疥螨Sar s 14.3過(guò)敏原蛋白原核表達(dá)及間接ELISA方法的建立

李 鑫，唐志強(qiáng)，張浩吉，唐文強(qiáng)，黨志勝，孫悅翔，李 靜，葉碧錦，黃福強(qiáng)

疥螨病是由疥螨科、疥螨屬的疥螨(Sarcoptesscabiei)寄生于人和其它動(dòng)物表皮內(nèi)所引起的一種接觸性、傳染性皮膚病[1-2]。嚴(yán)重感染的疥螨病由于痂皮及皮下存在大量的疥螨，病原學(xué)診斷能較易檢測(cè)到。但在普通感染的疥螨病例中，由于皮內(nèi)僅有少量的疥螨，且缺乏明顯的癥狀，因此病原學(xué)檢測(cè)較為困難，往往出現(xiàn)假陰性結(jié)果[1]。疥螨病免疫診斷多釆用疥螨粗提取物作為診斷抗原，但由于疥螨蟲(chóng)體小且缺少體外培養(yǎng)系統(tǒng)，很難短時(shí)間內(nèi)獲得足夠疥螨粗提取物用于疥螨病的免疫診斷[1]。因此，探尋特異性高、免疫性強(qiáng)的診斷抗原，開(kāi)發(fā)簡(jiǎn)單、高效的診斷方法顯得非常必要。

隨著高通量測(cè)序技術(shù)和相關(guān)組學(xué)研究的發(fā)展，越來(lái)越多物種的基因組和轉(zhuǎn)錄組學(xué)信息被揭示。Rider SD等(2015)[3]和Korhonen PK等(2020)[4]分別發(fā)表了關(guān)于疥螨犬變種和疥螨豬變種基因組草圖及相關(guān)組學(xué)的研究。疥螨基因草圖的公布為新的診斷標(biāo)志物和疫苗研發(fā)奠定了重要基礎(chǔ)。應(yīng)用基因組、蛋白質(zhì)組和轉(zhuǎn)錄組等生物信息學(xué)方法篩選靶標(biāo)分子，然后結(jié)合后續(xù)試驗(yàn)驗(yàn)證靶標(biāo)分子的有效性已經(jīng)成為挖掘診斷靶標(biāo)分子及寄生蟲(chóng)與宿主互作的一種有效策略[5]。在疥螨病免疫診斷的研究中發(fā)現(xiàn)，一些過(guò)敏原分子具有較好的診斷價(jià)值[6-9]。為了找出疥螨豬變種過(guò)敏原相關(guān)分子，本試驗(yàn)對(duì)所采集疥螨用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序并從頭組裝轉(zhuǎn)錄本，然后借助COMPARE過(guò)敏原數(shù)據(jù)庫(kù)(https://comparedatabase.org/)再結(jié)合BLASTx程序，預(yù)測(cè)組裝的疥螨轉(zhuǎn)錄組中過(guò)敏原數(shù)量和種類(lèi)。最后，為了今后開(kāi)展疥螨病診斷和流行病學(xué)調(diào)查，試驗(yàn)還用系列生物信息分析軟件對(duì)國(guó)外已報(bào)道的有較好早期診斷價(jià)值的疥螨過(guò)敏原Sar s 14.3蛋白[1,9]進(jìn)一步進(jìn)行了生物信息學(xué)分析、原核表達(dá)及純化，并利用該過(guò)敏原蛋白成功構(gòu)建了間接ELISA診斷方法。

1 材料與方法

1.1 疥螨豬變種轉(zhuǎn)錄組測(cè)序 在廣東某規(guī)?；i場(chǎng)里通過(guò)巡欄找到感染疥螨的豬(圖 1)。用勺子刮取病患交界處的皮膚組織，將采到的組織樣品挑取一小塊放入到干凈的大平皿中，再加入適量的超純水，混勻后在解剖顯微鏡下用挑蟲(chóng)針將疥螨一個(gè)一個(gè)挑出裝入PCR管中，挑取50只，然后用TransZol UP Plus RNA Kit提取總RNA。將所提取的總RNA送往上海派森諾生物工程有限公司進(jìn)行RNA-Seq測(cè)序及數(shù)據(jù)的處理。同時(shí)對(duì)采集的感染疥螨的豬皮屑按Omega Bio-tek Stool DNA Kit試劑盒所推薦的方法對(duì)皮屑樣品進(jìn)行DNA進(jìn)行提取，以鑒定物種，物種鑒定結(jié)果參見(jiàn)文獻(xiàn)[10]。

