FSHR剪切變異c.299+2T>G致卵巢抵抗綜合征的家系分析

閆慧，黃蕾，馬小紅，哈靈俠，趙君利，張倩，閆有圣，劉春蓮*

(1.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，銀川 750004；2.生育力保持教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，銀川 750004；3.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院產(chǎn)前診斷中心，北京 100026)

卵巢抵抗綜合征(resistant ovary syndrome，ROS)又稱卵巢不敏感綜合征(insensitive ovary syndrome，IOS)，即在40歲前患有高促性腺激素低雌激素性閉經(jīng)，卵巢體積正常，有大量的始基卵泡及初級(jí)卵泡，抗苗勒管激素(AMH)值正?；蚱?，對(duì)促性腺激素不反應(yīng)，臨床癥狀可表現(xiàn)為原發(fā)或繼發(fā)閉經(jīng)。該疾病需要與卵巢功能減退(premature ovarian insufficiency，POI)相鑒別。ROS病因不明，可能與促性腺激素受體如卵泡刺激素受體(FSHR)缺陷有關(guān)，目前已報(bào)道多種致病性FSHR變異，一些變異可能導(dǎo)致ROS[1-3]。本研究對(duì)寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心收治的1例確診為ROS的年輕原發(fā)性閉經(jīng)患者的臨床特征及遺傳學(xué)資料進(jìn)行回顧性分析，并對(duì)相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行整理和復(fù)習(xí)，以期為今后的臨床實(shí)踐提供參考。

資料與方法

一、研究對(duì)象

先證者來(lái)自寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，在知情同意的前提下采集了患者及父母、兄長(zhǎng)的外周靜脈血各5 ml，并獲取了先證者的臨床資料。該研究經(jīng)寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(編號(hào)2019-030)。

二、研究方法

1.外周血基因組DNA提?。翰捎弥忪o脈血約5 ml，EDTA-2Na抗凝，用DNA提取試劑盒(TIANamp Blood DNA Kit，#DP348-03，北京天根生化科技)按照使用說(shuō)明提取基因組DNA，測(cè)定DNA的濃度和純度，至少約有1.5 μg的基因組DNA用于建庫(kù)。

2.全外顯子組測(cè)序：使用上海翊圣生物DNA轉(zhuǎn)座酶法建庫(kù)試劑盒(Hieff NGSOnePot DNA Library Prep Kit for Illumina)進(jìn)行DNA片段化、末端修復(fù)和接頭連接過程。用xGen Exome Research Panel v1.0試劑盒(Integrated DNA Technologies公司，美國(guó))進(jìn)行全外顯子組文庫(kù)捕獲文庫(kù)構(gòu)建。使用PE150模式在Illumina HiSeq 2500(San Diego，加拿大)測(cè)序平臺(tái)上進(jìn)行雙端測(cè)序。

3.測(cè)序數(shù)據(jù)分析：測(cè)序數(shù)據(jù)經(jīng)過過濾與評(píng)估，過濾掉低質(zhì)量reads(Q30<85% reads)數(shù)據(jù)。通過Burrows-Wheeler Aligner(BWA)軟件將數(shù)據(jù)與人類參考基因組(UCSC hg19，https：//genome.ucsc.edu/)對(duì)比。使用Genome Analysis Toolkit(GATK)v3.70對(duì)測(cè)序結(jié)果與參考基因組進(jìn)行比對(duì)，找出樣品中存在的變異信息，包括SNV、InDel等。使用dbSNP、1000Genome、Clinvar等數(shù)據(jù)庫(kù)以及SIFT、Polyphen-2、GERP等軟件對(duì)其進(jìn)行注釋及功能預(yù)測(cè)。

