太平洋牡蠣在對(duì)Pb2+富集和排出過(guò)程中的生理水平變化

劉 偉，鞠 青，劉星辰

(1.山東省青島生態(tài)環(huán)境監(jiān)測(cè)中心，山東 青島 266000；2.煙臺(tái)大學(xué)機(jī)電汽車工程學(xué)院，山東 煙臺(tái) 264005)

重金屬是一類備受關(guān)注的全球性污染物。由于工業(yè)廢水及固體廢物的不合理處置，導(dǎo)致海水水體受到大量的重金屬污染[1-3]。鉛及其絡(luò)合物還被列為環(huán)境內(nèi)分泌干擾物(environmental endocrine disrupting chemicals,EDCs)，可通過(guò)干擾生物體內(nèi)激素合成、分泌、運(yùn)輸、反應(yīng)及代謝等過(guò)程，從而影響生物體內(nèi)的各項(xiàng)生理反應(yīng)[4-5]。同時(shí)鉛還具有與鈣、鐵和鋅等生物必需金屬離子相似的生理活性，能夠代替這些必需金屬離子與蛋白質(zhì)和分子結(jié)合，從而影響海洋雙殼類生物的生理代謝[6]。重金屬污染物尤其是Pb2+脅迫對(duì)貝類的影響主要集中在急性毒性、富集以及免疫因子影響等方面[7-9]，而關(guān)于Pb2+脅迫對(duì)貝類生理代謝影響的研究相對(duì)較少。耗氧率、濾水率、攝食率以及排氨率是反應(yīng)貝類新陳代謝活動(dòng)的基本指標(biāo)，同時(shí)也能反映貝類的生理狀況[10]。重金屬污染物通過(guò)在生物化學(xué)及細(xì)胞水平上對(duì)貝類產(chǎn)生毒性效應(yīng)，導(dǎo)致貝類新陳代謝水平降低，從而影響貝類的耗氧率、濾水率、攝食率以及排氨率等生理活動(dòng)。

牡蠣作為一種重要的經(jīng)濟(jì)貝類，因其成體終身營(yíng)固著生活，不可移動(dòng)，容易受到海洋污染的影響，對(duì)重金屬污染物具有極強(qiáng)的富集能力。且因其分布廣泛，種群數(shù)量大，因此牡蠣作為海洋重金屬污染的指示生物被廣泛應(yīng)用于研究中[11]。目前，關(guān)于重金屬對(duì)貝類毒性效應(yīng)的研究主要分為個(gè)體、細(xì)胞和分子三個(gè)水平，而且研究方向主要集中在細(xì)胞和分子水平上，貝類生長(zhǎng)、繁殖及代謝速率等生理指標(biāo)方面的研究較少。

本實(shí)驗(yàn)從太平洋牡蠣(Crassostreagigas)的生理代謝指標(biāo)入手，研究了牡蠣受到Pb2+脅迫及脅迫后排出Pb2+的過(guò)程中，貝類的濾水率、攝食率以及排氨率等生理指標(biāo)的變化，以期為牡蠣等養(yǎng)殖貝類的安全生產(chǎn)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，為養(yǎng)殖環(huán)境的重金屬污染風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估及漁業(yè)水質(zhì)監(jiān)測(cè)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料及試劑

實(shí)驗(yàn)于中國(guó)海洋大學(xué)生態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，采用煙臺(tái)乳山灣附近海域牡蠣養(yǎng)殖場(chǎng)養(yǎng)殖的太平洋牡蠣進(jìn)行研究。選取大小均勻、個(gè)體健壯的太平洋牡蠣作為實(shí)驗(yàn)材料，以確保實(shí)驗(yàn)對(duì)象的代表性及同一性。將牡蠣用毛刷洗刷干凈并去除表面的附著物后，置于聚乙烯養(yǎng)殖箱內(nèi)馴化3 d，養(yǎng)殖箱規(guī)格為0.8 m×0.5 m×0.8 m，馴化期間不投喂餌料，24 h連續(xù)充氣增氧。

