• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    UBE2L3參與肺腺癌細(xì)胞有氧糖酵解的機(jī)制研究

    2023-02-19 07:01:26潘歡楊帆戚維波馬興杰
    浙江醫(yī)學(xué) 2023年1期
    關(guān)鍵詞:糖酵解有氧乳酸

    潘歡 楊帆 戚維波 馬興杰

    肺癌是我國最常見的惡性腫瘤,其發(fā)病率和死亡率均位居惡性腫瘤的第一位[1]。非小細(xì)胞肺癌(nonsmall cell lung cancer,NSCLC)是腫瘤最常見的組織學(xué)類型,約占肺癌的80%~85%[2]。其中,肺腺癌又是NSCLC中最常見的病理組織亞型。由于肺腺癌具有高侵襲性、高早期轉(zhuǎn)移率和高術(shù)后復(fù)發(fā)率等特點(diǎn),所以患者的總體預(yù)后仍然不容樂觀[3]。研究表明腫瘤的發(fā)生和發(fā)展是一個(gè)復(fù)雜的多步驟過程,包括抑癌基因失活、癌基因的激活、腫瘤細(xì)胞的增殖和凋亡失衡,最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的惡性增殖。即使在氧氣充足的條件下,腫瘤細(xì)胞仍然傾向于將糖酵解作為其主要的能量代謝方式,這種現(xiàn)象被稱為Warburg效應(yīng)[4]。深入研究有氧糖酵解過程中的分子調(diào)控機(jī)制有助于發(fā)現(xiàn)新的腫瘤治療靶點(diǎn)。本研究旨在探索泛素蛋白連接酶L3(ubiquitin conjugating enzyme E2 L3,UBE2L3)對(duì)肺腺癌細(xì)胞有氧糖酵解的影響,并初步研究UBE2L3調(diào)控有氧糖酵解的分子機(jī)制。

    1 材料和方法

    1.1 生物信息學(xué)分析 本研究生物信息學(xué)分析數(shù)據(jù)下載自腫瘤基因組圖譜(the Cancer Genome Atlas,TCGA)數(shù)據(jù)庫(https://www.cancer.gov/tcga)。504例肺腺癌組織和59例正常肺組織列入本研究,比較肺腺癌組織和正常肺組織中UBE2L3蛋白表達(dá)水平。根據(jù)UBE2L3在肺腺癌組織中的表達(dá)中位值將肺腺癌組織分為UBE2L3高表達(dá)組和低表達(dá)組,運(yùn)用R語言中的“survival”和“survminer”生存分析包分析UBE2L3 mRNA表達(dá)水平與肺腺癌患者總生存期的關(guān)系。根據(jù)肺腺癌組織中UBE2L3 mRNA表達(dá)水平的中位值將肺腺癌患者分為高表達(dá)組316例和低表達(dá)組188例,分析UBE2L3 mRNA表達(dá)水平對(duì)肺腺癌組織中有氧糖酵解水平的影響,即運(yùn)用Spearman秩相關(guān)分析UBE2L3 mRNA表達(dá)水平與LDHA和PKM2 mRNA表達(dá)水平的相關(guān)性。

    1.2 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞、試劑和儀器 人肺腺癌細(xì)胞株HCC827和H1299均購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。FBS購自美國Hyclone公司;RPMI 1640培養(yǎng)基購自美國Corning公司;UBE2L3過表達(dá)質(zhì)粒、小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)質(zhì)粒及陰性對(duì)照質(zhì)粒均購自上海吉瑪公司;胰酶、支原體檢測(cè)試劑盒、苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonylfluoride or phenylmethylsulfonyl fluorid,PMSF)蛋白酶與磷酸酶抑制劑、細(xì)胞裂解液RIPA、BCA蛋白定量試劑盒、硝酸纖維素膜、脫脂奶粉、辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗人的IgG、ECL化學(xué)發(fā)光顯影液、磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-hydroxykinase,PI3K)/蛋白激酶 B(protein kinase B,Akt)抑制劑Y294002、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)均購自中國上海碧云天生物技術(shù)有限公司;Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑購自美國Thermo Fisher公司;CCK-8試劑盒購自日本Dojindo公司;葡萄糖測(cè)定試劑盒、乳酸檢測(cè)試劑盒均購自美國Sigma公司;UBE2L3抗體、M2-型丙酮酸激酶(pyruvate kinase M2,PKM2)抗體、L-乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase A,LDHA)抗體、Akt抗體、磷酸化 Akt(phosphorylated protein kinase B,p-Akt)抗體、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)抗體均購自美國Abcam公司。倒置熒光相差顯微鏡(型號(hào):CKX53)購自日本Olympus公司;垂直電泳儀(Power Pac Basic)、蛋白轉(zhuǎn)印模塊(Mini TransBlot Cell)和凝膠成像系統(tǒng)(型號(hào):BIORAD Gel Doc XR+)均購自美國Bio-Rad公司;CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱、低溫離心機(jī)(型號(hào):Thermo Scientific MicroCL 21R)均購自美國Thermo Fisher公司;酶標(biāo)儀(型號(hào):ELX-800)購自美國Bio-Tek公司。

