樂(lè)都紫皮大蒜4種病毒多重RT-PCR檢測(cè)技術(shù)的建立

張 超，董怡衡，岳 苗，衛(wèi) 唯，張 謙，王 樂(lè)，尹 衛(wèi)，王煜偉，梁 健

(青海大學(xué) 省部共建三江源生態(tài)與高原農(nóng)牧業(yè)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧 810016)

大蒜(AlliumsativumL.)屬百合科蔥屬植物，其主要生殖方式為無(wú)性繁殖，通常采用鱗莖繁殖。但無(wú)性繁殖會(huì)使病毒在大蒜營(yíng)養(yǎng)器官中積累，并通過(guò)母體鱗莖垂直傳染給子代，導(dǎo)致大蒜種性退化,產(chǎn)量下降。

大蒜病毒常呈復(fù)合性侵染出現(xiàn)，侵染后的鱗莖發(fā)育遲滯、品質(zhì)變差，嚴(yán)重影響大蒜的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。本課題組通過(guò)對(duì)青海樂(lè)都紫皮大蒜進(jìn)行全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序發(fā)現(xiàn)，樂(lè)都紫皮大蒜被洋蔥黃矮病毒(onion yellow dwarf virus,OYDV)、大蒜潛隱病毒(garlic latent virus,GLV)、大蒜D病毒(garlic virus D,GarVD)和大蒜X病毒(garlic virus X,GarVX)4種病毒復(fù)合侵染。目前，已報(bào)道的侵染蔥屬植物的病毒性病原主要有3大類，其中洋蔥黃矮病毒屬于第一大類馬鈴薯Y病毒屬(Potyvirus)，由Giddings和Henderson等于1916年在洋蔥植株上發(fā)現(xiàn)，主要表現(xiàn)為植株矮化和葉片黃化[1-2]，此后該病毒在世界范圍內(nèi)廣泛傳播[3]。大蒜潛隱病毒屬于第二大類香石竹潛隱病毒屬(Carlavirus)，最早由van Dijk[4]在1993年發(fā)現(xiàn)，該病毒主要由蚜蟲(chóng)以非持久方式傳播，其為單鏈正義RNA 病毒，基因組RNA包裹在長(zhǎng)610～690 nm 的線狀病毒粒子中，在荷蘭、中國(guó)、德國(guó)和日本等都有報(bào)道[5-7]；大蒜X病毒和大蒜D病毒屬于第三大類青蔥X病毒屬(Allexivirus)。1995年Arshava等[8]確定了青蔥X病毒屬的成員，其中大蒜X病毒(GarVX)是一種單鏈正義RNA病毒，侵染范圍很廣，危害超過(guò)65種農(nóng)作物和觀賞植物[9-13]；陳炯等[14]研究發(fā)現(xiàn)，大蒜X病毒與大蒜D病毒的序列相似性較高，且我國(guó)境內(nèi)已鑒定的大蒜X病毒與大蒜D病毒均具有較高的相似性。

大蒜病毒的檢測(cè)方法有多種，包括傳統(tǒng)的指示植物法、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)，以及現(xiàn)有的病毒血清學(xué)鑒定、電鏡法和分子生物學(xué)方法等相關(guān)技術(shù)。在分子生物學(xué)方法中，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法因其靈敏度高、特異性強(qiáng)，被廣泛應(yīng)用于病毒的檢測(cè)和鑒定[15-17]。在本研究所涉及的4種病毒中，洋蔥黃矮病毒的檢測(cè)多通過(guò)RT-PCR和ELISA方法進(jìn)行[18]；大蒜潛隱病毒檢測(cè)則采用較為傳統(tǒng)的指示植物法和DAS-ELISA法，但需使用RT-PCR進(jìn)一步提高檢測(cè)的特異性與靈敏度，避免假陽(yáng)性[19]；大蒜X病毒(GarVX)與大蒜D病毒(GarVD)，可使用反轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)( RT-LAMP) 進(jìn)行檢測(cè)。前期部分研究已針對(duì)大蒜病毒開(kāi)展了多重檢測(cè)體系的開(kāi)發(fā)工作，如許蕊等[20]在甘肅‘成縣遲蒜’上針對(duì)GLV、LYSV、OYDV 3種病毒所建立的多重檢測(cè)方法；汪沛[21]在湖南長(zhǎng)沙、茶陵感病大蒜上針對(duì)OYDV、 LYSV、SLV、Allexiviruses 4種病毒建立了檢測(cè)方法。相較于單一RT-PCR，多重RT-PCR實(shí)現(xiàn)了一次反應(yīng)多目標(biāo)同時(shí)檢測(cè)，可提高效率，降低檢測(cè)成本。為此，本研究通過(guò)優(yōu)化引物設(shè)計(jì)和反應(yīng)條件，建立了一種可同時(shí)檢測(cè)樂(lè)都紫皮大蒜OYDV、GLV、GarVD和GarVX 4種病毒的多重RT-PCR技術(shù)體系，以期為樂(lè)都紫皮大蒜病毒快速檢測(cè)、脫毒效果判定等實(shí)際需求提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材 料

