中的CAAT-box距離轉錄起始點的距離更近，因而這可能使其調控效率更高。此外pks2啟動子序列中還有參與光響應的調控元件CAG-motif、G-box等，這可能使轉錄更容易受到調控，從而具有更高的轉錄效率。

新擴增得到的pks2基因啟動子雖然包含的順式作用元件并不多，但仍顯現(xiàn)出較高的啟動活性，在未來對其進一步研究或許存在更完整序列與更高活性?？傮w來說，作為裂殖壺菌以外其他宿主的外源啟動子，甚至作為裂殖壺菌內源啟動子，pks2基因啟動子的獲得與成功表達顯示出其在啟動基因表達中具備的潛力，為裂殖壺菌代謝調控和合成生物學研究提供了基因資源。