    1.3 細(xì)胞培養(yǎng) 人肺腺癌細(xì)胞株HCC827和H1299均使用含10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中,隔天更換新鮮培養(yǎng)基。細(xì)胞定期檢測(cè)有無支原體污染,當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%~90%時(shí)用胰酶消化傳代。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

    1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將實(shí)驗(yàn)分為兩個(gè)部分。(1)UBE2L3過表達(dá)細(xì)胞:選擇UBE2L3表達(dá)水平較低的HCC827細(xì)胞為研究對(duì)象,將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞均勻鋪于6孔板中,待細(xì)胞融合度達(dá)到60%~70%時(shí)采用Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑,按說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作,分別將UBE2L3過表達(dá)質(zhì)粒以及陰性對(duì)照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中,轉(zhuǎn)染48 h后,熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率,構(gòu)建UBE2L3過表達(dá)質(zhì)粒細(xì)胞HCC827/UBE2L3及陰性對(duì)照細(xì)胞HCC827/NC,收集細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。(2)UBE2L3敲低細(xì)胞:選擇UBE2L3表達(dá)水平較高的H1299細(xì)胞為研究對(duì)象,如上述方法鋪板,再分別將siRNA質(zhì)粒以及陰性對(duì)照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中,轉(zhuǎn)染48 h后,熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率,構(gòu)建UBE2L3敲低細(xì)胞H1299/si-UBE2L3及陰性對(duì)照細(xì)胞H1299/si-NC,收集細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

    1.5 細(xì)胞增殖能力檢測(cè) 采用CCK-8法。將上述轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞接種于96孔板中,每孔加入100 μl細(xì)胞懸液(含3×103個(gè)細(xì)胞)。每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔,分別于0、24、48、72、96 h加入10 μl CCK-8溶液,于培養(yǎng)箱中37℃孵育4 h。采用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm波長(zhǎng)處的吸光度(optical density,OD)值,并繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

    1.6 細(xì)胞中葡萄糖消耗量檢測(cè) 采用葡萄糖測(cè)定試劑盒。嚴(yán)格按照試劑盒操作說明書配置工作液。將上述轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞和工作液加入96孔板中,并設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。置于37℃培養(yǎng)箱中孵育30 min。取出96孔板,去除氣泡后置于酶標(biāo)儀上檢測(cè)630 nm波長(zhǎng)處的OD值,繪制葡萄糖消耗量曲線,計(jì)算細(xì)胞中葡萄糖消耗量。

    1.7 細(xì)胞中乳酸生成量檢測(cè) 采用乳酸檢測(cè)試劑盒。收集上述轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞培養(yǎng)基上清液2 ml,加入1 ml酶工作液,置于37℃培養(yǎng)箱中孵育10 min,隨后加入終止液22 ml終止酶促反應(yīng)。將上清混合液加入96孔板中,置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 min。取出96孔板,使用酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm波長(zhǎng)處的OD值,計(jì)算細(xì)胞中乳酸生成量。

    1.8 UBE2L3、有氧糖酵解相關(guān)蛋白PKM2、LDHA表達(dá)水平檢測(cè) 采用Western blot法。使用含1%PMSF蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液RIPA裂解上述轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞。置于冰上均勻搖晃15 min后,采用細(xì)胞刮子收集裂解液。裂解液于4℃、12 000 g離心15 min,收集上清液采用BCA法測(cè)定蛋白濃度。加入蛋白緩沖液調(diào)節(jié)蛋白濃度,于100℃沸水中水浴5 min使其蛋白變性,將蛋白裂解液置于-80℃冰箱備用。每孔加入30 μg蛋白樣品,經(jīng)10%聚丙烯酰胺凝膠電泳并轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。將整張膜浸泡5%脫脂奶粉常溫封閉1 h,加入U(xiǎn)BE2L3(1∶1 000)抗體、PKM2(1∶1 000)抗體、LDHA(1∶1 000)抗體、Akt(1:1 000)抗體、p-Akt抗體和GAPDH(1∶2 000)抗體于4℃下?lián)u床過夜孵育。PBST緩沖液洗膜后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗,常溫孵育1 h。采用化學(xué)發(fā)光顯影液發(fā)光,在成像系統(tǒng)中掃描并分析結(jié)果。使用Image J軟件計(jì)算各個(gè)條帶的灰度值,即蛋白表達(dá)水平。

    1.9 PI3K/Akt抑制劑對(duì)HCC827/UBE2L3細(xì)胞的有氧糖酵解的影響 將上述轉(zhuǎn)染成功后的HCC827/UBE2L3細(xì)胞,分別加入PI3K/Akt抑制劑Y294002(1.5 μmol/L)(HCC827/UBE2L3+LY)及DMSO(1.5 μmol/L)作為陰性對(duì)照(HCC827/UBE2L3+DMSO)。細(xì)胞培養(yǎng)24 h后,收集細(xì)胞,上述方法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力、葡萄糖消耗量、乳酸生成量及UBE2L3、有氧糖酵解相關(guān)蛋白PKM2、LDHA表達(dá)水平。