A：解剖鏡下雌性疥螨(400×)；B：嚴(yán)重感染疥螨的豬耳圖1 疥螨豬變種及其引起的病變Fig.1 Sarcoptes scabiei and its lesions

1.2 疥螨豬變種過(guò)敏原目的基因的檢索 從COMPARE過(guò)敏原數(shù)據(jù)庫(kù)(https://comparedatabase.org/)中下載過(guò)敏原蛋白質(zhì)序列及注釋文件，然后以轉(zhuǎn)錄組測(cè)序組裝的轉(zhuǎn)錄本數(shù)據(jù)為比對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)，以COMPARE過(guò)敏原數(shù)據(jù)庫(kù)中的過(guò)敏原蛋白序列為目標(biāo)數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)本試驗(yàn)組裝的轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行過(guò)敏原蛋白注釋(Cutoff:E<1E-20，Identity>30%)。

1.3 疥螨Sar s 14.3蛋白生物學(xué)特性預(yù)測(cè)

1.3.1 Sar s 14.3過(guò)敏原理化性質(zhì)預(yù)測(cè) 利用Expasy提供的在線(xiàn)工具ProtParam (http://web.expasy.org/protparam/)分析疥螨Sar s 14.3蛋白分子質(zhì)量、理論等電點(diǎn)、氨基酸組成、原子組成、不穩(wěn)定系數(shù)和總平均疏水性等理化性質(zhì)。同時(shí)應(yīng)用Phobius(https://phobius.sbc.su.se/)給定的默認(rèn)參數(shù)對(duì)疥螨Sar s 14.3蛋白序列進(jìn)行信號(hào)肽和跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)。

1.3.2 疥螨Sar s 14.3蛋白二、三級(jí)結(jié)構(gòu)分析 應(yīng)用SOMPA在線(xiàn)分析工具(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_sopma.html )對(duì)疥螨Sar s 14.3 二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)、分析，使用I-TASSER(https://zhanglab.dcmb.med.umich.edu/I-TASSER/)工具對(duì)疥螨Sar s 14.3 三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)、分析。

1.3.3 Sar s 14.3蛋白多序列的對(duì)比 將本次測(cè)序并從頭組裝的疥螨豬變種Sar s 14.3核酸序列與NCBI nr數(shù)據(jù)庫(kù)中所有蛋白進(jìn)行BLASTx比對(duì)，找出其同源序列。

1.4 疥螨Sar s 14.3重組蛋白表達(dá)、純化和鑒定 根據(jù)疥螨Sar s 14.3基因分析結(jié)果及原核表達(dá)宿主菌的密碼子優(yōu)化原則，由卡梅德生物科技(天津)有限公司合成并添加NdeI、XhoⅠ酶切位點(diǎn)，完成目的片段的合成。然后將其克隆到pET28a(+)表達(dá)載體上，構(gòu)建成功的重組表達(dá)載體命名為pET28a-Sar，并將構(gòu)建的pET28a-Sar轉(zhuǎn)化至Rosetta(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，涂板后37 ℃倒置培養(yǎng)過(guò)夜，再選取單克隆于5管LB培養(yǎng)基37 ℃培養(yǎng)至菌體OD600為0.6～0.8，加入IPTG至終濃度為0.5 mmol/L，培養(yǎng)4 h后離心，收菌制樣。向接種保種菌培養(yǎng)至菌體OD600為0.6～0.8后的4管培養(yǎng)物中加入IPTG至終濃度分別為0.2 mmol/L，分別在37 ℃和15 ℃下220 r/min培養(yǎng)4 h和16 h，誘導(dǎo)融合蛋白表達(dá)，各條件制樣SDS-PAGE分析最優(yōu)表達(dá)條件，最后取上一步各條件菌液離心收集菌體，破碎(PBS buffer,pH7.4)，上清、沉淀(用變性物將沉淀溶解制成“上清”樣品)分別制樣，SDS-PAGE進(jìn)行可溶性分析。采用Ni柱親和層析法對(duì)重組蛋白進(jìn)行純化，純化后分別將流傳液、裂解液、洗滌液和洗脫液進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)，純化步驟按照蛋白純化試劑盒(碧云天)說(shuō)明書(shū)。對(duì)表達(dá)純化后的Sar s 14.3 重組蛋白進(jìn)行Western blot驗(yàn)證，將疥螨兔陽(yáng)性血清(1∶200)作為一抗孵育，山羊抗兔 HRP-IgG(1∶1 000)作為二抗孵育，對(duì)其反應(yīng)原性進(jìn)行鑒定。