4.家系成員變異位點(diǎn)的Sanger測(cè)序驗(yàn)證：根據(jù)目標(biāo)致病基因突變位點(diǎn)，從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取FSHR的基因組DNA序列，用軟件Primer5設(shè)計(jì)可特異性擴(kuò)增該基因c.299+2T>G突變位點(diǎn)的外顯子上下游引物。上游引物：5’-GCAGGCAACAGGATGAGACT-3’，下游引物：5’-GAGCCACAGCCTTCGACTTA-3’。使用TC-XP-G PCR儀(杭州BIOER)對(duì)DNA樣本(包含目標(biāo)基因變異位點(diǎn)的序列)進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增后電泳條帶清晰、特異，采用Life 3500 Dx測(cè)序儀(ABI，美國(guó))進(jìn)行Sanger測(cè)序。將所測(cè)出的FSHR序列與Nucleotide數(shù)據(jù)庫(kù)(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Nucleotide)中的FSHR序列進(jìn)行對(duì)比分析以發(fā)現(xiàn)FSHR基因變異。利用Mutation Surveyor軟件進(jìn)行分析，并結(jié)合文獻(xiàn)及1000Genome、ExAC、ESP、HGMD、ClinVar等多種數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行基因變異致病性的判斷。

5.變異位點(diǎn)的致病性分析：參照美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)和基因組學(xué)學(xué)會(huì)(American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG)相關(guān)指南進(jìn)行變異致病性分析。

結(jié) 果

一、臨床資料

1.基本情況：患者，女(先證者V2)，24歲，因“未避孕未孕5年”于2022年1月就診于寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，患者月經(jīng)初潮16歲，需藥物行經(jīng)，就診時(shí)臨床診斷原發(fā)性閉經(jīng)，無(wú)結(jié)核病及外傷史，無(wú)盆腔手術(shù)史；經(jīng)尿促性素粉針劑促排3個(gè)周期無(wú)優(yōu)勢(shì)卵泡發(fā)育。經(jīng)臨床資料與輔助檢查診斷為ROS。母親有正常月經(jīng)史，絕經(jīng)年齡為48歲；無(wú)特殊家族史。先證者母親的祖母與父親的祖父為親兄妹，家系圖譜詳見圖1。

圖1 病例家系圖譜

2.體格檢查：患者身高171 cm，體重55 kg，外觀發(fā)育未見異常，無(wú)腋毛，乳房發(fā)育不良，陰毛和外生殖器發(fā)育正常。

3.輔助檢查：B超顯示單側(cè)多囊卵巢改變，直徑2～3 mm卵泡數(shù)大于12個(gè)，子宮略小，ABO血型O型，RH(+)，染色體核型正常為46，XX；既往甲狀腺激素水平正常，肝腎功能未見明顯異常，激素水平詳見表1。

表1 患者血清激素水平及參考值

二、全外顯子組測(cè)序及變異位點(diǎn)分析結(jié)果

原始數(shù)據(jù)經(jīng)過全外顯子組測(cè)序，發(fā)現(xiàn)先證者存在FSHR經(jīng)典剪切變異NM_000145.4 c.299+2T>G并為純合型(圖2)，該變異在dbSNP和HGMD均未收錄，是尚未報(bào)道的新變異。根據(jù)ACMG解讀指南，該位點(diǎn)為致病性變異。

三、Sanger測(cè)序驗(yàn)證

Sanger測(cè)序結(jié)果表明，先證者存在FSHR剪切變異c.299+2T>G，且兄長(zhǎng)與先證者一致，父母(Ⅳ1、2)存在FSHR剪切變異c.299+2T>G并為雜合型(圖2)。Ⅳ1、2為四代近親結(jié)婚，根據(jù)家系圖譜及檢測(cè)結(jié)果，推測(cè)該新發(fā)位點(diǎn)可能源于I1或者I2。

討 論

卵泡刺激素(FSH)是由腺垂體分泌的糖蛋白，與FSHR相互作用參與調(diào)控卵泡發(fā)育和卵巢功能。FSHR長(zhǎng)約190 kb，位于染色體2p21-p16[4]，是膜受體的G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)超家族成員，其編碼區(qū)由10個(gè)69～1 234 bp的外顯子和9個(gè)108 bp～15 kb的內(nèi)含子組成，人類FSHR蛋白由695個(gè)氨基酸殘基組成。FSHR具有廣泛的胞外結(jié)構(gòu)域，與FSH結(jié)合，連接信號(hào)特異性亞域或鉸鏈區(qū)，而7個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域參與受體的激活，并將激活過程傳遞到由氨基酸序列組成的細(xì)胞內(nèi)環(huán)[5]。FSHR具有組織特異性，在女性顆粒細(xì)胞和男性支持細(xì)胞中高表達(dá)。