    1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 肺腺癌組織和正常肺組織中UBE2L3蛋白表達(dá)水平比較 生物信息學(xué)分析提示,肺腺癌組織中UBE2L3蛋白表達(dá)水平高于正常肺組織(P<0.05),見圖1。

    圖1 肺腺癌組織和正常肺組織中UBE2L3蛋白表達(dá)水平比較

    2.2 不同UBE2L3表達(dá)水平肺腺癌患者總生存期的比較 UBE2L3高表達(dá)組患者總生存期低于低表達(dá)組(P<0.05),見圖2。

    圖2 不同UBE2L3表達(dá)水平肺腺癌患者總生存期的比較

    2.3 UBE2L3 mRNA表達(dá)水平對(duì)肺腺癌組織中有氧糖酵解水平的影響 肺腺癌組織中UBE2L3 mRNA表達(dá)水平升高,同時(shí)LDHA和PKM2 mRNA表達(dá)水平也隨著升高。UBE2L3 mRNA表達(dá)水平與LDHA和PKM2 mRNA表達(dá)水平均呈正相關(guān)(r=0.258和0.404,均P<0.01),見圖3。

    圖3 UBE2L3 mRNA表達(dá)水平對(duì)肺腺癌組織中有氧糖酵解水平的影響(A:肺腺癌組織中UBE2L3 mRNA表達(dá)水平與LDHA mRNA表達(dá)水平相關(guān)性分析的散點(diǎn)圖;B:肺腺癌組織中UBE2L3 mRNA表達(dá)水平與PKM2 mRNA表達(dá)水平相關(guān)性分析的散點(diǎn)圖)

    2.4 UBE2L3表達(dá)水平對(duì)肺腺癌細(xì)胞增殖能力的影響 HCC827/UBE2L3組細(xì)胞在48、72、96 h時(shí)增殖能力均高于HCC827/NC組(均P<0.05),見圖4A。H1299/si-NC組細(xì)胞在48、72、96 h時(shí)增殖能力均高于H1299/si-UBE2L3組(均P<0.05),見圖4B。

    圖4 UBE2L3表達(dá)水平對(duì)肺腺癌細(xì)胞增殖能力的影響(A:HCC827/UBE2L3組和HCC827/NC組細(xì)胞不同時(shí)點(diǎn)增殖能力比較;B:H1299/si-UBE2L3組和H1299/si-NC組細(xì)胞不同時(shí)點(diǎn)增殖能力比較)

    2.5 UBE2L3表達(dá)水平對(duì)肺腺癌細(xì)胞中葡萄糖消耗量與乳酸代謝的影響 有氧糖酵解實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,HCC827/UBE2L3組細(xì)胞葡萄糖消耗量大于HCC827/NC組,H1299/si-UBE2L3組細(xì)胞葡萄糖消耗量小于H1299/si-NC組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05),見圖5A。HCC827/UBE2L3組細(xì)胞乳酸生成量大于HCC827/NC組,H1299/si-UBE2L3組細(xì)胞乳酸生成量小于H1299/si-NC組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05),見圖5B。

    圖5 UBE2L3表達(dá)水平對(duì)肺腺癌細(xì)胞中葡萄糖消耗量與乳酸代謝的影響(A:不同組間葡萄糖消耗量比較;B:不同組間乳酸生成量比較)

    2.6 UBE2L3表達(dá)水平對(duì)肺腺癌細(xì)胞中有氧糖酵解相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 HCC827/UBE2L3組細(xì)胞PKM2和LDHA蛋白表達(dá)水平明顯高于HCC827/NC組,而H1299/si-UBE2L3組細(xì)胞PKM2、LDHA蛋白表達(dá)水平明顯低于H1299/si-NC組,見圖6。

    圖6 UBE2L3 表達(dá)水平影響肺腺癌細(xì)胞有氧糖酵解相關(guān)蛋白表達(dá)的電泳圖

    2.7 UBE2L3表達(dá)水平對(duì)PI3K/Akt信號(hào)通路蛋白表達(dá)的影響 過表達(dá)UBE2L3后,HCC827/UBE2L3組細(xì)胞p-Akt蛋白表達(dá)水平明顯高于HCC827/NC組,而兩組細(xì)胞Akt表達(dá)水平無明顯變化;H1299/si-UBE2L3組細(xì)胞p-Akt蛋白表達(dá)水平低于H1299/si-NC組,而兩組細(xì)胞Akt表達(dá)水平無明顯變化,見圖7。

    圖7 UBE2L3表達(dá)水平影響PI3K/Akt信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的電泳圖

    2.8 PI3K/Akt抑制劑對(duì)UBE2L3的有氧糖酵解的影響 經(jīng)過抑制劑Y294002處理HCC827/UBE2L3細(xì)胞后,Akt活性被抑制,p-Akt、LDHA和PKM2蛋白表達(dá)水平均下降,見圖8A。同樣,細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示,經(jīng)過抑制劑處理后的HCC827/UBE2L3細(xì)胞增殖能力較HCC827/UBE2L3+DMSO組下降,見8B。通過有氧糖酵解實(shí)驗(yàn)可以看出,經(jīng)過抑制劑處理后的HCC827/UBE2L3細(xì)胞葡萄糖消耗量較HCC827/UBE2L3+DMSO組明顯下降,見8C。乳酸生成量檢測(cè)結(jié)果也可以看出,經(jīng)過抑制劑處理后的HCC827/UBE2L3細(xì)胞乳酸生成量較HCC827/UBE2L3+DMSO組明顯下降,見圖8D。