1.5 疥螨Sar s 14.3重組蛋白間接ELISA方法的建立

1.5.1 血清 建立方法所用標(biāo)準(zhǔn)血清：疥螨豬陽(yáng)性血清，為采自經(jīng)病原學(xué)和PCR檢測(cè)呈陽(yáng)性的豬；疥螨豬陰性血清，采自無(wú)疥螨感染史的豬場(chǎng)且無(wú)任何臨床癥狀的豬。

1.5.2 棋盤(pán)法確定包被抗原濃度與血清的最佳倍工作濃度 用包被液將重組蛋白進(jìn)行稀釋?zhuān)K濃度分別為0.5 μg/mL、1 μg/mL、2 μg/mL、3 μg/mL，每個(gè)孔加入100 μL稀釋后的蛋白，4 ℃過(guò)夜包被，重復(fù)3組；PBST洗滌5次，每次5 min；使用5%脫脂奶粉對(duì)包被板進(jìn)行封閉處理，37 ℃ 2 h；甩去封閉液，PBST洗滌。

標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清與陰性血清按照1∶100、1∶200、1∶400和1∶800稀釋后，加入包被板中，每孔100 μL，每個(gè)稀釋度重復(fù)3次，37 ℃孵育1 h;PBST洗滌，方法同上；將HRP標(biāo)記兔抗豬IgG按1∶2 000稀釋?zhuān)靠?00 μL，37 ℃孵育30 min。避光環(huán)境下每孔加入100 μL的TMB顯色液，室溫孵育15 min后，每孔加入50 μL的終止液，用酶標(biāo)液測(cè)定OD450值，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，確定重組蛋白作為包被抗原時(shí)，最佳的抗原和血清的工作濃度。

1.5.3 包被時(shí)間、封閉液、封閉時(shí)間、孵育時(shí)間及二抗稀釋倍數(shù)的確定 將抗原用最適包被濃度包被至酶標(biāo)板中，分別在37 ℃ 1 h后4 ℃過(guò)夜、37 ℃ 2 h后4 ℃過(guò)夜、4 ℃過(guò)夜、37 ℃ 2 h的條件對(duì)抗原最佳包被時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化，其余操作與1.5.2一致。最后通過(guò)OD450值確定最佳包被條件。為確定不同種類(lèi)的封閉液和封閉時(shí)間是否會(huì)影響OD450值，選擇5%脫脂奶粉、5% BSA、抗體稀釋液在37 ℃條件下各孵育1 h、1.5 h、2 h，每個(gè)條件重復(fù)3次，封閉液加入的劑量都為200 μL/孔。以P/N比的大小決定最佳封閉時(shí)間和封閉液。用最佳包被濃度及包被時(shí)間將抗原包被至酶標(biāo)板，在血清以最佳稀釋濃度稀釋好后，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)分別孵育0.5 h、1 h、1.5 h、2 h；使用PBST洗滌后；將HRP標(biāo)記兔抗豬IgG以1∶2 000、1∶4 000、1∶6 000、1∶8 000的比例進(jìn)行稀釋?zhuān)謩e加到不同血清孵育時(shí)間后的孔內(nèi)，37 ℃孵育0.5 h。

2 結(jié) 果

2.1 疥螨豬變種參考轉(zhuǎn)錄本組裝 通過(guò)測(cè)序并拼接可獲得轉(zhuǎn)錄本序列。提取每個(gè)基因下最長(zhǎng)的轉(zhuǎn)錄本作為該基因的代表轉(zhuǎn)錄本即獲得疥螨豬變種的參考轉(zhuǎn)錄組，參考轉(zhuǎn)錄組信息見(jiàn)表1。

