整合素β2和Kindlin-2在結(jié)直腸癌組織中的表達及其臨床意義

劉蘇雅 蔣文婷 任瑩 高超

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是一種常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，其發(fā)病率和致死率均較高。因此，早期診治對提高CRC患者的生存率至關(guān)重要。近來研究發(fā)現(xiàn)，整合素參與了腫瘤細胞的生長、浸潤及轉(zhuǎn)移[1]。整合素β2（integrin beta2 ，ITGB2）是整合素的一個亞組，它們具有共同的β2或CD18-chain，但有不同的α鏈和配體[2]。多項研究證實，ITGB2的異常升高在乳腺癌、骨肉瘤、胰腺癌的浸潤與轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用[3-5]。Kindlin家族是新近發(fā)現(xiàn)的一種黏著斑蛋白家族，它的3個成員Kindlin-1、Kindlin-2、Kindlin-3均包含4個FERM域（F0、F1、F2、F3），Kindlin-2和Kindlin-3的F3子域已被證明可與ITGB2和整合素β3尾部結(jié)合。Kindlin-2在造血系統(tǒng)外普遍表達，Kindlin-1主要在上皮細胞中表達，而Kindlin-3僅限于造血系統(tǒng)[6]。研究表明，Kindlin-1和Kindlin-3的功能喪失或突變導(dǎo)致與細胞黏附改變相關(guān)的疾病，而Kindlin-2的突變或變化水平與癌癥有關(guān)[7]。Kindlin-2通過結(jié)合整合素β亞基胞內(nèi)尾段，作用于一系列信號通路和轉(zhuǎn)導(dǎo)因子，參與整合素活化，誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生[8]。迄今為止，關(guān)于CRC中Kindlin-2調(diào)節(jié)ITGB2作用的報道很少。為此，本研究采用免疫組化法檢測CRC組織中ITGB2和Kindlin-2的表達情況，并分析它們的表達與臨床病理特征的關(guān)系，以期為CRC的診治提供參考。

1 對象和方法

1.1 對象 收集2021年6月至2022年2月徐州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院60例CRC患者手術(shù)切除的腫瘤組織標本及對應(yīng)的癌旁（距腫瘤邊緣≥5 cm）正常組織標本。所有患者術(shù)后病理診斷均為CRC，且均為初次就診，臨床資料齊全，術(shù)前均未接受放化療、免疫治療等，且不伴有其他惡性腫瘤。其中男35例，女25例；年齡46～87（67.33±9.97）歲；分化程度：高分化24例，中低分化36例；浸潤深度：T1+T218例，T3+T442例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移25例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移35例；按照美國癌癥聯(lián)合委員會TNM分期標準：TNMⅠ+Ⅱ期35例，TNMⅢ+Ⅳ期25例。本研究經(jīng)徐州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審批通過（批準文號：XYFY2022-KL261-01），所有患者均知情同意。

1.2 主要試劑 ITGB2抗體（批號：00069274）購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；Kindlin-2抗體（批號：AI08141128）購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；組織脫水機（型號：Donatello）購自意大利DIAPATH公司；微波爐（型號：P70D20TL-P4）購自中國格蘭仕微波爐電器有限公司；脫色搖床（型號：TSY-B）購自中國武漢Servicebio公司；顯微鏡（型號：E100）、成像系統(tǒng)（型號：Nikon DS-U3）均購自日本尼康公司。

1.3 CRC組織和癌旁正常組織中ITGB2和Kindlin-2表達檢測 采用免疫組化法。制作4 mm厚的石蠟切片，常規(guī)脫蠟至水；置于盛滿檸檬酸抗原修復(fù)緩沖液（pH 6.0）的修復(fù)盒中于微波爐內(nèi)進行抗原修復(fù)；3%雙氧水溶液阻斷內(nèi)源性過氧化物酶；血清封閉；不同玻片上分別滴加ITGB2抗體和Kindlin-2抗體，4℃孵育過夜；洗滌后加二抗（HRP標記山羊抗兔抗體）、DAB顯色、蘇木素復(fù)染細胞核、脫水后封片膠封片。