    圖8 PI3K/Akt抑制劑對(duì)UBE2L3的有氧糖酵解的影響(A:HCC827/UBE2L3細(xì)胞中加入抑制劑后p-Akt、PKM2和LDHA蛋白表達(dá)的電泳圖;B:加入抑制劑后對(duì)HCC827/UBE2L3細(xì)胞增殖的影響;C:加入抑制劑后對(duì)HCC827/UBE2L3細(xì)胞葡萄糖消耗量的影響;D:加入抑制劑后對(duì)HCC827/UBE2L3細(xì)胞乳酸生成量的影響)

    3 討論

    在有氧條件下,正常細(xì)胞通過線粒體氧化磷酸化提供能量,而腫瘤細(xì)胞通過糖酵解途徑產(chǎn)生絕大部分維持生存和快速增殖的能量,該現(xiàn)象被稱為Warburg效應(yīng)或有氧糖酵解[5]。癌細(xì)胞代謝重編輯被認(rèn)為是惡性腫瘤的十大重要特征之一[6]。糖酵解使得腫瘤細(xì)胞在即使缺氧的條件下也能存活下來,并為腫瘤細(xì)胞提供快速增殖所需的能量。同時(shí)糖酵解過程中產(chǎn)生的酸性環(huán)境有利于腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲,增加腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率[7-8]。因此腫瘤的有氧糖酵解過程是近年來腫瘤領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。盡管Warburg效應(yīng)的發(fā)現(xiàn)已有很長(zhǎng)一段時(shí)間,但其具體調(diào)控機(jī)制仍然尚不清楚。深入研究有利于探索新的腫瘤治療靶點(diǎn),改善腫瘤患者的生存預(yù)后。

    UBE2L3是泛素結(jié)合酶家族成員之一,越來越多的研究表明UBE2L3的異常表達(dá)參與了多種腫瘤的發(fā)展過程。在肝癌中,UBE2L3促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移[9-10]。在前列腺癌中,UBE2L3參與調(diào)控上皮-間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程,并且發(fā)揮癌基因的作用[11]。在宮頸癌中,UBE2L3參與調(diào)控順鉑化療耐藥的分子機(jī)制[12]。之前研究報(bào)道UBE2L3在肺腺癌組織中異常高表達(dá),且與不良臨床病理特征有關(guān)[13]。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)均表明,UBE2L3能夠顯著增強(qiáng)肺腺癌細(xì)胞的增殖能力。UBE2L3通過SCF(Skp2)泛素連接酶復(fù)合物促進(jìn)p27kip1的泛素化降解調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程[13]。然而,UBE2L3是否參與肺腺癌的有氧糖酵解過程尚不清楚。葡萄糖消耗量和乳酸生成量是最常用的檢測(cè)糖酵解活性的指標(biāo)。同時(shí)糖酵解過程受到LDHA和PKM2等關(guān)鍵蛋白酶的限速調(diào)控。因此,檢測(cè)細(xì)胞糖酵解關(guān)鍵酶的表達(dá)量也能夠檢測(cè)糖酵解的活性。本研究中,在HCC827細(xì)胞中過表達(dá)UBE2L3能夠顯著增加細(xì)胞對(duì)葡萄糖的消耗和乳酸的產(chǎn)量,同時(shí)提高糖酵解相關(guān)蛋白PKM2和LDHA蛋白的表達(dá)水平。而在H1299細(xì)胞中UBE2L3沉默能夠抑制細(xì)胞對(duì)葡萄糖的消耗和乳酸的產(chǎn)量,降低PKM2和LDHA蛋白的表達(dá)量。因此,UBE2L3參與了肺腺癌有氧糖酵解過程。

    腫瘤中通常存在PI3K/Akt信號(hào)通路異常活化,參與多種惡性生物學(xué)過程,尤其是激活的PI3K/Akt信號(hào)通路能夠增加腫瘤細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取和糖酵解相關(guān)基因的表達(dá),從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的糖酵解過程[14-16]。深入研究發(fā)現(xiàn),過表達(dá)UBE2L3顯著增加p-Akt蛋白的表達(dá);敲低UBE2L3后p-Akt蛋白水平降低。為了進(jìn)一步驗(yàn)證UBE2L3通過激活PI3K/Akt信號(hào)通路參與有氧糖酵解過程,采用PI3K/Akt抑制劑LY294002阻斷PI3K/Akt信號(hào)通路。UBE2L3過表達(dá)細(xì)胞中加入PI3K/Akt信號(hào)通路抑制劑Y294002處理后,葡萄糖消耗量和乳酸生成量明顯減少,而PKM2和LDHA蛋白表達(dá)水平下降。并且Y294002處理后HCC827/UBE2L3細(xì)胞的增殖能力明顯受到抑制。因此,UBE2L3可能參與激活PI3K/Akt信號(hào)通路從而促進(jìn)有氧糖酵解過程,以此增加肺腺癌的惡性增殖。

