膠體金免疫層析法快速檢測肉類中恩諾沙星、四環(huán)素、頭孢氨芐殘留的應(yīng)用驗證研究

鄧 波 朱衛(wèi)芳 周雨璊 張維誼 宋宇迎 王 敏 朱春燕詹定生 詹 林 豐東升

（1.上海市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全中心，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心（上海），上海 201708；2.上海市青浦區(qū)農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全中心，上海 201799；3.上海北錦實業(yè)有限公司，上海 200241）

畜禽和水產(chǎn)品養(yǎng)殖過程中，為了治療或預(yù)防疾病，部分養(yǎng)殖場濫用抗生素，或長時間使用低劑量的抗生素，造成細菌產(chǎn)生耐藥性，使抗生素治療效果降低，影響?zhàn)B殖行業(yè)發(fā)展[1]。有學(xué)者分析了2018-2020年上海市畜禽肉及蛋類質(zhì)量情況，發(fā)現(xiàn)畜禽肉及蛋類食用農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量基本穩(wěn)定，但藥物濫用現(xiàn)象依舊存在[2]。

恩諾沙星（喹諾酮類抗生素）主要用于水產(chǎn)動物和畜禽，其抗菌作用主要通過阻斷細菌DNA的復(fù)制而產(chǎn)生。四環(huán)素（四環(huán)素類抗生素）可防治家禽多種疾病，除對常見的革蘭氏陰性菌、寄生蟲等有殺滅效果外，還具有減輕禽類應(yīng)激反應(yīng)、增加產(chǎn)蛋量和提高孵化率等效力，其作用機理主要對細菌蛋白質(zhì)合成的肽鏈合成階段及終止階段起作用。頭孢氨芐屬于一代頭孢類抗生素，是畜禽疫病防治中較常用的抗生素之一，對革蘭氏陽性和陰性菌均有較好的抵抗力，通過影響細菌細胞壁的生物合成而起到殺菌作用。

目前，針對以上抗生素類獸藥多殘留的檢測方法主要有高效液相色譜法[3～4]、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[5～6]以及液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[7～9]。但這些方法需要昂貴的儀器設(shè)備和專業(yè)的操作培訓(xùn)，且檢測周期長，不適用于現(xiàn)場快速檢測大批量樣品。同時，目前檢測以上獸藥的快速檢測試紙條（快速檢測卡）多為新上市產(chǎn)品，各個廠家產(chǎn)品質(zhì)量良莠不齊，還缺乏相應(yīng)的產(chǎn)品性能應(yīng)用驗證。本研究對膠體金免疫層析法（Gold immunochromatographic assay，GICA）快速檢測肉類中恩諾沙星、四環(huán)素、頭孢氨芐殘留的適用性、準確性等開展應(yīng)用驗證，以期能彌補以上不足?？焖贆z測試紙條（快速檢測卡）攜帶方便、操作簡便，對檢測人員要求較低，反應(yīng)時間短，適合在市場監(jiān)管和農(nóng)產(chǎn)品執(zhí)法過程中用于現(xiàn)場大批量樣品快速檢測和初篩，經(jīng)應(yīng)用驗證后可廣泛推廣應(yīng)用，具有現(xiàn)實研究意義[10]。

一、材料與方法

（一）材料與試劑在市場上購買不同批次的牛肉、羊肉、豬肉、雞肉、鴨肉、兔肉、魚肉。恩諾沙星快速檢測卡、四環(huán)素快速檢測卡、頭孢氨芐快速檢測卡均購自上海北錦實業(yè)有限公司；恩諾沙星、四環(huán)素、頭孢氨芐標準品均購自壇墨質(zhì)檢科技股份有限公司。

（二）儀器與設(shè)備藥物殘留檢測儀（BJNYW3T，上海北錦實業(yè)有限公司）、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜［LC-MS/MS 1200-6410，安捷倫科技（中國）有限公司］。

（三）膠體金免疫層析法

1.檢測原理。由于小分子抗原很難制備得到配對抗體（相對分子質(zhì)量小，很難找到兩個結(jié)合位點供兩個抗體同時結(jié)合），因此小分子抗原無法用雙抗夾心法進行檢測，通常利用競爭法進行檢測。

使用競爭法的膠體金檢測平臺，在試劑條的結(jié)合墊上固定的是金標抗體或者將標記好抗體的膠體金封閉在微孔內(nèi)，NC膜上T線包被的是大分子偶聯(lián)的待測抗原（小分子抗原不能直接固定于NC膜上，需要通過化學(xué)方法把小分子偶聯(lián)到牛血清白蛋白等大分子物質(zhì)上再固定于NC膜上），C線上固定的是能與金標抗體特異性結(jié)合的二抗（見圖1）。

圖1 競爭法膠體金免疫層析試紙條檢測原理

當待測樣品液體滴加到試劑條上后，通過層析作用，液體依次會流經(jīng)結(jié)合墊、T線、C線，當樣品中有被檢測物時，T線會受到抑制，不顯色或者顯色比C線淡。反之，T線顯色比C線深或者一樣深（見圖2）。