表1 疥螨豬變種參考轉(zhuǎn)錄組信息Tab.1 Overview of reference transcriptome information for Sarcoptes scabiei var. suis

2.2 疥螨豬變種轉(zhuǎn)錄本過(guò)敏原預(yù)測(cè) 用本次測(cè)序所構(gòu)建參考轉(zhuǎn)錄組中18 980個(gè)轉(zhuǎn)錄本檢索COMPARE過(guò)敏原數(shù)據(jù)庫(kù)中的蛋白序列共獲得390個(gè)過(guò)敏原候選分子(Table S1)，其中有28個(gè)基因序列的E值(隨機(jī)匹配可能性)為0(Table S1)，本實(shí)驗(yàn)組裝的轉(zhuǎn)錄本(TRINITY_DN12024_c0_g1)按照編碼蛋白翻譯出的Sar s 14.3過(guò)敏原蛋白氨基酸序列與已發(fā)表的人源(Q8I9R5/AAO15613)、豬源(R9RIP2/AGM48615)疥螨第14組分過(guò)敏原(Group 14 allergen)蛋白部分序列、犬源(A0A132AJ56/KPM11048)和豬源(A0A834REG9/KAF7495137)疥螨第14組分過(guò)敏原蛋白序列比對(duì)部分相似性為100%(圖2)，提示疥螨過(guò)敏原Sar s 14.3氨基酸序列在不同宿主來(lái)源疥螨比較保守，能檢測(cè)不同宿主來(lái)源疥螨血清。

圖2 不同宿主來(lái)源疥螨第14組分過(guò)敏原蛋白(Sar s 14)C端氨基酸序列比對(duì)TRINITY_DN12024_c0_g1為本實(shí)驗(yàn)拼接并翻譯的氨基酸序列Fig.2 C-terminal amino acid sequence alignment of group 14 allergen (Sar s 14) from different hosts of Sarcoptes scabiei TRINITY_DN12024_c0_g1 was the spliced and translated amino acid sequence in this experiment

2.3 Sar s 14.3蛋白理化性質(zhì) 疥螨Sar s 14.3蛋白由330個(gè)氨基酸構(gòu)成，理論分子質(zhì)量約為38 kDa；理論pI值為8.59；其中含有57個(gè)強(qiáng)堿性(+)氨基酸(K，R)和54個(gè)強(qiáng)酸性(-)氨基酸(D，E)；原子組成為C1694H2693N473O521S13；不穩(wěn)定系數(shù)為29.76，歸類(lèi)為穩(wěn)定蛋白(小于40時(shí)，預(yù)測(cè)蛋白為穩(wěn)定)；平均親水系數(shù)(GRAVY)為-0.920，歸類(lèi)為親水性蛋白(GRAVY值的范圍在-2到2之間，負(fù)值表明為親水性蛋白)，且通過(guò)Phobius軟件預(yù)測(cè)Sar s 14.3蛋白不含信號(hào)肽及跨膜域，但預(yù)測(cè)該蛋白位于非細(xì)胞質(zhì)部分，提示能分泌到細(xì)胞外。

2.4 Sar s 14.3蛋白二、三級(jí)結(jié)構(gòu)分析 SOPMA二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果(圖3)顯示，Sar s 14.3蛋白α-螺旋占4.55%(15個(gè)氨基酸)；β-折疊占41.82%(138個(gè)氨基酸)；無(wú)規(guī)則卷曲占53.64%(177個(gè)氨基酸)。同樣I-TASSER三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示Sar s 14.3蛋白空間結(jié)構(gòu)也主要以β-折疊和無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)為主(圖4)。其中無(wú)規(guī)則卷曲較集中的部位形成抗原表位的可能性較大。

藍(lán)色：α-螺旋；紅色：β-折疊；紫色：無(wú)規(guī)則卷曲區(qū)域圖3 疥螨Sar s 14.3蛋白SOPMA二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.3 Prediction of the secondary structure of Sar s 14.3 protein of Sarcoptes scabiei by SOPMA

圖4 疥螨Sar s 14.3蛋白I-TASSER三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.4 Prediction of the tertiary structure of Sar s 14.3 protein of Sarcoptes scabiei by I-TASSER