    綜上所述,本研究證實(shí)UBE2L3能夠通過激活PI3K/Akt信號(hào)通路促進(jìn)肺腺癌葡萄糖的攝取,增強(qiáng)糖酵解過程,促進(jìn)肺腺癌惡性增殖,為深入研究肺腺癌的發(fā)病機(jī)制提供了新的線索。

    猜你喜歡
    糖酵解有氧乳酸
    非編碼RNA在胃癌糖酵解中作用的研究進(jìn)展
    老人鍛煉,力量、有氧、平衡都需要
    中老年保健(2022年3期)2022-11-21 09:40:36
    有氧運(yùn)動(dòng)與老年認(rèn)知障礙
    中老年保健(2022年2期)2022-08-24 03:21:54
    如何從零基礎(chǔ)開始有氧運(yùn)動(dòng)
    中老年保健(2022年4期)2022-08-22 03:01:18
    老年心力衰竭患者BNP及乳酸水平與心功能的相關(guān)性
    二甲雙胍與乳酸酸中毒及其在冠狀動(dòng)脈造影期間的應(yīng)用
    糖酵解與動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展
    放射對(duì)口腔鱗癌細(xì)胞DNA損傷和糖酵解的影響
    18F-FDG PET/CT中病灶糖酵解總量判斷局部晚期胰腺癌放射治療的預(yù)后價(jià)值
    腹腔鏡手術(shù)相關(guān)的高乳酸血癥或乳酸性酸中毒
    久久久精品欧美日韩精品| a在线观看视频网站| 给我免费播放毛片高清在线观看| 午夜福利成人在线免费观看| 国产亚洲精品一区二区www| 中文字幕高清在线视频| 国产精品一区二区精品视频观看| 欧美av亚洲av综合av国产av| 国产伦人伦偷精品视频| 99热6这里只有精品| 国产探花在线观看一区二区| 欧美三级亚洲精品| 一二三四社区在线视频社区8| 69av精品久久久久久| 又爽又黄无遮挡网站| 中文字幕av在线有码专区| 999精品在线视频| 国产精品一及| 1024视频免费在线观看| 国产精品永久免费网站| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 国产av在哪里看| 色综合站精品国产| 午夜免费激情av| 精品欧美一区二区三区在线| 精品高清国产在线一区| 男人舔奶头视频| 久久久久久国产a免费观看| 99在线视频只有这里精品首页| 欧美大码av| av免费在线观看网站| 国产野战对白在线观看| 叶爱在线成人免费视频播放| 狂野欧美激情性xxxx| 欧美日韩国产亚洲二区| 人人妻人人澡欧美一区二区| 日本免费a在线| 在线看三级毛片| 国产1区2区3区精品| 久久婷婷成人综合色麻豆| 他把我摸到了高潮在线观看| 亚洲成av人片免费观看| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 黄色成人免费大全| 亚洲片人在线观看| 在线观看午夜福利视频| 黄色a级毛片大全视频| 在线a可以看的网站| 国产一区在线观看成人免费| 亚洲国产欧美一区二区综合| 亚洲天堂国产精品一区在线| 亚洲成人免费电影在线观看| 老汉色av国产亚洲站长工具| 好男人在线观看高清免费视频| 九色国产91popny在线| 精品不卡国产一区二区三区| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 欧美成人性av电影在线观看| 欧美国产日韩亚洲一区| 国产一级毛片七仙女欲春2| 亚洲,欧美精品.| 亚洲五月婷婷丁香| 脱女人内裤的视频| 久久久久久人人人人人| 90打野战视频偷拍视频| 欧美一级毛片孕妇| 麻豆成人av在线观看| 久久99热这里只有精品18| 男女视频在线观看网站免费 | 男人舔女人下体高潮全视频| 午夜福利在线观看吧| 日韩欧美在线二视频| 黄色成人免费大全| 欧美黄色片欧美黄色片| 后天国语完整版免费观看| 婷婷丁香在线五月| 免费在线观看成人毛片| 18禁观看日本| 亚洲国产高清在线一区二区三| 一边摸一边做爽爽视频免费| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 亚洲片人在线观看| 亚洲国产欧美人成| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 午夜亚洲福利在线播放| 久久久久国内视频| 国产成人aa在线观看| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 窝窝影院91人妻| 亚洲专区字幕在线| 国产又色又爽无遮挡免费看| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 久久国产精品人妻蜜桃| 男人舔女人的私密视频| 亚洲九九香蕉| 99久久综合精品五月天人人| 亚洲成人免费电影在线观看| 精品久久久久久久毛片微露脸| 精品熟女少妇八av免费久了| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 国产成人系列免费观看| 一边摸一边抽搐一进一小说| 国产激情偷乱视频一区二区| 国产一区二区在线观看日韩 | 18禁观看日本| 欧美zozozo另类| 亚洲国产精品久久男人天堂| 少妇粗大呻吟视频| 制服丝袜大香蕉在线| 亚洲avbb在线观看| 欧美三级亚洲精品| or卡值多少钱| 色综合欧美亚洲国产小说| 激情在线观看视频在线高清| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 日本成人三级电影网站| 国产一区二区激情短视频| 国内精品久久久久久久电影| 免费无遮挡裸体视频| 国产私拍福利视频在线观看| x7x7x7水蜜桃| 国产精品99久久99久久久不卡| 国产私拍福利视频在线观看| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 在线观看舔阴道视频| 国产真人三级小视频在线观看| 麻豆av在线久日| 