本研究以青海樂(lè)都紫皮大蒜，以及從重慶(CQ)、云南(YN)、安徽(AH)、新疆(XJ)、內(nèi)蒙古(NMG)、張掖(ZY)、四川(SC)、山東(SD)、天津(TJ)、海南(HN)、遼寧(LN)和貴州(GZ)12個(gè)地區(qū)引入青海樂(lè)都種植的大蒜品種為試驗(yàn)材料。于生長(zhǎng)盛期采集大蒜葉片，迅速置于液氮中速凍，帶回實(shí)驗(yàn)室后轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 樂(lè)都紫皮大蒜葉片總 RNA 提取

采用天根RNAprep 總RNA抽提試劑盒提取樂(lè)都紫皮大蒜葉片總RNA，吸取2 μL用于凝膠電泳，檢測(cè)RNA完整性。測(cè)定濃度后分裝備用。

1.3 RT-PCR檢測(cè)

1.3.1 RT-PCR引物設(shè)計(jì) 根據(jù)NCBI中收錄的OYDV病毒外殼蛋白基因序列[20]，以及通過(guò)全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得的病毒(GLV、GarVD和GarVX)序列[22]，利用Oligo 6.0 軟件設(shè)計(jì)引物。GLV病毒有6條相關(guān)序列(2760、21764/1564、2396、2186、2817、2810)，設(shè)計(jì)7對(duì)引物；GarVD有1條相關(guān)序列(3228)，GarVX有1條相關(guān)序列(3916)，各設(shè)計(jì)3對(duì)引物。以上序列提交至GenBank，序列號(hào)為：OM304365～OM304372，序列引物信息詳見(jiàn)表1。

表1 本研究所用引物信息

1.3.2 單一RT-PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)程序 單一RT-PCR反應(yīng)體系：cDNA 2 μL，上下游引物各1 μL，EX-taq酶(TaKaRa公司)12.5 μL，ddH2O 8.5 μL，共25 μL。反應(yīng)程序:95 ℃預(yù)變性 5 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物。

1.3.3 多重 RT-PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化 多重RT-PCR體系先篩選引物，退火溫度設(shè)置為54，55，57，59 ℃；cDNA模板體積設(shè)置為1.5，2.0，2.5，3.0 μL；先等量混合上下游8條引物，向PCR體系中分別加0.5，1.0 μL。根據(jù)以上參數(shù)優(yōu)化反應(yīng)條件。

1.3.4 多重RT-PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)程序 將最優(yōu)GLV引物、GarVD引物、GarVX引物及OYDV引物共4對(duì)多重RT-PCR引物，按體積比1∶1混合得到混合引物(表1)。多重RT-PCR反應(yīng)體系：模板體積2.5 μL(分別為樂(lè)都紫皮大蒜cDNA和12個(gè)不同品種大蒜資源的cDNA)，混合上下游引物各1 μL，EX-taq酶12.5 μL，ddH2O補(bǔ)充至25 μL。多重RT-PCR反應(yīng)程序與單一RT-PCR基本相同，唯一不同的是延伸環(huán)節(jié)為72 ℃延伸90 s。電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物。

單一RT-PCR和多重RT-PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物亞克隆至pMD20-T載體，挑選陽(yáng)性克隆測(cè)序后進(jìn)行序列分析。

1.3.5 多重RT-PCR的靈敏度測(cè)定 取1 μL樂(lè)都紫皮大蒜cDNA,按10倍稀釋度逐級(jí)稀釋成5個(gè)濃度梯度(10-1，10-2，10-3，10-4，10-5)，每個(gè)濃度取1 μL cDNA為模板分別進(jìn)行單一和多重RT-PCR擴(kuò)增，電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，測(cè)定反應(yīng)靈敏度。

