潘歡 楊帆 戚維波 馬興杰
肺癌是我國最常見的惡性腫瘤,其發(fā)病率和死亡率均位居惡性腫瘤的第一位[1]。非小細(xì)胞肺癌(nonsmall cell lung cancer,NSCLC)是腫瘤最常見的組織學(xué)類型,約占肺癌的80%~85%[2]。其中,肺腺癌又是NSCLC中最常見的病理組織亞型。由于肺腺癌具有高侵襲性、高早期轉(zhuǎn)移率和高術(shù)后復(fù)發(fā)率等特點(diǎn),所以患者的總體預(yù)后仍然不容樂觀[3]。研究表明腫瘤的發(fā)生和發(fā)展是一個(gè)復(fù)雜的多步驟過程,包括抑癌基因失活、癌基因的激活、腫瘤細(xì)胞的增殖和凋亡失衡,最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的惡性增殖。即使在氧氣充足的條件下,腫瘤細(xì)胞仍然傾向于將糖酵解作為其主要的能量代謝方式,這種現(xiàn)象被稱為Warburg效應(yīng)[4]。深入研究有氧糖酵解過程中的分子調(diào)控機(jī)制有助于發(fā)現(xiàn)新的腫瘤治療靶點(diǎn)。本研究旨在探索泛素蛋白連接酶L3(ubiquitin conjugating enzyme E2 L3,UBE2L3)對(duì)肺腺癌細(xì)胞有氧糖酵解的影響,并初步研究UBE2L3調(diào)控有氧糖酵解的分子機(jī)制。
1.1 生物信息學(xué)分析 本研究生物信息學(xué)分析數(shù)據(jù)下載自腫瘤基因組圖譜(the Cancer Genome Atlas,TCGA)數(shù)據(jù)庫(https://www.cancer.gov/tcga)。504例肺腺癌組織和59例正常肺組織列入本研究,比較肺腺癌組織和正常肺組織中UBE2L3蛋白表達(dá)水平。根據(jù)UBE2L3在肺腺癌組織中的表達(dá)中位值將肺腺癌組織分為UBE2L3高表達(dá)組和低表達(dá)組,運(yùn)用R語言中的“survival”和“survminer”生存分析包分析UBE2L3 mRNA表達(dá)水平與肺腺癌患者總生存期的關(guān)系。根據(jù)肺腺癌組織中UBE2L3 mRNA表達(dá)水平的中位值將肺腺癌患者分為高表達(dá)組316例和低表達(dá)組188例,分析UBE2L3 mRNA表達(dá)水平對(duì)肺腺癌組織中有氧糖酵解水平的影響,即運(yùn)用Spearman秩相關(guān)分析UBE2L3 mRNA表達(dá)水平與LDHA和PKM2 mRNA表達(dá)水平的相關(guān)性。
1.2 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞、試劑和儀器 人肺腺癌細(xì)胞株HCC827和H1299均購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。FBS購自美國Hyclone公司;RPMI 1640培養(yǎng)基購自美國Corning公司;UBE2L3過表達(dá)質(zhì)粒、小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)質(zhì)粒及陰性對(duì)照質(zhì)粒均購自上海吉瑪公司;胰酶、支原體檢測(cè)試劑盒、苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonylfluoride or phenylmethylsulfonyl fluorid,PMSF)蛋白酶與磷酸酶抑制劑、細(xì)胞裂解液RIPA、BCA蛋白定量試劑盒、硝酸纖維素膜、脫脂奶粉、辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗人的IgG、ECL化學(xué)發(fā)光顯影液、磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-hydroxykinase,PI3K)/蛋白激酶 B(protein kinase B,Akt)抑制劑Y294002、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)均購自中國上海碧云天生物技術(shù)有限公司;Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑購自美國Thermo Fisher公司;CCK-8試劑盒購自日本Dojindo公司;葡萄糖測(cè)定試劑盒、乳酸檢測(cè)試劑盒均購自美國Sigma公司;UBE2L3抗體、M2-型丙酮酸激酶(pyruvate kinase M2,PKM2)抗體、L-乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase A,LDHA)抗體、Akt抗體、磷酸化 Akt(phosphorylated protein kinase B,p-Akt)抗體、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)抗體均購自美國Abcam公司。