久久国产精品人妻蜜桃| 久久人人精品亚洲av| 岛国在线免费视频观看| 午夜精品一区二区三区免费看| 好男人电影高清在线观看| 国产精品精品国产色婷婷| av片东京热男人的天堂| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 久久久久国产一级毛片高清牌| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 欧美成人一区二区免费高清观看 | 国产一级毛片七仙女欲春2| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 国内精品久久久久久久电影| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 日本一本二区三区精品| 免费看a级黄色片| 色播亚洲综合网| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 亚洲专区中文字幕在线| 日本 欧美在线| 欧美一级a爱片免费观看看 | 久久久久久久久免费视频了| 99国产极品粉嫩在线观看| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 国产片内射在线| 一区二区三区高清视频在线| 亚洲精品粉嫩美女一区| www.精华液| 在线观看免费视频日本深夜| 成在线人永久免费视频| 黑人欧美特级aaaaaa片| 啦啦啦免费观看视频1| 俺也久久电影网| 看片在线看免费视频| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 国产1区2区3区精品| 国产一区在线观看成人免费| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 搞女人的毛片| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 亚洲一区高清亚洲精品| 色哟哟哟哟哟哟| 国产精品av久久久久免费| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 嫩草影视91久久| 欧美zozozo另类| 午夜精品一区二区三区免费看| 国产亚洲精品第一综合不卡| 给我免费播放毛片高清在线观看| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 午夜福利成人在线免费观看| 久久欧美精品欧美久久欧美| 日本一二三区视频观看| 欧美日韩瑟瑟在线播放| АⅤ资源中文在线天堂| 狂野欧美激情性xxxx| 欧美三级亚洲精品| 亚洲黑人精品在线| 日日夜夜操网爽| 亚洲国产精品sss在线观看| 男人的好看免费观看在线视频 | 18美女黄网站色大片免费观看| 日日爽夜夜爽网站| 国产精品久久久人人做人人爽| 女警被强在线播放| 日韩中文字幕欧美一区二区| 两个人视频免费观看高清| 黄色a级毛片大全视频| 欧美av亚洲av综合av国产av| 久久香蕉激情| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 午夜福利免费观看在线| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 日韩免费av在线播放| av视频在线观看入口| 国产99久久九九免费精品| 97人妻精品一区二区三区麻豆| a在线观看视频网站| 中文资源天堂在线| 欧美黑人欧美精品刺激| 首页视频小说图片口味搜索| 在线观看舔阴道视频| 欧美一区二区精品小视频在线| 又紧又爽又黄一区二区| 欧美一区二区精品小视频在线| av在线播放免费不卡| 九九热线精品视视频播放| 午夜精品在线福利| 国产高清videossex| 曰老女人黄片| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 亚洲精品粉嫩美女一区| tocl精华| 午夜久久久久精精品| 国产精品亚洲一级av第二区| 少妇被粗大的猛进出69影院| 高清毛片免费观看视频网站| 曰老女人黄片| 一个人免费在线观看的高清视频| 九色国产91popny在线| 在线视频色国产色| 精品无人区乱码1区二区| 在线观看免费视频日本深夜| 免费人成视频x8x8入口观看| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 久久伊人香网站| 亚洲精品在线观看二区| 午夜精品久久久久久毛片777| 亚洲av五月六月丁香网| 欧美性猛交黑人性爽| 99热6这里只有精品| 丰满的人妻完整版| 成人三级黄色视频| 久久精品影院6| 狠狠狠狠99中文字幕| 99精品欧美一区二区三区四区| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆 | 一个人免费在线观看的高清视频| 免费在线观看日本一区| 亚洲,欧美精品.| 色综合欧美亚洲国产小说| 好男人电影高清在线观看| 久久久久九九精品影院| 成人永久免费在线观看视频| 国产男靠女视频免费网站| 2021天堂中文幕一二区在线观| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 丰满人妻一区二区三区视频av | 淫秽高清视频在线观看| 两个人看的免费小视频| 国产免费av片在线观看野外av| 很黄的视频免费| 全区人妻精品视频| 麻豆av在线久日| 无限看片的www在线观看| 亚洲精品粉嫩美女一区| 啦啦啦观看免费观看视频高清| avwww免费| 国产视频内射| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 国产真实乱freesex| 精品不卡国产一区二区三区| 日本 欧美在线| 国产免费男女视频| 国产精品精品国产色婷婷| 色综合亚洲欧美另类图片| 午夜老司机福利片| 久久久久久九九精品二区国产 | 日本免费一区二区三区高清不卡| 两性夫妻黄色片| 国内精品一区二区在线观看| 