2 結(jié)果與分析

2.1 樂(lè)都紫皮大蒜葉片總RNA的提取

提取的樂(lè)都紫皮大蒜葉片總RNA電泳后可見(jiàn)28S、18S、5.8S 3條清晰條帶。經(jīng)OD260/OD280檢測(cè)，樂(lè)都紫皮大蒜葉片RNA的質(zhì)量濃度為5 114.3 ng/μL，OD260/OD280為2.0，可用于后續(xù)試驗(yàn)。

2.2 樂(lè)都紫皮大蒜4種病毒的單一RT-PCR

以樂(lè)都紫皮大蒜cDNA為模板，用單一RT-PCR擴(kuò)增OYDV、GLV、GarVD和GarVX病毒。OYDV引物擴(kuò)增產(chǎn)生的目的條帶單一明亮，條帶大小為1 232 bp(圖1)，可作為后續(xù)多重PCR的引物。GLV病毒的電泳結(jié)果顯示，條帶均單一、明亮、清晰，條帶大小為750～1 000 bp(圖2)。從GLV的6條電泳結(jié)果中選取全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序號(hào)2186的引物進(jìn)行后期的多重PCR。用GarVD和GarVX引物進(jìn)行擴(kuò)增(每個(gè)3對(duì)，共6條)，GarVD的D-1為287 bp，D-2為506 bp，D-3為763 bp；GarVX的X-1為116 bp，X-2為503 bp，X-3為778 bp，條帶單一明亮，均可作為后續(xù)多重PCR的備選引物(圖3)。

M.DNA Marker；1～2.OYDV病毒單一RT-PCR

M.DNA Marker；1.GLV 2760；2.GLV 21764/1564；3.GLV 2396；4.GLV 2186；5.GLV 2817；6.GLV 2810；7.GarVD 3228；8.GarVX 3916

M.DNA Marker；D-2.GarVD-SMPCR-3228引物單一RT-PCR；D-1.GarVD-SPCR-3228-1引物單一RT-PCR；X-1.GarVX-SMPCR-3916引物單一RT-PCR；X-2.GarVX-SPCR-3916-1引物單一RT-PCR；D-3.GarVD-SPCR-3228-2引物單一RT-PCR；X-3.GarVX-SPCR-3916-2引物單一RT-PCR

2.3 樂(lè)都紫皮大蒜4種病毒的多重RT-PCR

用單一RT-PCR驗(yàn)證后，選取GLV病毒的GLV-SMPCR-2186引物，同時(shí)加入GarVD病毒的GarVD-SMPCR-3228引物、GarVX病毒的GarVX-SMPCR-3916引物和OYDV病毒的OYDV-SMPCR 引物進(jìn)行4種病毒的多重PT-PCR，模板為樂(lè)都紫皮大蒜cDNA。條件優(yōu)化結(jié)果顯示：在同一體系下改變模板濃度與PCR的退火溫度進(jìn)行體系優(yōu)化，在54～59 ℃中，55 ℃下條帶最明顯，故選定55 ℃為多重RT-PCR反應(yīng)的退火溫度(圖4)；cDNA模板使用量為1.5～3.0 μL進(jìn)行優(yōu)化時(shí)，差異不明顯，經(jīng)多次對(duì)比，選定2.5 μL為最優(yōu)濃度(圖5)；引物濃度從0.5 μL至1.0 μL間最優(yōu)的為1.0 μL(圖6)。因此，最終確定多重RT-PCR的最佳反應(yīng)條件為：退火溫度55 ℃，模板用量2.5 μL，引物用量各1.0 μL。

M.DNA Marker

M.DNA Marker

M.DNA Marker

在此條件下，在一個(gè)反應(yīng)體系中穩(wěn)定擴(kuò)增獲得了條帶大小分別為1 232 bp(OYDV)，831 bp(GLV)，506 bp(GarVD)和116 bp(GarVX)的PCR產(chǎn)物，成功構(gòu)建了樂(lè)都紫皮大蒜4種病毒的多重RT-PCR體系(圖7)。

2.4 樂(lè)都紫皮大蒜4種病毒多重RT-PCR的靈敏度檢測(cè)