倒置熒光相差顯微鏡(型號(hào):CKX53)購自日本Olympus公司;垂直電泳儀(Power Pac Basic)、蛋白轉(zhuǎn)印模塊(Mini TransBlot Cell)和凝膠成像系統(tǒng)(型號(hào):BIORAD Gel Doc XR+)均購自美國Bio-Rad公司;CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱、低溫離心機(jī)(型號(hào):Thermo Scientific MicroCL 21R)均購自美國Thermo Fisher公司;酶標(biāo)儀(型號(hào):ELX-800)購自美國Bio-Tek公司。
1.3 細(xì)胞培養(yǎng) 人肺腺癌細(xì)胞株HCC827和H1299均使用含10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中,隔天更換新鮮培養(yǎng)基。細(xì)胞定期檢測(cè)有無支原體污染,當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%~90%時(shí)用胰酶消化傳代。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。
1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將實(shí)驗(yàn)分為兩個(gè)部分。(1)UBE2L3過表達(dá)細(xì)胞:選擇UBE2L3表達(dá)水平較低的HCC827細(xì)胞為研究對(duì)象,將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞均勻鋪于6孔板中,待細(xì)胞融合度達(dá)到60%~70%時(shí)采用Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑,按說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作,分別將UBE2L3過表達(dá)質(zhì)粒以及陰性對(duì)照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中,轉(zhuǎn)染48 h后,熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率,構(gòu)建UBE2L3過表達(dá)質(zhì)粒細(xì)胞HCC827/UBE2L3及陰性對(duì)照細(xì)胞HCC827/NC,收集細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。(2)UBE2L3敲低細(xì)胞:選擇UBE2L3表達(dá)水平較高的H1299細(xì)胞為研究對(duì)象,如上述方法鋪板,再分別將siRNA質(zhì)粒以及陰性對(duì)照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中,轉(zhuǎn)染48 h后,熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率,構(gòu)建UBE2L3敲低細(xì)胞H1299/si-UBE2L3及陰性對(duì)照細(xì)胞H1299/si-NC,收集細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
1.5 細(xì)胞增殖能力檢測(cè) 采用CCK-8法。將上述轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞接種于96孔板中,每孔加入100 μl細(xì)胞懸液(含3×103個(gè)細(xì)胞)。每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔,分別于0、24、48、72、96 h加入10 μl CCK-8溶液,于培養(yǎng)箱中37℃孵育4 h。采用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm波長(zhǎng)處的吸光度(optical density,OD)值,并繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。