一个人免费在线观看电影 | 久久久久亚洲av毛片大全| 禁无遮挡网站| 亚洲国产高清在线一区二区三| 日韩av在线大香蕉| 婷婷亚洲欧美| 国产成人精品久久二区二区91| 91在线观看av| 舔av片在线| 国产99久久九九免费精品| 香蕉av资源在线| 欧美一级毛片孕妇| 精华霜和精华液先用哪个| 女警被强在线播放| 男人舔女人的私密视频| 免费在线观看黄色视频的| 不卡av一区二区三区| 亚洲美女黄片视频| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 久久国产乱子伦精品免费另类| 嫩草影院精品99| 很黄的视频免费| 成年版毛片免费区| 天堂动漫精品| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 老司机在亚洲福利影院| АⅤ资源中文在线天堂| 少妇的丰满在线观看| 国产精品亚洲一级av第二区| 欧美一区二区国产精品久久精品 | 波多野结衣巨乳人妻| 国产真人三级小视频在线观看| 国产精华一区二区三区| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看 | 久久久久免费精品人妻一区二区| 久久久久久久久久黄片| 日本一本二区三区精品| 深夜精品福利| 久久久久久久久免费视频了| 88av欧美| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 国产欧美日韩精品亚洲av| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 国产区一区二久久| 久久久国产欧美日韩av| 欧美丝袜亚洲另类 | av在线天堂中文字幕| 99国产精品99久久久久| 国产精品爽爽va在线观看网站| 中文字幕久久专区| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 精品一区二区三区av网在线观看| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 日韩欧美国产在线观看| 亚洲av美国av| 高潮久久久久久久久久久不卡| 宅男免费午夜| 91老司机精品| 国产欧美日韩精品亚洲av| 亚洲在线自拍视频| 国产黄a三级三级三级人| 免费观看精品视频网站| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 国产99久久九九免费精品| 国产精品一区二区三区四区久久| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 在线免费观看的www视频| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 国产主播在线观看一区二区| 国产精品永久免费网站| 亚洲成人国产一区在线观看| 黄色a级毛片大全视频| 国产成年人精品一区二区| 日本一本二区三区精品| 九色成人免费人妻av| 国产精品电影一区二区三区| 90打野战视频偷拍视频| 欧美日韩国产亚洲二区| 最近最新中文字幕大全免费视频| 国产精品野战在线观看| 五月伊人婷婷丁香| 欧美zozozo另类| 九色成人免费人妻av| 日本一区二区免费在线视频| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 欧美av亚洲av综合av国产av| 久久九九热精品免费| 一本综合久久免费| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 欧美一级毛片孕妇| 亚洲专区中文字幕在线| 日本 欧美在线| 9191精品国产免费久久| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 欧美一级毛片孕妇| 男人舔女人的私密视频| 中亚洲国语对白在线视频| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 宅男免费午夜| 色av中文字幕| 亚洲精品在线观看二区| 两性夫妻黄色片| 岛国在线观看网站| 一个人观看的视频www高清免费观看 | x7x7x7水蜜桃| 久久婷婷成人综合色麻豆| 中文字幕熟女人妻在线| 1024香蕉在线观看| 色精品久久人妻99蜜桃| 精品国内亚洲2022精品成人| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 老司机午夜福利在线观看视频| 老汉色∧v一级毛片| 床上黄色一级片| 精品乱码久久久久久99久播| 色av中文字幕| 老汉色∧v一级毛片| 欧美成人性av电影在线观看| 中文字幕高清在线视频| 日本精品一区二区三区蜜桃| www.精华液| 亚洲精品在线观看二区| 俺也久久电影网| 国产黄片美女视频| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 国产亚洲精品av在线| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 久久伊人香网站| 日韩成人在线观看一区二区三区| 欧美乱妇无乱码| 亚洲色图av天堂| 精品久久久久久久毛片微露脸| 九色国产91popny在线| 五月伊人婷婷丁香| 99久久国产精品久久久| 亚洲色图av天堂| 亚洲国产欧美人成| 午夜成年电影在线免费观看| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 久久久久久久精品吃奶| 看免费av毛片| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 麻豆国产av国片精品| 成人永久免费在线观看视频| 五月玫瑰六月丁香| 人妻久久中文字幕网| 国产激情久久老熟女| 国产精品野战在线观看| 亚洲自拍偷在线| 午夜免费激情av| 国产成人精品久久二区二区免费| 一级a爱片免费观看的视频| 免费看十八禁软件| 中文字幕av在线有码专区| 国产免费av片在线观看野外av| 久9热在线精品视频| 亚洲最大成人中文| 亚洲,欧美精品.