對(duì)梯度稀釋的樂(lè)都紫皮大蒜樣品cDNA進(jìn)行單一和多重RT-PCR的靈敏度檢測(cè)。結(jié)果(圖8)顯示，單一PCR反應(yīng)中，OYDV的檢測(cè)限為10-2稀釋梯度，GLV的檢測(cè)限為10-4稀釋梯度，GarVD的檢測(cè)限為10-3稀釋梯度，GarVX的檢測(cè)限為10-1稀釋梯度。多重RT-PCR反應(yīng)中，OYDV、GLV、GarVD和GarVX的檢測(cè)限分別為10-2，10-3，10-2，10-1稀釋梯度，可見(jiàn)多重RT-PCR檢測(cè)的靈敏度略低于單一RT-PCR。

M.DNA Marker;A、B、C、D分別是OYDV、GLV、GarVD和GarVX的單一PCR擴(kuò)增；E是4種病毒的多重PCR擴(kuò)增

2.5 12份大蒜種質(zhì)資源的多重RT-PCR檢測(cè)

為驗(yàn)證本試驗(yàn)所構(gòu)建多重PCR檢測(cè)方法的有效性，本研究選取從省外引進(jìn)的12種大蒜資源進(jìn)行了病毒多重PCR檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖9和圖10。

M.DNA Marker;HN.海南；NMG.內(nèi)蒙古；XJ.新疆；LN.遼寧；AH.安徽；YN.云南；CQ.重慶；GZ.貴州；TJ.天津；SC.四川；SD.山東；ZY.張掖

M.DNA Marker;HN-O.海南OYDV病毒；HN-L.海南GLV病毒；CQ-D.重慶GarVD病毒；CQ-O.重慶OYDV病毒；CQ-L.重慶GLV病毒；SC-X.四川GarVX病毒；SC-L.四川GLV病毒；SC-O.四川OYDV病毒；NMG-L.內(nèi)蒙古GLV病毒；NMG-X.內(nèi)蒙古GarVX病毒；NMG-O.內(nèi)蒙古OYDV病毒；GZ-L.貴州GLV病毒；GZ-X.貴州GarVX病毒；LN-L.遼寧GLV病毒；LN-O.遼寧OYDV病毒；LN-X.遼寧GarVX病毒;YN-L.云南GLV病毒；YN-O.云南OYDV病毒；YN-X.云南GarVX病毒

圖9顯示，XJ、AH、TJ、SD、ZY引種大蒜出現(xiàn)4條明顯條帶，表示以上5種資源同時(shí)存在OYDV、GLV、GarVD和GarVX 4種病毒侵染；HN、LN和YN大蒜出現(xiàn)2條明顯條帶，均是GarVX和GarVD病毒；GZ大蒜出現(xiàn)2條明顯條帶，分別是OYDV和GarVD病毒；NMG、CQ、SC大蒜僅出現(xiàn)1條明顯條帶，表示這3種引種大蒜只存在1種病毒侵染，其中NMG資源被OYDV病毒侵染，CQ資源被GarVX病毒侵染，SC資源被GarVD病毒侵染。

對(duì)于沒(méi)有同時(shí)出現(xiàn)4種病毒的7種資源，再針對(duì)未出現(xiàn)條帶的病毒進(jìn)一步做單一RT-PCR檢測(cè)。結(jié)果表明，除多重PCR結(jié)果外，顯示NMG資源也可能存在GarVX病毒；其他資源中，在多重PCR中未檢出的病毒在單一PCR中均未檢測(cè)出來(lái)(圖10)。對(duì)LN和YN 2種資源中是否存在GarVX病毒也進(jìn)行了驗(yàn)證，確認(rèn)這2種資源存在該病毒，證實(shí)了多重PCR的有效性和準(zhǔn)確性。

3 討 論

以鱗莖作為繁殖體的無(wú)性繁殖方式易導(dǎo)致種性退化，且退化問(wèn)題的產(chǎn)生與病毒的代際傳播密切相關(guān)，隨著繁殖代數(shù)增加，病毒在鱗莖中不斷累積，進(jìn)而導(dǎo)致病害蔓延和種性弱化[23]。病毒引發(fā)的種性退化問(wèn)題不僅對(duì)大蒜有影響，也對(duì)馬鈴薯[24]、百合[25]、山藥[26]、紅薯[27]等地下莖作物有重要影響。加之生產(chǎn)中存在“賣大留小”的不良留種習(xí)慣，使得種性好、抗性強(qiáng)的“種子”進(jìn)入消費(fèi)流通，而賣相差、病毒多的鱗莖被用于生產(chǎn)種植[28]。因此，大蒜種性退化是無(wú)性繁殖方式導(dǎo)致病毒積累和不良留種習(xí)慣綜合作用的結(jié)果。