馴化完成后的太平洋牡蠣以50～60個(gè)/m3繼續(xù)暫養(yǎng)，養(yǎng)殖用水取自青島太平角附近海域，經(jīng)過(guò)濾、曝氣后備用。保持養(yǎng)殖用水的pH值為7.5左右，鹽度29‰，培養(yǎng)光強(qiáng) 10 μmol·m-2·s-1，光周期為12 h∶12 h，培養(yǎng)溫度為(20±1)℃，每24 h換水1/2～2/3，連續(xù)充氣增氧。期間以金藻和青島大扁藻作為餌料投喂太平洋牡蠣。持續(xù)暫養(yǎng)直至太平洋牡蠣正常生活且死亡率低于5%，暫養(yǎng)結(jié)束的太平洋牡蠣用于毒性實(shí)驗(yàn)。選擇大小均勻，長(zhǎng)度為(2.0±0.5)cm的太平洋牡蠣進(jìn)行毒性實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)前1天停止投喂餌料。

脅迫實(shí)驗(yàn)采用的Pb(NO3)2重金屬污染物，為國(guó)藥集團(tuán)試劑有限公司分析純?cè)噭渲贸少|(zhì)量濃度為20 mg/mL的Pb2+母液，使用時(shí)用海水稀釋至所需濃度。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 太平洋牡蠣對(duì)Pb2+的富集和排出實(shí)驗(yàn)

參照急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇Pb2+的暴露濃度為0.2 mg/L，以自然過(guò)濾海水為對(duì)照組(未檢出Pb2+)，實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)平行組，實(shí)驗(yàn)時(shí)間為18 d。每組隨機(jī)投放40只已馴化的太平洋牡蠣，實(shí)驗(yàn)用牡蠣養(yǎng)殖箱為35 cm×20 cm×11 cm，每個(gè)養(yǎng)殖箱加入曝氣海水3 L。分別在第0、3、6、9、12、15天和18天取樣，每次隨機(jī)取5只，用于富集過(guò)程中生理活性的測(cè)定。實(shí)驗(yàn)期間每隔24 h更換含相應(yīng)Pb2+濃度的海水1次，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

根據(jù)急性毒性和富集實(shí)驗(yàn)結(jié)果，按照富集實(shí)驗(yàn)方法以0.2 mg/L的Pb2+持續(xù)脅迫18 d。實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)平行組，每組隨機(jī)投放40只已馴化的太平洋牡蠣。實(shí)驗(yàn)期間每隔24 h更換含相應(yīng)Pb2+濃度的海水1次，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。脅迫完成后，取出牡蠣以過(guò)濾海水充分沖洗，放入自然過(guò)濾海水中(未檢出Pb2+)，分別在第0、3、6、9、12、15天和18天取樣，每次隨機(jī)取5只，用于排出過(guò)程中生理活性的測(cè)定。實(shí)驗(yàn)期間每隔24 h更換海水1次，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.2 太平洋牡蠣對(duì)Pb2+富集和排出過(guò)程中耗氧率和排氨率的測(cè)定

在200 mL具塞磨口玻璃錐形瓶中裝滿過(guò)濾海水并溢出。將富集和排出步驟取出的實(shí)驗(yàn)?zāi)迪犧D(zhuǎn)移到錐形瓶中，每個(gè)錐形瓶放置5只牡蠣，每個(gè)處理組設(shè)三個(gè)平行樣。小心裝上瓶塞，使瓶?jī)?nèi)不留有氣泡，將錐形瓶放到恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h。同時(shí)設(shè)置對(duì)照瓶，只裝過(guò)濾海水，沒有實(shí)驗(yàn)?zāi)迪?。培養(yǎng)完畢，虹吸法取出海水，測(cè)定實(shí)驗(yàn)前后的溶解氧濃度和氨氮濃度，溶解氧采用Winkler碘量法測(cè)定，排氨率采用次溴酸鹽氧化法測(cè)定。牡蠣取出用于后續(xù)生理指標(biāo)測(cè)定[12]。

耗氧率由以下公式求出：

R=1 000×[(C0-Ct)×V]×0.7/(n×t)

在醫(yī)院感染防控當(dāng)中護(hù)理管理的作用是非常重要的,能夠有有效地預(yù)防與控制醫(yī)院感染的發(fā)生。要加強(qiáng)醫(yī)院護(hù)理管理工作,提高護(hù)理質(zhì)量,積極采取有效的措施預(yù)防醫(yī)院感染。

式中：R為單個(gè)牡蠣的耗氧率，mL/(ind·h)；Ct為培養(yǎng)瓶中氧的濃度，mg/L；C0為對(duì)照瓶中氧的濃度，mg/L；V為培養(yǎng)瓶中海水的體積，mL；n為每個(gè)錐形瓶中投放牡蠣的個(gè)數(shù)；t為培養(yǎng)時(shí)間，h；0.7為將氧的質(zhì)量轉(zhuǎn)化體積的系數(shù) [22.4(L)÷32(g)=0.7]。