圖2 FSHR基因c.299+2T>G位點(diǎn)測(cè)序峰圖(圖中紅色框?yàn)樽儺愇稽c(diǎn)堿基)

一、FSHR新發(fā)現(xiàn)剪切變異c.299+2T>G是導(dǎo)致ROS的關(guān)鍵因素

ROS病因尚不明確，可能是由于FSHR結(jié)構(gòu)異常，導(dǎo)致下游信號(hào)通路受阻，雌激素合成障礙，從而影響卵泡發(fā)育，而FSHR的轉(zhuǎn)錄和翻譯受FSHR基因調(diào)控，故FSHR基因變異可能導(dǎo)致卵泡發(fā)育異常造成ROS[1]。目前Clinavar網(wǎng)站(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar)統(tǒng)計(jì)的FSHR突變位點(diǎn)共計(jì)165個(gè)，其中致病性26個(gè)，可能致病14個(gè)，良性32個(gè)，可能良性24個(gè)，其他69個(gè)，各種類型包含的位點(diǎn)詳見表2。Khor等[2]報(bào)道FSHR致病性變異c.182T>A(p.Ile61Asn)和c.2062C>A(p.Pro688Thr)可引起ROS。本文發(fā)現(xiàn)的FSHR新剪切變異c.299+2T>G為經(jīng)典剪切變異，可能導(dǎo)致>10%長(zhǎng)度的蛋白改變[6]，從而導(dǎo)致基因功能缺失。FSHR在維持正常生殖功能中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。有文獻(xiàn)報(bào)道，F(xiàn)SHR突變影響患有子宮內(nèi)膜異位癥的不孕癥患者的激素表達(dá)及輔助生殖技術(shù)助孕結(jié)局[7]。FSHRrs6166(N680S)位點(diǎn)攜帶者的激素敏感性更高，可用于預(yù)測(cè)輔助生殖技術(shù)中卵巢過度刺激綜合征(OHSS)的發(fā)生[8]及活產(chǎn)抱嬰率的情況[9]。一項(xiàng)納入16項(xiàng)研究的Meta分析發(fā)現(xiàn)FSHRrs6166多態(tài)性可能是亞洲人群POI的一種潛在的遺傳生物標(biāo)志物[10]。亦有研究發(fā)現(xiàn)FSHR多態(tài)性可改變卵巢對(duì)外源性FSH的反應(yīng)，增加多囊卵巢綜合征(PCOS)的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，且影響其臨床特征和治療結(jié)果[11-12]。Dierich等[13]發(fā)現(xiàn)FSHR缺乏可能導(dǎo)致卵巢發(fā)育不全及某些男性特異性不孕。目前已報(bào)道的中國(guó)人群FSHR的致病性變異較少，李汶等[3]報(bào)道了FSHRc.419delA(p.Lys140Argfs*16)純合突變和c.1510C>T(p.Pro504Ser)純合突變可導(dǎo)致ROS的發(fā)生。