病毒對(duì)大蒜的危害嚴(yán)重，病毒感染可導(dǎo)致大蒜產(chǎn)量損失高達(dá)20%，嚴(yán)重時(shí)超過(guò)50%。蔥屬植物受病毒侵染的情況非常普遍，病毒侵染后引起大蒜產(chǎn)量和品質(zhì)下降的問(wèn)題是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的一個(gè)重要難題。大蒜為無(wú)性繁殖，常常由于鱗莖母體受到病毒感染，并能垂直傳遞到子代，因此一旦大蒜受到病毒感染便難以脫毒，最終導(dǎo)致毀種[29]。大蒜病毒因其多樣性，故在不同地區(qū)侵染的程度也是不一致的，大蒜病毒侵染的復(fù)雜性及多樣性在不同地區(qū)存在差異，侵染的病毒種類隨地區(qū)和品種變化也表現(xiàn)出差異性。侵染甘肅大蒜的病毒主要為GLV和OYDV[20]；侵染湖南大蒜的病毒主要為Allexiviruses、OYDV、LYSV、SLV 4種[30]；侵染河南大蒜的病毒主要為L(zhǎng)YSV[31]。從種類上看，GLV和OYDV是危害我國(guó)大蒜的主要病毒[32-35]，而GarVX和GarVD的出現(xiàn)頻次相對(duì)較低。本研究通過(guò)對(duì)樂(lè)都紫皮大蒜全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序中篩選得到的病毒序列進(jìn)行分析，確認(rèn)了侵染樂(lè)都紫皮大蒜的X病毒和D病毒。這2種病毒通常以復(fù)合形式侵染植株，具有較高的相似性和相同的寄主范圍，常規(guī)方法難以區(qū)分[36-38]，用多重RT-PCR方法有效解決了這一難題。本研究還發(fā)現(xiàn)，包括樂(lè)都紫皮大蒜在內(nèi)的共13種大蒜資源中，GarVD侵染的頻率最高，為85%；其次為OYDV和GarVX，頻率為69%；GLV侵染頻率最低，為46%；說(shuō)明青蔥X病毒屬和OYDV對(duì)樂(lè)都紫皮大蒜的影響比GLV的侵染性更為廣泛。

馴化栽培過(guò)程中，連作所造成的病毒累積影響了大蒜品質(zhì)和產(chǎn)量，因此大蒜病毒的檢測(cè)尤為重要。多重 RT-PCR能夠在同一體系中同時(shí)特異性擴(kuò)增多個(gè)片段，但加入體系的多對(duì)引物之間也會(huì)產(chǎn)生配對(duì)、競(jìng)爭(zhēng)性擴(kuò)增等問(wèn)題[39]，因此引物是影響多重RT-PCR檢測(cè)體系建立最為重要的因素[40-45]。體系構(gòu)建時(shí)，要充分考慮引物間的不同退火溫度和引物間的作用，防止非特異性擴(kuò)增和引物二聚體的出現(xiàn)。相較于單一RT-PCR，多重RT-PCR不管是在時(shí)間還是在準(zhǔn)確性方面，都是最為有效、成本更低的技術(shù)選項(xiàng)[46]。目前常見(jiàn)的多重RT-PCR可同時(shí)檢測(cè)2種或3種病毒[47-51]。本研究采用單一RT-PCR及多重RT-PCR對(duì)GLV、GarVX、GarVD和OYDV 4種病毒進(jìn)行檢測(cè)和驗(yàn)證，可進(jìn)一步提高檢測(cè)效能。

本研究根據(jù)樂(lè)都紫皮大蒜RNA全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果，得到病毒外殼蛋白序列并設(shè)計(jì)篩選了引物進(jìn)行多重RT-PCR體系開(kāi)發(fā)，通過(guò)靈敏度試驗(yàn)，確定了每種病毒的檢測(cè)限。本試驗(yàn)建立的4種病毒多重RT-PCR體系，可準(zhǔn)確、穩(wěn)定、有效地進(jìn)行病毒的單一和復(fù)合侵染檢測(cè)，為大蒜病原鑒定、發(fā)病率統(tǒng)計(jì)、脫毒效果驗(yàn)證和檢測(cè)提供技術(shù)支持。