1.6 細(xì)胞中葡萄糖消耗量檢測(cè) 采用葡萄糖測(cè)定試劑盒。嚴(yán)格按照試劑盒操作說明書配置工作液。將上述轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞和工作液加入96孔板中,并設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。置于37℃培養(yǎng)箱中孵育30 min。取出96孔板,去除氣泡后置于酶標(biāo)儀上檢測(cè)630 nm波長(zhǎng)處的OD值,繪制葡萄糖消耗量曲線,計(jì)算細(xì)胞中葡萄糖消耗量。
1.7 細(xì)胞中乳酸生成量檢測(cè) 采用乳酸檢測(cè)試劑盒。收集上述轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞培養(yǎng)基上清液2 ml,加入1 ml酶工作液,置于37℃培養(yǎng)箱中孵育10 min,隨后加入終止液22 ml終止酶促反應(yīng)。將上清混合液加入96孔板中,置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 min。取出96孔板,使用酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm波長(zhǎng)處的OD值,計(jì)算細(xì)胞中乳酸生成量。
1.8 UBE2L3、有氧糖酵解相關(guān)蛋白PKM2、LDHA表達(dá)水平檢測(cè) 采用Western blot法。使用含1%PMSF蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液RIPA裂解上述轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞。置于冰上均勻搖晃15 min后,采用細(xì)胞刮子收集裂解液。裂解液于4℃、12 000 g離心15 min,收集上清液采用BCA法測(cè)定蛋白濃度。加入蛋白緩沖液調(diào)節(jié)蛋白濃度,于100℃沸水中水浴5 min使其蛋白變性,將蛋白裂解液置于-80℃冰箱備用。每孔加入30 μg蛋白樣品,經(jīng)10%聚丙烯酰胺凝膠電泳并轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。將整張膜浸泡5%脫脂奶粉常溫封閉1 h,加入U(xiǎn)BE2L3(1∶1 000)抗體、PKM2(1∶1 000)抗體、LDHA(1∶1 000)抗體、Akt(1:1 000)抗體、p-Akt抗體和GAPDH(1∶2 000)抗體于4℃下?lián)u床過夜孵育。PBST緩沖液洗膜后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗,常溫孵育1 h。采用化學(xué)發(fā)光顯影液發(fā)光,在成像系統(tǒng)中掃描并分析結(jié)果。使用Image J軟件計(jì)算各個(gè)條帶的灰度值,即蛋白表達(dá)水平。
1.9 PI3K/Akt抑制劑對(duì)HCC827/UBE2L3細(xì)胞的有氧糖酵解的影響 將上述轉(zhuǎn)染成功后的HCC827/UBE2L3細(xì)胞,分別加入PI3K/Akt抑制劑Y294002(1.5 μmol/L)(HCC827/UBE2L3+LY)及DMSO(1.5 μmol/L)作為陰性對(duì)照(HCC827/UBE2L3+DMSO)。細(xì)胞培養(yǎng)24 h后,收集細(xì)胞,上述方法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力、葡萄糖消耗量、乳酸生成量及UBE2L3、有氧糖酵解相關(guān)蛋白PKM2、LDHA表達(dá)水平。
1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.1 肺腺癌組織和正常肺組織中UBE2L3蛋白表達(dá)水平比較 生物信息學(xué)分析提示,肺腺癌組織中UBE2L3蛋白表達(dá)水平高于正常肺組織(P<0.05),見圖1。
圖1 肺腺癌組織和正常肺組織中UBE2L3蛋白表達(dá)水平比較
2.2 不同UBE2L3表達(dá)水平肺腺癌患者總生存期的比較 UBE2L3高表達(dá)組患者總生存期低于低表達(dá)組(P<0.05),見圖2。
圖2 不同UBE2L3表達(dá)水平肺腺癌患者總生存期的比較
2.3 UBE2L3 mRNA表達(dá)水平對(duì)肺腺癌組織中有氧糖酵解水平的影響 肺腺癌組織中UBE2L3 mRNA表達(dá)水平升高,同時(shí)LDHA和PKM2 mRNA表達(dá)水平也隨著升高。UBE2L3 mRNA表達(dá)水平與LDHA和PKM2 mRNA表達(dá)水平均呈正相關(guān)(r=0.258和0.404,均P<0.01),見圖3。