排氨率由以下公式求出：

A=1 000×[(Kt-K0)×V]×1.2/(n×t)

式中：A為單個(gè)牡蠣的排氨率，mL/(ind·h)；Kt為培養(yǎng)瓶中氨氮的濃度，mg/L；K0為對(duì)照瓶中氨氮的濃度，mg/L；V為培養(yǎng)瓶中海水的體積，mL；n為每個(gè)錐形瓶中投放牡蠣的個(gè)數(shù)；t為培養(yǎng)時(shí)間，h；1.2為將氨氮質(zhì)量轉(zhuǎn)化為體積的系數(shù)[22.4(L)÷18(g)=1.2]。

1.2.3 太平洋牡蠣對(duì)Pb2+富集和排出過(guò)程中濾水率和攝食率的測(cè)定

濾水率和攝食率采用餌料濃差法測(cè)定，通過(guò)對(duì)比攝食瓶和對(duì)照瓶中餌料濃度的差異來(lái)研究Pb2+脅迫對(duì)牡蠣攝食的影響。

實(shí)驗(yàn)時(shí)，在數(shù)個(gè)100 mL燒杯中各加入80 mL適宜濃度的餌料培養(yǎng)液，并測(cè)定餌料的初始濃度。每個(gè)燒杯放置5只牡蠣，每個(gè)處理組設(shè)三個(gè)平行樣，同時(shí)設(shè)兩個(gè)不加實(shí)驗(yàn)?zāi)迪牭目瞻讓?shí)驗(yàn)。將燒杯放于黑暗處培養(yǎng)24 h，24 h后測(cè)定各燒杯中的藻細(xì)胞數(shù)。牡蠣的濾水率和攝食率按Frost(1972)的公式計(jì)算：

F=V×N×(lnCt-lnCtf) /t

G=F×(Ctf-C0)/(lnCtf-lnC0)

式中:F為濾水率，mL/(ind·h)，指一定量水樣中牡蠣個(gè)體或總個(gè)體數(shù)在單位時(shí)間內(nèi)濾過(guò)的含有一定數(shù)量浮游植物的水樣量；G為攝食率,cells/h，即為每只牡蠣單位時(shí)間里過(guò)濾的餌料細(xì)胞數(shù)；V為實(shí)驗(yàn)容器體積，mL；N為每個(gè)實(shí)驗(yàn)瓶中牡蠣個(gè)體數(shù)，ind；C0為起始餌料濃度，×104cells/mL；Ct為對(duì)照瓶中的最終餌料濃度，×104cells/mL；Ctf為實(shí)驗(yàn)瓶中最終餌料濃度，×104cells/mL；t為攝食時(shí)間，h。

1.3 數(shù)據(jù)處理

富集和排出實(shí)驗(yàn)完成后，根據(jù)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)利用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件，對(duì)每個(gè)實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行顯著性t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 太平洋牡蠣對(duì)Pb2+富集和排出過(guò)程中耗氧率的變化

太平洋牡蠣在對(duì)Pb2+的富集和排出過(guò)程中耗氧率的變化如圖1所示。當(dāng)太平洋牡蠣暴露于0.2 mg/L Pb2+濃度溶液中，隨著脅迫時(shí)間延長(zhǎng)，牡蠣的耗氧率持續(xù)提高，直至第12天時(shí)，牡蠣的耗氧率達(dá)到最大值。脅迫實(shí)驗(yàn)的第12至18天，太平洋牡蠣的耗氧率持續(xù)保持在較高的狀態(tài)，并且無(wú)顯著變化。在Pb2+的排出實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，0～3 d時(shí)，牡蠣的耗氧率顯著降低，至第6天，耗氧率降低到最低值，實(shí)驗(yàn)第9至12天，牡蠣的耗氧率與第6天相比沒有顯著變化。