2.5 Sar s 14.3蛋白同源性及系統(tǒng)進(jìn)化分析 通過(guò)在線(xiàn)BLASTx對(duì)疥螨Sar s 14.3進(jìn)行同源性比對(duì)發(fā)現(xiàn)本次通過(guò)高通量測(cè)序組裝的豬疥螨Sar s 14.3蛋白序列與野豬疥螨(KAF7495137)、犬疥螨(KPM11048.1)和人疥螨(AAO15613.1)局部一致性均為100%；與粉塵螨(BAA04558.1、P39673)、埋內(nèi)歐塵螨序列(OTF81155.1)和屋塵螨序列(AAM21322)局部一致性也達(dá)50%以上(表2)。

表2 疥螨豬變種Sar s 14.3過(guò)敏原蛋白序列NCBI BLASTx比對(duì)結(jié)果Tab.2 Results of NCBI BLASTx alignment of Sar s 14.3 protein sequences of Sarcoptes scabiei

表2(續(xù))物種蛋白描述E值一致性/%序列登錄號(hào)埋內(nèi)歐塵螨High molecular weight allergen M-177 pre-cursor 4.00E-17058.8AAF14270埋內(nèi)歐塵螨Allergen-like protein (Apolipophorin-like) 2.00E-4353OTF70165熱帶無(wú)爪螨Allergen Blo t Mag 1 2.00E-11349.55AAM10780熱帶無(wú)爪螨Group 14 allergen Blo t 14 7.00E-12846.39ABU97467橢圓食粉螨Allergen Ale o 14 Mag 1 5.00E-7045.87ABU97462.雪果繞實(shí)蠅Uncharacterized protein 2.00E-11442.17XP_017492868

2.6 pET28a-Sar鑒定結(jié)果 將提取的質(zhì)粒經(jīng)QuickCUtTMXhoⅠ、QuickCutTMXbaI酶切后，通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖5所示：酶切后所得片段大小與預(yù)期結(jié)果基本一致(pET28a:5 369 bp，目的基因：1 005 bp)。

2.7 Sar s 14.3重組蛋白表達(dá)、純化和鑒定 在選定的最佳條件下對(duì)重組表達(dá)菌誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE檢測(cè)細(xì)菌破碎后的上清和沉淀，蛋白主要以包涵體形式存在(圖6)。將包涵體蛋白通過(guò)Ni柱層析親和純化后，對(duì)收集的穿流液、裂解液、洗滌液和洗脫液進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果顯示純化后的目的蛋白在洗脫液中有一條約40 kDa 的目的條帶，第5道洗脫液中目的蛋白的量較多，純化效果好(圖7)。將純化后的疥螨Sar s 14.3重組蛋白經(jīng)聚丙烯凝膠電泳后，進(jìn)行免疫印跡實(shí)驗(yàn)，如圖8所示，純化后的蛋白可以與疥螨兔陽(yáng)性血清發(fā)生明顯的反應(yīng)，表明疥螨Sar s 14.3重組蛋白具有良好的反應(yīng)原性。

M：Marker；1：重組質(zhì)粒雙酶切；：目的基因圖5 重組質(zhì)粒鑒定結(jié)果Fig.5 Recombinant plasmid identification results

M：Marker；1：誘導(dǎo)上清；2：誘導(dǎo)沉淀；：目的基因圖6 Sar s 14.3重組蛋白可溶性分析Fig.6 Sar s 14.3 recombinant protein solubility assay

M：Marker；1：穿流液；2：變性裂解液；3：變性洗滌液；4-6：變性洗脫液圖7 Sar s 14.3重組蛋白的純化Fig.7 Purification of Sar s 14.3 recombinant protein

M：Marker；1：疥螨陽(yáng)性血清(兔，多克隆抗體)；2：疥螨陰性血清(兔)圖8 重組蛋白 Western blot 鑒定Fig.8 Western blot identification of Sar s 14.3 recombinant protein

2.8 疥螨Sar s 14.3重組蛋白間接ELISA方法的建立

2.8.1 抗原最佳包被濃度和血清最佳稀釋度的確定 使用方陣法對(duì)抗原包被濃度和血清最佳稀釋倍數(shù)進(jìn)行確定，結(jié)果顯示，當(dāng)抗原包被濃度為2 μL/mL，血清稀釋倍數(shù)為1∶400，其疥螨豬陽(yáng)性血清OD450與陰性血清OD450比值(P/N值)最大為6.277(表 3)，表示此條件抗原包被濃度及血清稀釋倍數(shù)最佳。