圖3 UBE2L3 mRNA表達(dá)水平對(duì)肺腺癌組織中有氧糖酵解水平的影響(A:肺腺癌組織中UBE2L3 mRNA表達(dá)水平與LDHA mRNA表達(dá)水平相關(guān)性分析的散點(diǎn)圖;B:肺腺癌組織中UBE2L3 mRNA表達(dá)水平與PKM2 mRNA表達(dá)水平相關(guān)性分析的散點(diǎn)圖)
2.4 UBE2L3表達(dá)水平對(duì)肺腺癌細(xì)胞增殖能力的影響 HCC827/UBE2L3組細(xì)胞在48、72、96 h時(shí)增殖能力均高于HCC827/NC組(均P<0.05),見圖4A。H1299/si-NC組細(xì)胞在48、72、96 h時(shí)增殖能力均高于H1299/si-UBE2L3組(均P<0.05),見圖4B。
圖4 UBE2L3表達(dá)水平對(duì)肺腺癌細(xì)胞增殖能力的影響(A:HCC827/UBE2L3組和HCC827/NC組細(xì)胞不同時(shí)點(diǎn)增殖能力比較;B:H1299/si-UBE2L3組和H1299/si-NC組細(xì)胞不同時(shí)點(diǎn)增殖能力比較)
2.5 UBE2L3表達(dá)水平對(duì)肺腺癌細(xì)胞中葡萄糖消耗量與乳酸代謝的影響 有氧糖酵解實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,HCC827/UBE2L3組細(xì)胞葡萄糖消耗量大于HCC827/NC組,H1299/si-UBE2L3組細(xì)胞葡萄糖消耗量小于H1299/si-NC組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05),見圖5A。HCC827/UBE2L3組細(xì)胞乳酸生成量大于HCC827/NC組,H1299/si-UBE2L3組細(xì)胞乳酸生成量小于H1299/si-NC組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05),見圖5B。
圖5 UBE2L3表達(dá)水平對(duì)肺腺癌細(xì)胞中葡萄糖消耗量與乳酸代謝的影響(A:不同組間葡萄糖消耗量比較;B:不同組間乳酸生成量比較)
2.6 UBE2L3表達(dá)水平對(duì)肺腺癌細(xì)胞中有氧糖酵解相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 HCC827/UBE2L3組細(xì)胞PKM2和LDHA蛋白表達(dá)水平明顯高于HCC827/NC組,而H1299/si-UBE2L3組細(xì)胞PKM2、LDHA蛋白表達(dá)水平明顯低于H1299/si-NC組,見圖6。
圖6 UBE2L3 表達(dá)水平影響肺腺癌細(xì)胞有氧糖酵解相關(guān)蛋白表達(dá)的電泳圖
2.7 UBE2L3表達(dá)水平對(duì)PI3K/Akt信號(hào)通路蛋白表達(dá)的影響 過表達(dá)UBE2L3后,HCC827/UBE2L3組細(xì)胞p-Akt蛋白表達(dá)水平明顯高于HCC827/NC組,而兩組細(xì)胞Akt表達(dá)水平無明顯變化;H1299/si-UBE2L3組細(xì)胞p-Akt蛋白表達(dá)水平低于H1299/si-NC組,而兩組細(xì)胞Akt表達(dá)水平無明顯變化,見圖7。
圖7 UBE2L3表達(dá)水平影響PI3K/Akt信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的電泳圖
2.8 PI3K/Akt抑制劑對(duì)UBE2L3的有氧糖酵解的影響 經(jīng)過抑制劑Y294002處理HCC827/UBE2L3細(xì)胞后,Akt活性被抑制,p-Akt、LDHA和PKM2蛋白表達(dá)水平均下降,見圖8A。同樣,細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示,經(jīng)過抑制劑處理后的HCC827/UBE2L3細(xì)胞增殖能力較HCC827/UBE2L3+DMSO組下降,見8B。通過有氧糖酵解實(shí)驗(yàn)可以看出,經(jīng)過抑制劑處理后的HCC827/UBE2L3細(xì)胞葡萄糖消耗量較HCC827/UBE2L3+DMSO組明顯下降,見8C。乳酸生成量檢測(cè)結(jié)果也可以看出,經(jīng)過抑制劑處理后的HCC827/UBE2L3細(xì)胞乳酸生成量較HCC827/UBE2L3+DMSO組明顯下降,見圖8D。
圖8 PI3K/Akt抑制劑對(duì)UBE2L3的有氧糖酵解的影響(A:HCC827/UBE2L3細(xì)胞中加入抑制劑后p-Akt、PKM2和LDHA蛋白表達(dá)的電泳圖;B:加入抑制劑后對(duì)HCC827/UBE2L3細(xì)胞增殖的影響;C:加入抑制劑后對(duì)HCC827/UBE2L3細(xì)胞葡萄糖消耗量的影響;D:加入抑制劑后對(duì)HCC827/UBE2L3細(xì)胞乳酸生成量的影響)