| x7x7x7水蜜桃| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 麻豆国产97在线/欧美 | 中文在线观看免费www的网站 | 99久久精品国产亚洲精品| 国产精品亚洲一级av第二区| 国产精品av久久久久免费| 午夜精品一区二区三区免费看| 在线观看一区二区三区| 国产麻豆成人av免费视频| 日本成人三级电影网站| 天天添夜夜摸| 亚洲在线自拍视频| 国产精品av视频在线免费观看| 国产亚洲欧美98| 日本黄色视频三级网站网址| 大型av网站在线播放| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 1024香蕉在线观看| 婷婷丁香在线五月| 国产精品影院久久| 亚洲欧美日韩高清专用| 婷婷精品国产亚洲av| 久久中文字幕一级| 欧美最黄视频在线播放免费| 草草在线视频免费看| 国产麻豆成人av免费视频| 亚洲成人免费电影在线观看| 亚洲av第一区精品v没综合| 久久 成人 亚洲| 少妇被粗大的猛进出69影院| xxxwww97欧美| 不卡一级毛片| 99国产精品一区二区蜜桃av| 人人妻人人看人人澡| 国产精品一及| 精品日产1卡2卡| 久久欧美精品欧美久久欧美| 在线观看免费日韩欧美大片| 亚洲欧美日韩东京热| 亚洲中文av在线| 久久久久精品国产欧美久久久| av天堂在线播放| 国产精华一区二区三区| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 深夜精品福利| 午夜福利成人在线免费观看| 国产爱豆传媒在线观看 | 成人国产综合亚洲| 亚洲中文av在线| 亚洲国产精品久久男人天堂| 国产野战对白在线观看| 亚洲成av人片免费观看| 国内精品一区二区在线观看| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 日本三级黄在线观看| 国产亚洲精品第一综合不卡| 后天国语完整版免费观看| 亚洲国产精品合色在线| 国产一区二区激情短视频| 国产片内射在线| 亚洲国产精品999在线| 可以在线观看的亚洲视频| 黄色成人免费大全| 一夜夜www| 国产伦在线观看视频一区| 日韩欧美免费精品| 国产精品亚洲美女久久久| 亚洲熟妇熟女久久| 久久久久久久精品吃奶| 亚洲一区二区三区不卡视频| 91成年电影在线观看| 精品一区二区三区av网在线观看| 老司机靠b影院| 丰满人妻一区二区三区视频av | 成人欧美大片| 一进一出好大好爽视频| 亚洲国产中文字幕在线视频| 国产亚洲精品第一综合不卡| 国产真实乱freesex| 国产午夜福利久久久久久| 欧美黑人巨大hd| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 90打野战视频偷拍视频| 欧美一级a爱片免费观看看 | 免费看日本二区| 男人舔女人的私密视频| 欧美色视频一区免费| 国产精品久久久久久久电影 | 日韩免费av在线播放| 给我免费播放毛片高清在线观看| 国产精品1区2区在线观看.| 国产黄色小视频在线观看| 色综合婷婷激情| 哪里可以看免费的av片| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 欧美一级毛片孕妇| 亚洲精品一区av在线观看| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 在线看三级毛片| 神马国产精品三级电影在线观看 | 国产亚洲av高清不卡| 舔av片在线| 午夜成年电影在线免费观看| 亚洲精品在线观看二区| 这个男人来自地球电影免费观看| 国产精品电影一区二区三区| 婷婷六月久久综合丁香| aaaaa片日本免费| 男人舔奶头视频| 可以在线观看的亚洲视频| 人妻夜夜爽99麻豆av| 国产精华一区二区三区| 小说图片视频综合网站| 狠狠狠狠99中文字幕| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 天天添夜夜摸| 欧美乱码精品一区二区三区| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 午夜福利欧美成人| 人妻久久中文字幕网| 熟女电影av网| 日韩高清综合在线| 一二三四在线观看免费中文在| 欧美zozozo另类| 日本熟妇午夜| 男女之事视频高清在线观看| 又黄又粗又硬又大视频| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 亚洲国产欧美网| 成在线人永久免费视频| 99久久99久久久精品蜜桃| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 中文字幕久久专区| 亚洲av成人av| 日韩大尺度精品在线看网址| 十八禁网站免费在线| 黄色a级毛片大全视频| 久久久久久久久久黄片| 亚洲成av人片在线播放无| 国产一区二区激情短视频| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 亚洲中文av在线| 天堂av国产一区二区熟女人妻 | 日韩高清综合在线| 欧美成人午夜精品| 俺也久久电影网| 国产99白浆流出| 麻豆成人午夜福利视频| 精品电影一区二区在线| bbb黄色大片| 神马国产精品三级电影在线观看 | 亚洲成人久久性| 欧美日韩一级在线毛片| 成人国产一区最新在线观看| 国产成人av教育| 国产男靠女视频免费网站| 最新在线观看一区二区三区| 亚洲国产精品sss在线观看| 亚洲一区高清亚洲精品| 一级a爱片免费观看的视频| 欧美成人免费av一区二区三区| 一区福利在线观看| 久久久久精品国产欧美久久久| 18禁国产床啪视频网站| 亚洲av成人精品一区久久| 五月玫瑰六月丁香| 欧美最黄视频在线播放免费| 色综合站精品国产| 国产伦一二天堂av在线观看| 搡老妇女老女人老熟妇|