1.4 結(jié)果判斷標準 ITGB2陽性表達定位于細胞間質(zhì)中，Kindlin-2陽性表達定位于細胞質(zhì)，陽性表現(xiàn)為淡黃色至棕褐色顆粒。在光學顯微鏡下，每個標本隨機抽取10個高倍視野（400×），根據(jù)免疫反應(yīng)積分計分體系進行評分，即通過染色強度和染色范圍來判定其結(jié)果。按染色強度評分：未見陽性染色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。按染色范圍評分：0%～5%為0分，＞5%～25%為1分，＞25%～50%為2分，＞50%為3分；染色強度得分×染色范圍得分為總得分，總得分≤1分記為陰性，≥2分記為陽性。

1.5 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 26.0統(tǒng)計軟件。計數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗；ITGB2與Kindlin-2蛋白表達的相關(guān)性分析采用Spearman等級相關(guān)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 CRC組織和癌旁正常組織中ITGB2和Kindlin-2表達的比較 ITGB2陽性表達主要位于細胞間質(zhì)中，Kindlin-2陽性表達主要位于細胞質(zhì)，見圖1。CRC組織中ITGB2陽性表達率為65.0%（39/60），高于癌旁正常組織的43.3%（26/60），差異有統(tǒng)計學意義（χ2=5.673，P＜0.05）。CRC組織中Kindlin-2陽性表達率為61.7%（37/60），高于癌旁正常組織的33.3%（20/60），差異有統(tǒng)計學意義（χ2=9.657，P＜0.01）。

圖1 CRC組織和癌旁正常組織中ITGB2和Kindlin-2的表達（A：ITGB2在CRC組織中陽性表達；B：ITGB2在癌旁正常組織中陰性表達；C：Kindlin-2在CRC組織中陽性表達；D：Kindlin-2在癌旁正常組織中陰性表達）

2.2 CRC組織中ITGB2和Kindlin-2陽性表達與臨床病理特征的關(guān)系 分化程度差、浸潤深度深、TNM分期晚、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的CRC組織中ITGB2和Kindlin-2陽性表達率分別高于分化程度好、浸潤深度淺、TNM分期早、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的CRC組織，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），而不同的性別、年齡、腫瘤直徑CRC組織中ITGB2、Kindlin-2陽性表達率比較差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05），見表1。

表1 CRC組織中ITGB2和Kindlin-2的表達與臨床病理特征的關(guān)系（例）

2.3 CRC組織中ITGB2和Kindlin-2表達的相關(guān)性分析 Spearman等級相關(guān)分析顯示，CRC組織中ITGB2和Kindlin-2蛋白表達呈正相關(guān)（rs=0.356，P＜0.05），見表2。

表2 CRC組織中ITGB2和Kindlin-2蛋白表達的相關(guān)性分析（例）

3 討論

CRC是世界上第3大常見的惡性腫瘤[9]，在中國惡性腫瘤的死亡率排名中位居第5[10]。隨著診療技術(shù)的不斷發(fā)展和新生物療法的出現(xiàn)，CRC的發(fā)病率和死亡率有所下降，但整體卻仍不容樂觀。研究表明，早期CRC的5年生存率可達到90.0%，但絕大部分患者在確診時已是中晚期[9，11]。因此，深入研究CRC的發(fā)病機制、篩選和發(fā)掘新的生物標志物，有助于提高CRC確診率，延長患者生命，改善患者生命質(zhì)量。