表2 FSHR突變位點(diǎn)臨床意義

續(xù)表

二、家系臨床資料分析

不同突變位點(diǎn)會(huì)導(dǎo)致相應(yīng)的臨床表現(xiàn)及癥狀[14]，我們分析了患者的臨床數(shù)據(jù)及資料。陰式B超下顯示患者的單側(cè)卵巢呈現(xiàn)多囊卵巢樣改變，表明含有初級(jí)或次級(jí)卵母細(xì)胞期停止發(fā)育的卵泡，由于細(xì)胞膜上FSHR分子數(shù)量減少，卵泡發(fā)育成熟后期缺少FSH的作用，導(dǎo)致卵母細(xì)胞成熟障礙。本研究中先證者哥哥與其具有同樣的基因型，但遺憾的是，其哥哥因個(gè)人原因拒絕提供臨床資料及進(jìn)行進(jìn)一步檢查。先證者的AMH水平偏高為4.67 ng/ml，說(shuō)明FSHR對(duì)于AMH的產(chǎn)生或竇前卵泡的發(fā)育不是必需的。Anagnostou等[15]研究發(fā)現(xiàn)攜帶Ser(Ser680Asn)等位基因的女性卵泡數(shù)量及卵母細(xì)胞較多，Asn/Asn女性血清和卵泡液中的AMH水平低，但無(wú)顯著性差異(P>0.05)。與其他FSHR突變導(dǎo)致FSH活性降低的患者類似，本病例可能初級(jí)或次級(jí)濾泡膜上的正常FSHR顯著降低，但可能在青春期合成了足夠的雌激素來(lái)刺激部分乳房發(fā)育。而因卵泡缺失而導(dǎo)致卵巢早衰的女性AMH值很低甚至檢測(cè)不到，這也成為與POI鑒別的關(guān)鍵要點(diǎn)[16]。抑制素B(Inhibin B)屬于轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)超家族，血清中高水平的抑制素B直接對(duì)垂體產(chǎn)生負(fù)反饋，導(dǎo)致FSH下降，因此其可作為預(yù)測(cè)卵巢反應(yīng)的更為直接的標(biāo)記物，是FSH分泌的負(fù)調(diào)控因子。先證者抑制素B水平正常(57.00 pg/ml)，符合患者卵巢內(nèi)大量初級(jí)或次級(jí)卵母細(xì)胞存在的體征[17]。

三、ROS患者臨床助孕管理策略

對(duì)于ROS患者的治療策略，常規(guī)可給予雌孕激素替代治療維持月經(jīng)周期；不孕癥的處理常給予使用贈(zèng)卵的建議。隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，F(xiàn)SHR的遺傳變異也是不斷發(fā)展的藥物遺傳學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，可作為有價(jià)值的個(gè)體化治療方案的工具。有研究根據(jù)ROS患者的FSHR突變基因類型、位點(diǎn)突變的功能性以及閉經(jīng)的類型，分析基因型與表型的關(guān)系，可用于推算攜帶不同F(xiàn)SHR突變位點(diǎn)的患者是否適合進(jìn)行未成熟卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)(IVM)技術(shù)。Galv?o等[18]對(duì)9例ROS患者進(jìn)行了24個(gè)IVM周期，平均獲卵數(shù)為(11.5±10.4)個(gè)，IVM培養(yǎng)后有(3.4±3.1)個(gè)卵母細(xì)胞成熟，活產(chǎn)5例(16.7%)，因此認(rèn)為IVM是ROS患者極具價(jià)值的助孕方式。Li等[19]報(bào)道了1例攜帶了4個(gè)良性變異位點(diǎn)c.-29G>A，c.299+33C>T，c.919G>A(p.Ala307Thr)和c.2039G>A(p.Ser680Asn)的ROS患者，通過IVM技術(shù)分娩了健康的嬰兒。Benammar等[20]對(duì)1名攜帶FSHRArg283Trp及Pro600Thr雜合突變的患者，經(jīng)過3次失敗的常規(guī)IVF助孕后，行IVM培養(yǎng)，盡管只有不到50%(7/16)的卵母細(xì)胞發(fā)育成熟，但所有成熟卵母細(xì)胞均已受精，1枚胚胎成功獲得活產(chǎn)。結(jié)合其他成功的個(gè)案報(bào)道[21-22]，我們掌握了更多關(guān)于FSHR基因型-表現(xiàn)型的相關(guān)性，為改善家庭遺傳咨詢提供了更多指導(dǎo)意見，并提高其生活質(zhì)量，如激素替代治療促進(jìn)乳房發(fā)育，或行卵母細(xì)胞冷凍保存為未來(lái)妊娠做準(zhǔn)備。

鑒于不同的FSHR突變位點(diǎn)導(dǎo)致其相應(yīng)的氨基酸改變，我們后續(xù)將進(jìn)一步開展FSHR新發(fā)現(xiàn)剪切變異c.299+2T>G的功能學(xué)基礎(chǔ)研究，探尋效應(yīng)子的耦合、與適配蛋白的相互作用以及下游細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路機(jī)制，以期豐富FSHR的作用機(jī)理，為臨床治療提供參考。