貴州省2株牛種布魯氏菌分子流行病學特征分析

譚勤琴，王 月，劉 英，營 夏，楊幸貴，馬 青，胡 勇，李世軍

布魯氏菌病(Brucellosis，簡稱布病)是由布魯氏菌屬(Brucella)的細菌侵入機體，引起的人獸共患傳染-變態(tài)反應性疾病，已被我國《職業(yè)病分類和目錄》列為生物因素所致的職業(yè)病。人患布病以不規(guī)則發(fā)熱、關節(jié)炎為主要癥狀，雌性動物患布病以流產(chǎn)為主要特征，可造成巨大的經(jīng)濟損失。疫畜是布魯氏菌病的主要傳染源，疫牛使得牛種布魯氏菌在牛群中傳播，可引起牛群發(fā)生暴發(fā)性流產(chǎn)或不孕，嚴重影響畜牧業(yè)發(fā)展[1]。近年來隨著貴州省畜牧業(yè)的發(fā)展，散發(fā)或聚集性布病疫情在貴州省時有發(fā)生，特別是在貴州省大力發(fā)展奶牛、肉牛養(yǎng)殖之際，及時鑒定及分析牛種布魯氏菌株的分子流行病學特征，可為從事相關職業(yè)人群在布病防控方面提供科學依據(jù)。

布魯氏菌的生物型主要根據(jù)其宿主動物及病原體生化特征進行鑒定[2]，無法進行感染菌株的溯源分析。布魯氏菌基因組高度保守，單核苷酸多態(tài)性(SNP)是各種(型)菌的主要差異來源，rpoB基因在布魯氏菌各個種和生物型中均具有較高多態(tài)性，且分型結果明確[3]。多位點可變數(shù)目串聯(lián)重復序列分析(MLVA)分型技術分辨率高、重復性好，且已實現(xiàn)分型數(shù)據(jù)共享，可用于布魯氏菌的分子流行病學溯源分析[4-6]。而多位點序列分型(MLST)技術基于管家基因分型，且分辨力良好、比對方便，主要用于細菌進化關系及種群結構研究[5]。本研究采用rpoB、MLVA-16及MLST分型技術，對貴州省牛種布魯氏菌的遺傳特性及分子流行病學特征進行分析。

1 材料與方法

1.1 試驗菌株 2株分離株及動物用疫苗株(M5、S2及A19)。貴州省自2009年開始出現(xiàn)布病疫情以來，共計分離出2株牛種布魯氏菌，此2株分離株系2013年由劉英等[7]分離，依據(jù)其培養(yǎng)特性及傳統(tǒng)生化分型技術鑒定其為牛種3型布魯氏菌。布氏菌病活疫苗株系天康生物股份有限公司生產(chǎn)，貯藏于2～8 ℃，牛種布魯氏菌A19、羊種布魯氏菌M5及豬種布魯氏菌S2分別作為牛種、羊種及豬種布魯氏菌研究實驗的陽性對照菌株。

1.2 主要儀器與試劑 主要儀器有CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)、PCR擴增儀(美國Thermo公司)、凝膠成像儀(美國Bio-Rad公司)等。試劑主要為布魯氏菌瓊脂培養(yǎng)基(美國BD公司)、PCR試劑(New England Biolabs,Inc)和引物(由北京天一輝遠生物科技有限公司合成)。

1.3 分析工具 DNANAN和BioNumerics(Version 8.0)軟件及在線分析工具(http://mlva.i2bc.paris-saclay.fr、https://pubmlst.org/bigsdb?db=pubmlst_brucella_seqdef&page)。

1.4 研究方法

1.4.1 細菌培養(yǎng)及核酸提取 將保存菌株復蘇于布魯氏菌瓊脂平板上，根據(jù)細菌的生長情況于37 ℃培養(yǎng)24～48 h。按照《布魯氏菌病診斷》(WS 269-2019)中煮沸裂解法提取布魯氏菌基因組DNA，同時提取疫苗株M5、A19和S2的核酸作實驗用陽性對照。

1.4.2 BCSP31-PCR鑒定布魯氏菌屬 采用《布魯氏菌病診斷》(WS 269-2019)中提供的B4、B5引物序列、反應體系及擴增參數(shù)對2株分離株、3株疫苗株及陰性對照進行擴增，產(chǎn)物經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳后成像檢測。

1.4.3 AMOS-PCR鑒定布魯氏菌的種/型 參照《布魯氏菌病診斷》(WS 269-2019)中使用的引物序列、反應體系及擴增參數(shù)對2株分離株、3株疫苗株及陰性對照進行擴增，產(chǎn)物經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳后成像檢測。

1.4.4rpoB基因的多態(tài)性分型 運用文獻[8]使用的rpoB基因序列引物、反應體系及擴增參數(shù)對菌株核酸進行PCR擴增，1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物，有目標條帶的產(chǎn)物送公司進行雙向測序。下載NCBI在線網(wǎng)站中布魯氏菌16MrpoB基因序列(Gene ID:29593532)，以其基因序列為標尺，大多數(shù)布魯氏菌分子分型分析是基于布魯氏菌(16M)的全基因組測序而進一步研究[9-10]。運用DNAMAN軟件比對測序序列及參考序列，明確2株分離株的單核苷酸多態(tài)性位點，確定其rpoB基因型。