整合素是黏附分子五大家庭成員之一，它能與細胞外基質(zhì)配體、細胞表面配體以及可溶性配體結(jié)合，進而改變整合素的表達、參與惡性腫瘤生物學行為[1]。ITGB2（包括 CD11a/CD18；CD11b/CD18；CD11c/CD18；and CD11d/CD18）最早是在白細胞黏附缺陷綜合征的研究中被發(fā)現(xiàn)，隨著研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)其在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起重要作用[12]。劉夢瑤等[13]通過構(gòu)建ITGB2過表達質(zhì)粒發(fā)現(xiàn)，相比于陰性對照組，過表達ITGB2后，人乳腺癌細胞的遷移、侵襲與黏附能力增高，這可能是由于ITGB2過表達導(dǎo)致局部黏著斑激酶（FAK）的磷酸化，影響其他細胞骨架蛋白（樁蛋白、張力蛋白），從而增加了細胞侵襲能力，使得乳腺癌細胞更易轉(zhuǎn)移。Dai等[4]發(fā)現(xiàn)，長鏈非編碼RNA ITGB2-AS1的下調(diào)抑制了Wnt/β-連環(huán)蛋白信號傳導(dǎo)，降低了細胞周期蛋白D1（cyclin D1）、C-myc基因等的表達水平，從而抑制骨肉瘤的增殖和轉(zhuǎn)移。Benedicto等[14]通過小鼠CRC細胞實驗發(fā)現(xiàn)，腫瘤細胞上ITGB2表達的減少與小鼠CRC細胞的增殖減慢和遷移減少有關(guān)。而人們對ITGB2在人類CRC中的確切作用知之甚少。為此，本研究利用免疫組化法對CRC及其癌旁正常組織ITGB2的表達進行了研究，結(jié)果表明，相較于癌旁正常組織，ITGB2在CRC組織中陽性表達率更高。同時，分化程度差、浸潤深度深、TNM分期晚、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的CRC組織中ITGB2陽性表達率分別高于分化程度好、浸潤深度淺、TNM分期早、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的CRC組織，差異均有統(tǒng)計學意義，提示ITGB2陽性表達可能對預(yù)測CRC的浸潤轉(zhuǎn)移起一定的作用。Kindlin-2作為整合素的激活劑參與腫瘤的發(fā)生，臨床上與皮膚病發(fā)生、腫瘤侵襲、免疫系統(tǒng)功能關(guān)系密切[7]。踝蛋白（Talin）是最廣為人知的ITGB2活化劑，然而，Montanez等[15]研究結(jié)果表明，Kindlin-2缺陷細胞無法激活整合素，而Kindlin-2是Talin誘導(dǎo)整合素激活所必須的，此外，他們還證明了Kindlin-2是整合素雙向信號傳導(dǎo)必不可少的元素。Kindlin活化整合素的機制可能有兩個：（1）Kindlin家族利用F3結(jié)構(gòu)域的磷酸化酪氨酸結(jié)合（PTB）位點，和整合素β亞基的細胞內(nèi)段以及含酪氨酸的NxxY基序或NPxY基序結(jié)合，協(xié)同Talin活化整合素；（2）Kindlin也可以與Migfilin和整合素連接激酶結(jié)合，調(diào)整細胞骨架的肌動蛋白結(jié)構(gòu)，促進細胞基質(zhì)黏附[16]。除了Talin和Kindlin，整合素還與許多細胞質(zhì)蛋白相互作用，例如絲蛋白A、Dokl1和14-3-3蛋白[17]。近年研究表明，Kindlin-2在許多惡性腫瘤中的表達上調(diào)，并影響腫瘤細胞的侵襲、耐藥和轉(zhuǎn)移[18]。Gozgit等[19]研究發(fā)現(xiàn)，Kindlin-2 在高侵襲性人乳腺癌細胞TMX2-28中高度表達，而且其表達量是低侵襲性乳腺癌細胞株MCF-7的17倍。此外，用小干擾RNA抑制Kindlin-2的表達顯著降低了TMX2-28細胞的侵襲性，說明Kindlin-2可能在促進乳腺癌細胞侵襲方面發(fā)揮重要作用。但Shi等[20]得出了不同的結(jié)論，他們發(fā)現(xiàn)Kindlin-2在SK-LMS-1平滑肌肉瘤細胞系中大量表達，而在侵襲性更強的HT-1080纖維肉瘤細胞系中表達較低。因此，Kindlin-2的作用可能因癌癥類型而異。本研究發(fā)現(xiàn)，CRC組織中Kindlin-2陽性表達率高于癌旁正常組織，差異有統(tǒng)計學意義。結(jié)合臨床病理研究顯示，相較于TNM分期早、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的CRC組織，TNM分期晚、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的CRC組織Kindlin-2的陽性表達率更高，這與王啟船等[21]的研究結(jié)果一致。同時，本研究還發(fā)現(xiàn)，腫瘤浸潤深度深、分化程度差的CRC組織中Kindlin-2陽性表達率高于浸潤深度淺、分化程度好的CRC組織。這表明Kindlin-2的陽性表達與CRC的形成密切相關(guān)。

本研究還發(fā)現(xiàn)CRC組織中ITGB2和Kindlin-2表達呈正相關(guān)，并且ITGB2和Kindlin-2的表達與分化程度、浸潤深度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。通過以上研究結(jié)果，筆者推測Kindlin-2通過上調(diào)ITGB2的表達水平，從而促進CRC的發(fā)病與進展，但這個推論仍需通過細胞實驗加以證明。因此，未來筆者將通過增大樣本量和增加實驗研究深度，進一步探討Kindlin-2和ITGB2在CRC發(fā)生、發(fā)展中的作用。