在有氧條件下,正常細(xì)胞通過線粒體氧化磷酸化提供能量,而腫瘤細(xì)胞通過糖酵解途徑產(chǎn)生絕大部分維持生存和快速增殖的能量,該現(xiàn)象被稱為Warburg效應(yīng)或有氧糖酵解[5]。癌細(xì)胞代謝重編輯被認(rèn)為是惡性腫瘤的十大重要特征之一[6]。糖酵解使得腫瘤細(xì)胞在即使缺氧的條件下也能存活下來,并為腫瘤細(xì)胞提供快速增殖所需的能量。同時(shí)糖酵解過程中產(chǎn)生的酸性環(huán)境有利于腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲,增加腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率[7-8]。因此腫瘤的有氧糖酵解過程是近年來腫瘤領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。盡管Warburg效應(yīng)的發(fā)現(xiàn)已有很長(zhǎng)一段時(shí)間,但其具體調(diào)控機(jī)制仍然尚不清楚。深入研究有利于探索新的腫瘤治療靶點(diǎn),改善腫瘤患者的生存預(yù)后。
UBE2L3是泛素結(jié)合酶家族成員之一,越來越多的研究表明UBE2L3的異常表達(dá)參與了多種腫瘤的發(fā)展過程。在肝癌中,UBE2L3促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移[9-10]。在前列腺癌中,UBE2L3參與調(diào)控上皮-間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程,并且發(fā)揮癌基因的作用[11]。在宮頸癌中,UBE2L3參與調(diào)控順鉑化療耐藥的分子機(jī)制[12]。之前研究報(bào)道UBE2L3在肺腺癌組織中異常高表達(dá),且與不良臨床病理特征有關(guān)[13]。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)均表明,UBE2L3能夠顯著增強(qiáng)肺腺癌細(xì)胞的增殖能力。UBE2L3通過SCF(Skp2)泛素連接酶復(fù)合物促進(jìn)p27kip1的泛素化降解調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程[13]。然而,UBE2L3是否參與肺腺癌的有氧糖酵解過程尚不清楚。葡萄糖消耗量和乳酸生成量是最常用的檢測(cè)糖酵解活性的指標(biāo)。同時(shí)糖酵解過程受到LDHA和PKM2等關(guān)鍵蛋白酶的限速調(diào)控。因此,檢測(cè)細(xì)胞糖酵解關(guān)鍵酶的表達(dá)量也能夠檢測(cè)糖酵解的活性。本研究中,在HCC827細(xì)胞中過表達(dá)UBE2L3能夠顯著增加細(xì)胞對(duì)葡萄糖的消耗和乳酸的產(chǎn)量,同時(shí)提高糖酵解相關(guān)蛋白PKM2和LDHA蛋白的表達(dá)水平。而在H1299細(xì)胞中UBE2L3沉默能夠抑制細(xì)胞對(duì)葡萄糖的消耗和乳酸的產(chǎn)量,降低PKM2和LDHA蛋白的表達(dá)量。因此,UBE2L3參與了肺腺癌有氧糖酵解過程。
腫瘤中通常存在PI3K/Akt信號(hào)通路異常活化,參與多種惡性生物學(xué)過程,尤其是激活的PI3K/Akt信號(hào)通路能夠增加腫瘤細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取和糖酵解相關(guān)基因的表達(dá),從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的糖酵解過程[14-16]。深入研究發(fā)現(xiàn),過表達(dá)UBE2L3顯著增加p-Akt蛋白的表達(dá);敲低UBE2L3后p-Akt蛋白水平降低。為了進(jìn)一步驗(yàn)證UBE2L3通過激活PI3K/Akt信號(hào)通路參與有氧糖酵解過程,采用PI3K/Akt抑制劑LY294002阻斷PI3K/Akt信號(hào)通路。UBE2L3過表達(dá)細(xì)胞中加入PI3K/Akt信號(hào)通路抑制劑Y294002處理后,葡萄糖消耗量和乳酸生成量明顯減少,而PKM2和LDHA蛋白表達(dá)水平下降。并且Y294002處理后HCC827/UBE2L3細(xì)胞的增殖能力明顯受到抑制。因此,UBE2L3可能參與激活PI3K/Akt信號(hào)通路從而促進(jìn)有氧糖酵解過程,以此增加肺腺癌的惡性增殖。
綜上所述,本研究證實(shí)UBE2L3能夠通過激活PI3K/Akt信號(hào)通路促進(jìn)肺腺癌葡萄糖的攝取,增強(qiáng)糖酵解過程,促進(jìn)肺腺癌惡性增殖,為深入研究肺腺癌的發(fā)病機(jī)制提供了新的線索。