1.4.5 MLVA-16對菌株分型 采用文獻[11]使用的MLVA-16的16個重復序列位點引物序列、反應體系及擴增參數(shù)對菌株核酸進行擴增，1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物，Panel 1各位點擴增產(chǎn)物挑取差異序列送公司測序，測得序列去除側翼序列得出該位點重復序列的長度，Panel 2各位點擴增產(chǎn)物進行毛細管電泳，直接測得位點基因片段長度。下載MLVA在線數(shù)據(jù)庫(http://mlva.i2bc.paris-saclay.fr)里的中國各地牛種布魯氏菌代表株的MLVA型，用BioNumerics version 8 軟件經(jīng)非加權配對算術平均法進行聚類分析。

1.4.6 MLST對菌株分型 采用針對布魯氏菌7個管家基因(gap、dnaK、aroA、trpE、cobQ、gyrB和glk)和2個非管家基因(Omp25、int-hyp)為靶標基因的MLST分型技術。參照文獻[12]設計的引物序列、擴增體系及擴增參數(shù)進行擴增，產(chǎn)物經(jīng)1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，將有目標條帶大小的產(chǎn)物送公司進行測序。將序列結果運用BioEdit軟件將序列截短與參考序列長度一致，輸入https://pubmlst.org/bigsdb?db=pubmlst_brucella在線數(shù)據(jù)庫明確其定義值。若出現(xiàn)新序列，核對測序峰圖以確認該位點的堿基判定，核對無誤，進行再次擴增送樣檢測，如若兩次測得結果一致，則定義為一個新的等位基因。下載MLST在線數(shù)據(jù)庫(https://pubmlst.org/bigsdb?db=pubmlst_brucella)里的中國各地牛種布魯氏菌代表株的MLST型，用BioNumerics version 8 軟件經(jīng)非加權配對算術平均法進行聚類分析。

2 結 果

2.1 菌株培養(yǎng)結果 2株布魯氏菌分離株在布魯氏菌瓊脂平板上均呈現(xiàn)圓形、邊緣整齊、表面光滑濕潤、稍隆起、均質透明的菌落形態(tài)。

2.2 BSCP31-PCR鑒定結果 2株分離株及陽性對照菌株DNA的擴增產(chǎn)物均出現(xiàn)223 bp的特異性DNA擴增條帶，而陰性對照未出現(xiàn)擴增條帶，判定為布魯氏菌屬細菌。

2.3 AMOS-PCR鑒定結果 2株分離株無特異性條帶出現(xiàn)，M5出現(xiàn)分子量731 bp的特異條帶，A19出現(xiàn)大小為498 bp的特異條帶，S2出現(xiàn)285 bp的特異條帶；陰性對照無特異條帶出現(xiàn)，排除分離株為羊種、豬種1型、綿羊附睪種及牛種1、2、4型菌的可能。

2.4rpoB基因的多態(tài)性分型鑒定結果 2株分離株的rpoB序列經(jīng)與16MrpoB基因序列比對后發(fā)現(xiàn)有5個位點出現(xiàn)了堿基的改變，2株分離株均存在核酸序列729位點T→C(Condon 243 GAC)、804位點G→T(Condon 268 ACT)、1020位點G→A(Condon 340 GAA)、2211位點T→C(Condon 737 GTC)、2907位點C→T(Condon 969 CGT)的突變，如圖1(截取突變位點所在的序列)，位點變異模式與文獻[3,13]研究鑒定的牛種rpoBⅥ型(生物型為B.abortus7)相符合。

圖1 2株分離株與16M的rpoB基因序列比對圖Fig.1 Sequence comparison of the rpoB gene of the two isolate strains with 16M

2.5 MLVA-16分型鑒定結果 貴州省2株分離株的MLVA-8分型為36型，MLVA-11分型為72型，MLVA-16基因型為4-5-3-12-2-2-3-1-6-43-8-5-5-5-3-3。

2.6 MLVA聚類分析結果 基于MLVA-16分型分析數(shù)據(jù)，2株分離株與布魯氏菌標準株及國內(nèi)各地的牛種布魯氏菌代表株聚類分析顯示，貴州省牛種布魯氏菌與新疆布魯氏菌共享同一MLVA-16型，且與河北省、內(nèi)蒙古自治區(qū)的牛種布魯氏菌的相似性在92.2%以上，如圖2。

圖2 2株分離株與布魯氏菌標準株及國內(nèi)各地的牛種布魯氏菌代表株聚類分析樹狀圖Fig.2 Dendrogram based on MLVA genotyping analysis (UPGMA method),showing the correlation of two isolate stains with Brucella standard strains and representative strains of B. abortus throughout China