表3 最佳抗原包被濃度和血清稀釋倍數(shù)Tab.3 Optimum antigen coating concentration and serum dilution ratio

2.8.2 抗原最佳包被條件的確定 抗原在4 ℃包被過(guò)夜的條件下，所測(cè)的陽(yáng)性血清OD450與陰性血清比值最大(表4)，可作為最佳包被條件。

表4 抗原包被最佳條件Tab.4 Optimum conditions for antigen encapsulation

2.8.3 最佳封閉液和封閉時(shí)間的確定 當(dāng)使用5%脫脂奶粉，37 ℃條件下封閉1 h時(shí)，封閉效果最佳，P/N最高(表5)。

表5 37 ℃下最佳封閉液和封閉時(shí)間Tab.5 Optimum sealing fluid and sealing time at 37 ℃

2.8.4 最佳血清孵育時(shí)間和二抗稀釋倍數(shù)的確定 當(dāng)血清于37 ℃孵育1.5 h，二抗稀釋倍數(shù)為1∶4 000時(shí)，P/N值達(dá)到最大(表6)，故此可以確定該方法為最佳的孵育時(shí)間和稀釋倍數(shù)。

表6 最佳血清孵育時(shí)間和二抗稀釋倍數(shù)Tab.6 Optimum incubation time of serum and dilution ratio of secondary antibody

2.8.5 酶標(biāo)二抗孵育時(shí)間與底物顯色時(shí)間的確定 通過(guò)方陣滴定法對(duì)酶標(biāo)二抗孵育時(shí)間和顯色時(shí)間進(jìn)行篩選，當(dāng)二抗于37 ℃孵育1 h，室溫顯色20 min，所得P/N值最大，為最佳條件(表7)。

表7 37 ℃下最佳酶標(biāo)二抗孵育時(shí)間和底物顯色時(shí)間Tab.7 Optimum incubation time of HRP-conjugated secondary antibody and chromogenic time of substrate at 37 ℃

2.8.7 批內(nèi)和批間重復(fù)性試驗(yàn) 選取3份疥螨豬陽(yáng)性血清樣本，使用同一批次純化的蛋白，以最佳ELISA檢測(cè)方法，每份樣品重復(fù)3次，批內(nèi)變異系數(shù)介于1.2%～5.3%，均小于10%，從而表示所建立ELISA檢測(cè)方法批內(nèi)重復(fù)性較好。另外選取3份疥螨豬陽(yáng)性血清樣本，使用不同一批次純化的蛋白，以最佳ELISA檢測(cè)方法，每份樣品重復(fù)3次，批內(nèi)變異系數(shù)介于2.5%～7.1%，均小于10%，從而表示所建立ELISA檢測(cè)方法批間重復(fù)性較好。

3 討 論

疥螨病作為一種危害生豬健康的寄生蟲(chóng)病，嚴(yán)重影響著生豬產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。由于疥螨病易與過(guò)敏性皮炎、禿毛廯、濕疹及其他原因引起的脫毛性疾病相混淆，臨床上需要對(duì)疥螨病進(jìn)行鑒別診斷[2]。目前對(duì)疥螨病診斷的金標(biāo)準(zhǔn)仍然是病原學(xué)檢查，但幾乎有一半的疥螨病例皮屑檢查看不到病原[1-2]，因此血清學(xué)檢查就成為疥螨病診斷尤其是早期診斷的一種有效輔助診斷方法。目前比較流行的疥螨血清學(xué)診斷方法主要是用疥螨的粗抗原或排泄抗原檢查血清中的IgG或IgE抗體[1,9,11]，但疥螨蟲(chóng)體抗原或排泄抗原較難獲取，因此尋找新的診斷抗原靶標(biāo)就顯得極為迫切。