圖1 Pb2+富集和排出過(guò)程中耗氧率的變化

2.2 太平洋牡蠣對(duì)Pb2+富集和排出過(guò)程中排氨率的變化

太平洋牡蠣在對(duì)Pb2+的富集和排出過(guò)程中排氨率的變化如圖2所示，與耗氧率變化基本相似。當(dāng)太平洋牡蠣暴露于濃度為0.2 mg/L 的Pb2+溶液中，隨著牡蠣對(duì)Pb2+的富集時(shí)間延長(zhǎng)，其排氨率逐漸升高。直至Pb2+暴露第12天時(shí)，排氨率達(dá)到最高值。脅迫實(shí)驗(yàn)的第12至18天，牡蠣的排氨率變化不顯著。在牡蠣對(duì)Pb2+的排出實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，隨著排出時(shí)間的延長(zhǎng)，排氨率顯著降低。在排出實(shí)驗(yàn)的0～3 d，排氨率呈現(xiàn)出顯著下降的趨勢(shì)，第6天時(shí)排氨率降低至最低值，實(shí)驗(yàn)第9至12天，牡蠣的排氨率與第6天相比沒有顯著變化。

圖2 Pb2+富集和排出過(guò)程中排氨率(×10-2)的變化

2.3 太平洋牡蠣對(duì)Pb2+富集和排出過(guò)程中濾水率的變化

從圖3可以看出，當(dāng)太平洋牡蠣受到濃度為0.2 mg/L 的Pb2+溶液脅迫時(shí)，在太平洋牡蠣對(duì)Pb2+的富集過(guò)程中，隨著牡蠣對(duì)Pb2+的富集時(shí)間延長(zhǎng)，牡蠣的濾水率顯著升高。直至脅迫實(shí)驗(yàn)進(jìn)行至第9天，濾水率達(dá)到最高值。富集實(shí)驗(yàn)的第12至18天，牡蠣的濾水率與第9天相比沒有顯著變化。在牡蠣對(duì)Pb2+的排出實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，隨著排出時(shí)間的延長(zhǎng)，濾水率顯著降低。在排出實(shí)驗(yàn)的0～3 d，濾水率呈現(xiàn)出顯著下降的趨勢(shì)，第6天時(shí)濾水率降低至最低值，實(shí)驗(yàn)第9至12天，牡蠣的濾水率與第6天相比沒有顯著變化。

圖3 Pb2+富集和排出過(guò)程中濾水率的變化

2.4 太平洋牡蠣對(duì)Pb2+富集和排出過(guò)程中攝食率的變化

結(jié)果如圖4所示，太平洋牡蠣在對(duì)Pb2+富集和排出過(guò)程中攝食率和濾水率的變化基本類似。當(dāng)太平洋牡蠣暴露于濃度為0.2 mg/L Pb2+溶液中，隨著富集時(shí)間的延長(zhǎng)，攝食率迅速提高。至第9天時(shí)，攝食率達(dá)到最大值，之后變化不顯著。在排出Pb2+過(guò)程中，隨著排出時(shí)間的延長(zhǎng)，攝食率的變化更加迅速和更加顯著。在排出的第3天，攝食率便呈現(xiàn)出了顯著性地下降，至第6天，降低到最低值，之后變化不明顯。

圖4 Pb2+富集和排出過(guò)程中攝食率(×104)的變化(cells·ind-1·h-1)

3 討論

將太平洋牡蠣重新轉(zhuǎn)移到無(wú)Pb2+的過(guò)濾海水中，太平洋牡蠣的生理活動(dòng)又迅速恢復(fù)到正常水平，其攝食率、濾水率、耗氧率和排氨率顯著降低至脅迫初始的數(shù)值，即在排出實(shí)驗(yàn)初期(0～6 d)，Pb2+對(duì)太平洋牡蠣的毒性效應(yīng)能夠被快速消除。陳海剛等[17]研究發(fā)現(xiàn)，近江牡蠣和翡翠貽貝能夠很迅速地將體內(nèi)的Pb排出，表明這兩種生物能很快地根據(jù)其生活環(huán)境的重金屬變化做出改變。還有研究表明，櫛孔扇貝在受到短期Pb污染后，轉(zhuǎn)入清潔海水后一段時(shí)間后，其體內(nèi)的Pb含量顯著降低，Pb的排出率能夠達(dá)到92%[18]。

由上述結(jié)果可以看出，在0.2 mg/L Pb2+脅迫下，太平洋牡蠣通過(guò)提高其生理代謝，包括攝食率、濾水率、耗氧率和排氨率等，來(lái)降低Pb對(duì)其產(chǎn)生的毒性效應(yīng)。將Pb2+誘導(dǎo)18 d的太平洋牡蠣放入潔凈海水中，牡蠣的生理代謝指標(biāo)在6 d左右就能夠恢復(fù)到脅迫前的水平。