2.7 MLST分型鑒定結果 貴州省2株牛種布魯氏菌分離株的MLST基因譜相同，均為gap(2)、aroA(1)、glk(2)、dnaK(2)、gyrB(1)、trpE(3)、cobQ(1)、omp25(1)、Int-hyp(1)，符合ST2型各等位基因型特征，鑒定為ST2型。

2.8 MLST聚類分析結果 基于MLST分型分析數(shù)據(jù)，2株分離株與布魯氏菌標準株及國內(nèi)各地的牛種布魯氏菌代表株以位點距離≤2構建的最小間距圖顯示2株分離株與布魯氏菌屬內(nèi)的牛種布魯氏菌遺傳距離最近，屬同一個遺傳復合體，如圖3。17種ST 型等位基因譜及其對應布魯氏菌種見表1。

表1 17種ST型的等位基因譜及其對應的布魯氏菌種Tab.1 Allele profiles of 17 ST types and the corresponding Brucella species for each ST type

注：每個圓圈代表一種基因型，數(shù)字代表ST型別，圓圈大小對應該ST型分布的地區(qū)數(shù)量。圖3 2株分離株與布魯氏菌標準株及國內(nèi)各地的牛種布魯氏菌代表株聚類分析最小間距圖Fig.3 Clustering analysis minimum spanning tree (MST) mapping based on MLST genotype data of two isolate stains with Brucella standard strains and representative strains of B. abortus throughout China

3 討 論

布病對人類健康構成較大威脅，對畜牧業(yè)發(fā)展構成嚴重阻礙，近年來貴州省布病疫情呈現(xiàn)出不斷擴大的趨勢[15]，布魯氏菌分子流行病學特征分析對了解其遺傳變異、流行株的親緣關系等具有重要意義，分析貴州省牛種布魯氏菌菌株的分子流行病學特征，可為其防控工作提供科學依據(jù)。

本研究中，BCSP31-PCR技術鑒定2株分離菌為布魯氏菌屬細菌，結合AMOS-PCR檢測，該結果與先前報道為牛種3型布魯氏菌的結果相符[7]。進一步采用rpoB、MLVA及MLST技術對2株分離株分型，均證明了二者間的rpoB、MLVA及MLST型別一致，rpoB分型為rpoB牛種Ⅵ型，基于MLVA和MLST的聚類分析均顯示其與牛種布魯氏菌聚類最近，提示在布魯氏菌種的鑒定上，生物分型與子分型技術具有一致性。2株牛種分離株rpoB基因型與Marianelli等[3]研究的生物型為牛種7型的布魯氏菌rpoB基因型型別一致，提示布魯氏菌的生物型和rpoB基因型無明顯關聯(lián)性，與李明慧等[10]研究結果一致。有研究表明布魯氏菌rpoB基因序列出現(xiàn)變異可致利福平不能結合到RNA聚合酶β亞基，導致細菌對利福平耐藥[16-17]，但rpoB基因用于布魯氏菌分型的SNP位點與耐藥SNP位點是不一致的，分析2株分離株的rpoB基因序列，除了實現(xiàn)分型以外，同時也顯示2株菌可能為非耐藥菌株[17-19]，該結果可利于臨床用藥參考。大量研究表明[4-5,20-22]，MLVA技術分辨率高、重復性好且數(shù)據(jù)共享，可用于布魯氏菌的流行病學追蹤調查及確定菌株間的親緣關系，而MLST技術主要基于保守性高的管家基因分型，可用于分析布魯氏菌的種群結構和進化關系。MLVA聚類分析顯示，2株分離株與新疆牛種布魯氏菌共享同一MLVA-16型，且與河北省、內(nèi)蒙古自治區(qū)的牛種布魯氏菌的相似性在92.2%以上，提示分離株導致的布病感染疫情可能為有關聯(lián)的外省輸入性疫情，MLST聚類分析也得到同樣結果。

人間布病疫情是畜間布病疫情的風向標，根據(jù)流行病學調查資料顯示，2名奶牛場的養(yǎng)殖人員因出現(xiàn)發(fā)熱、乏力等不適反應先后前往醫(yī)院就診，經(jīng)檢測其布病抗體陽性，且經(jīng)血培養(yǎng)分離出牛種布魯氏菌，提示該養(yǎng)殖場可能存在牛種布魯氏菌的感染，2名患者可能因接觸感染牛種布魯氏菌的牛而感染布病。盡管牛種布魯氏菌的毒力弱，但其仍可對人致病并導致明顯的臨床癥狀，故必須引起重視。從基因型角度分析，2株牛種布魯氏菌間的親緣關系近，且與國內(nèi)各地牛種布魯氏菌代表株的遺傳距離較近，可能為輸入性布魯氏菌導致的疫情，提示貴州省的布病疫情防控須重點關注省內(nèi)外牲畜交易、配種等活動，執(zhí)行嚴格的檢驗檢疫，以保護本地畜牧業(yè)的健康發(fā)展。

利益沖突：無