為了對(duì)疥螨病進(jìn)行有效診斷，近年來(lái)重組過(guò)敏原用于疥螨診斷的案例不斷增加[12]，且表現(xiàn)出一定優(yōu)勢(shì)。本試驗(yàn)通過(guò)RNA-Seq.測(cè)序共獲得18 980個(gè)轉(zhuǎn)錄本，通過(guò)與過(guò)敏原數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列進(jìn)行相似性比對(duì)在疥螨豬變種轉(zhuǎn)錄組中共發(fā)現(xiàn)390條過(guò)敏原相關(guān)序列，且大部分過(guò)敏原都與塵螨屬過(guò)敏原有一定的同源性。這些預(yù)測(cè)的過(guò)敏原序列將極大的減少對(duì)疥螨診斷抗原篩選的盲目性。EggNOG分類(lèi)顯示，預(yù)測(cè)的疥螨過(guò)敏原分子中的多數(shù)包含在下列分類(lèi)：“碳水化合物轉(zhuǎn)運(yùn)及代謝(G:Carbohydrate transport and metabolism)”、“翻譯后修飾、蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)及分子伴侶(O:Posttranslational modification,protein turnover,chaperones)”和“細(xì)胞骨架(Z:Cytoskeleton)”，提示過(guò)敏原分子能參與多種生物學(xué)進(jìn)程。

Sar s 14.3過(guò)敏原序列首先由Fischer等在人疥螨cDNA文庫(kù)中篩選出來(lái)，其克隆出的mRNA長(zhǎng)度為991 bp，編碼330個(gè)氨基酸[13]，位于相當(dāng)于粉塵螨過(guò)敏原第14組分(Der p 14)氨基酸序列的1263-1655區(qū)間[13]。隨著近幾年多個(gè)不同物種宿主來(lái)源疥螨基因組的解析，發(fā)現(xiàn)疥螨基因組中過(guò)敏原第14組分編碼基因(Sars14)有5 004個(gè)核苷酸，可編碼1 667個(gè)氨基酸，Sar s 14.3氨基酸序列位于Sar s 14編碼蛋白氨基酸序列的1306-1585區(qū)間[3-4]，且其對(duì)普通感染疥螨的人血清的IgE有高度的結(jié)合力[12]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)高通量測(cè)序亦發(fā)現(xiàn)在疥螨豬變種中同樣有Sars14.3基因的轉(zhuǎn)錄(FPKM=55.1)，且翻譯的蛋白質(zhì)序列與人疥螨Sar s 14.3蛋白序列相似性為100%。通過(guò)生物信息軟件分析發(fā)現(xiàn)Sar s 14.3蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)主要以無(wú)規(guī)則卷曲和β-折疊為主，phobius在線(xiàn)軟件預(yù)測(cè)其不含信號(hào)肽和跨膜域，但位于非細(xì)胞質(zhì)的部分，由于Sar s 14.3蛋白氨基酸序列為Sars14.3基因編碼蛋白的部分序列，且全長(zhǎng)Sar s 14蛋白中有一段信號(hào)肽序列，推斷Sar s 14.3蛋白很可能分泌到細(xì)胞外參與寄生蟲(chóng)-宿主互作過(guò)程。

從疥螨各變種Sar s 14.3蛋白氨基酸序列的BLAST局部比對(duì)結(jié)果來(lái)看，疥螨各變種中Sar s 14.3蛋白氨基酸序列相似性很高(大于99.7%)。以往的研究認(rèn)為雖然不同宿主來(lái)源的疥螨其生物特性有所不同，甚至還具有一定的宿主特異性[1-2]，但通過(guò)分析疥螨各物種分離株的核糖體ITS2基因序列[14-15]和已測(cè)序的基因組[3-4]來(lái)看，不同宿主來(lái)源疥螨應(yīng)為同一個(gè)種。本研究通過(guò)分析疥螨Sar s 14.3蛋白氨基酸序列也同樣得到相似的結(jié)論。以上結(jié)果說(shuō)明即使是用不同宿主來(lái)源的疥螨重組過(guò)敏原Sar s 14.3分子也可以診斷來(lái)自其他動(dòng)物和人的疥螨病。

近年來(lái)，隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，國(guó)民的生活水平也在不斷地提高，促使寵物養(yǎng)殖和國(guó)家的畜牧業(yè)發(fā)展也越來(lái)龐大。目前畜禽的養(yǎng)殖模式都是集約化的養(yǎng)殖，動(dòng)物生長(zhǎng)的環(huán)境比較擁擠、潮濕，這些條件都很適合疥螨病的傳播和流行。目前針對(duì)疥螨病的診斷主要是病原學(xué)診斷，在潛伏期和早期很難直接檢測(cè)到蟲(chóng)體或蟲(chóng)卵[16]?？梢栽\斷疥螨病的檢測(cè)試劑盒多是采用成蟲(chóng)粗抗原檢測(cè)血清中總免疫球蛋白，這種方法的缺點(diǎn)在于假陰性和假陽(yáng)性率較高，診斷抗原制作困難，并且難以形成標(biāo)準(zhǔn)化。因此，應(yīng)用成分明確的重組抗原替代粗抗原，建立高靈敏度的診斷方法，是免疫診斷試劑盒研制的必然趨勢(shì)。

ELISA是一種用于檢測(cè)特異性抗體和可溶性抗原的異質(zhì)免疫分析技術(shù)，可用于定量或定性分析，無(wú)需復(fù)雜或昂貴的設(shè)備[17]，是目前應(yīng)用較為廣泛的血清學(xué)診斷方法。該方法在特定酶的催化作用下，抗原抗體反應(yīng)被放大，具有很高的敏感度[18]。雖然用PCR檢測(cè)疥螨準(zhǔn)確率較高[19]，但相對(duì)于PCR檢測(cè)方法，間接ELISA檢測(cè)法操作時(shí)間更短、所需勞動(dòng)量更少且單次可以檢測(cè)大量的樣品[20]。ELISA實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性的關(guān)鍵是要降低非特異性反應(yīng)的結(jié)合，本試驗(yàn)建立的間接ELISA方法僅以純化后的疥螨Sar s 14.3重組蛋白作為包被抗原，可以有效的降低假陽(yáng)性的產(chǎn)生。本試驗(yàn)結(jié)果中陽(yáng)性和陰性血清的OD值都偏高，這可能是由于蛋白的濃度偏高。經(jīng)過(guò)多次篩選和不斷對(duì)間接ELISA檢測(cè)方法的條件進(jìn)行優(yōu)化，最終確定的最佳抗原包被濃度為2 μL/mL，在4 ℃包被過(guò)夜，用5%脫脂奶粉，37 ℃條件下封閉1 h。驗(yàn)證所建立的間接ELISA診斷方法時(shí)，批間和批內(nèi)的變異系數(shù)均小于10%，說(shuō)明其重復(fù)性良好，該重組蛋白適合作為檢測(cè)抗原。由于本試驗(yàn)中未找到感染其他寄生蟲(chóng)的患病豬的陽(yáng)性血清，但本實(shí)驗(yàn)室保存有人工實(shí)驗(yàn)感染棘球蚴、賈第蟲(chóng)和胞內(nèi)勞森菌的小鼠陽(yáng)性血清檢測(cè)，用上述小鼠的血清與疥螨豬標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清和陰性血清進(jìn)行了交叉實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示上述感染小鼠血清OD450值均小于0.341，結(jié)果為陰性，說(shuō)明本次建立的間接ELISA方法有一定的特異性，但還需與一些同源性更近的患寄生蟲(chóng)病尤其是癢螨病的病豬的陽(yáng)性血清來(lái)比較才能使建立的間接ELISA診斷方法的特異性檢驗(yàn)更加確信。

本試驗(yàn)通過(guò)高通量測(cè)序獲得了18 980條疥螨轉(zhuǎn)錄本序列，并預(yù)測(cè)出其中有390條轉(zhuǎn)錄本與過(guò)敏原有同源性，所預(yù)測(cè)的過(guò)敏原序列主要參與與碳水化合物轉(zhuǎn)運(yùn)、翻譯后修飾、蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)及細(xì)胞骨架構(gòu)成等生物學(xué)過(guò)程。通過(guò)對(duì)豬疥螨Sar s 14.3蛋白結(jié)構(gòu)及功能分析預(yù)測(cè)顯示，該蛋白很可能分泌到細(xì)胞外與宿主互作，同時(shí)同源性分析提示疥螨Sar s 14.3與塵螨遺傳距離較遠(yuǎn)，疥螨屬各變種遺傳距離非常近，可以用一個(gè)物種中克隆表達(dá)出的Sar s 14.3重組抗原診斷不同動(dòng)物和人的疥螨病。

利益沖突：無(wú)