圖2 競爭法膠體金免疫層析試紙條檢測結(jié)果

2.檢測步驟。前處理：將待檢的去脂肪組織樣本絞碎，稱取0.25 g待測樣品于1.5 mL帶刻度離心管中，加入0.75 mL專用稀釋液，劇烈振蕩5 min，室溫下以4 000 r/min離心5 min，吸取上清溶液120μL（約4滴）待檢。

檢測：將用移液槍或滴管吸取的120μL（約4滴）待檢樣品溶液，垂直滴于金標微孔中，浸泡2 min后用移液槍或滴管將金標微孔中的金與待檢液體充分混勻，并將待檢液體全部加入快速檢測卡的加樣孔中，等待8～10 min讀取結(jié)果。

（四）液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法恩諾沙星、四環(huán)素的檢測按照GB 31658.17-2021《食品安全國家標準 動物性食品中四環(huán)素類、磺胺類和喹諾酮類藥物殘留量的測定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》規(guī)定的方法進行，檢出限為2μg/kg，定量限為10 μg/kg。

頭孢氨芐的檢測按照GB 31658.4-2021《食品安全國家標準 動物性食品中頭孢類藥物殘留量的測定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》規(guī)定的方法進行，檢出限為2.0μg/kg，定量限為5.0μg/kg。

（五）靈敏度試驗根據(jù)GB 31650-2019《食品安全國家標準 食品中獸藥最大殘留限量》，恩諾沙星在肉中的殘留限量值為0.1 mg/kg（產(chǎn)蛋期禁用），四環(huán)素在肉中的殘留限量值為0.2 mg/kg；頭孢氨芐在牛肉中的殘留限量值為0.2 mg/kg，在禽肉和其他畜肉中未規(guī)定殘留限量值。本研究根據(jù)恩諾沙星、四環(huán)素、頭孢氨芐在各類肉中的限量標準，對每種肉類均設(shè)置4個加標濃度，即本底濃度（空白）、1/2限量值濃度（或膠體金快速檢測卡標識的檢出限濃度，即若膠體金快速檢測卡標識的檢出限濃度低于限量值濃度則設(shè)定為膠體金快速檢測卡標識的檢出限濃度）、限量值濃度（或膠體金快速檢測卡標識的檢出限濃度）、2倍限量值濃度（或2倍膠體金快速檢測卡標識的檢出限濃度）。除標準中明確限量的肉類品種外，另選幾種市面上常見的肉類作為驗證樣品開展靈敏度試驗。根據(jù)以上原則，經(jīng)過前期試驗摸索，確定了恩諾沙星加標濃度為0、0.05、0.10、0.20 mg/kg；四環(huán)素加標濃度為0、0.04、0.08、0.16 mg/kg；頭孢氨芐加標濃度為0、0.01、0.02、0.04 mg/kg。每份試驗樣品均做3個重復(fù)，每種獸藥各選定7種肉類作為靈敏度試驗樣品。

（六）實物陽性樣品驗證試驗準確稱取恩諾沙星、四環(huán)素和頭孢氨芐標準品，用甲醇溶解，均配置成濃度為10μg/mL的標準溶液，再將標準溶液加入已確認為陰性的肉類樣品中，先用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對樣品中獸藥殘留進行定量檢測，再將樣品稀釋到膠體金快速檢測卡檢出限的0.5、1.0、2.0倍水平，每個水平做10個重復(fù)。

（七）交叉反應(yīng)測試選擇氟苯尼考 （酰胺類）、多西環(huán)素（四環(huán)素類）、地塞米松（糖皮質(zhì)激素）、鏈霉素（氨基糖苷類）、氯霉素（氯霉素類）、紅霉素（大環(huán)內(nèi)酯類）、甲硝唑（硝基咪唑類）、慶大霉素（氨基糖苷類）共8種獸藥開展交叉反應(yīng)測試。將8種獸藥標準品配制成為濃度均為20 μg/mL的混合標準儲備液，再分別稀釋成0.08、0.05、0.02 mg/kg的混合標準溶液，待用。用恩諾沙星、四環(huán)素、頭孢氨芐快速檢測卡分別測試不同濃度的混合標準溶液，觀察是否有交叉反應(yīng)。

（八）結(jié)果評價按照原國家食品藥品監(jiān)督管理總局制定的《食品快速檢測方法評價技術(shù)規(guī)范》，評價膠體金免疫層析法的靈敏度、特異性、假陽性率、假陰性率以及與參比方法的差異性。

二、結(jié)果與分析

（一）靈敏度本研究開展了應(yīng)用膠體金免疫層析法檢測不同肉類基質(zhì)中3種獸藥的靈敏度試驗，結(jié)果顯示恩諾沙星的檢出限均能達到0.05 mg/kg，四環(huán)素的檢出限均能達到0.08 mg/kg，頭孢氨芐的檢出限均能達到0.02 mg/kg，均能滿足日常監(jiān)管要求（見表1～表3）。

表1 膠體金免疫層析法檢測恩諾沙星的靈敏度試驗結(jié)果 （n＝3）

表3 膠體金免疫層析法檢測頭孢氨芐的靈敏度試驗結(jié)果 （n＝3）

（二）假陽性率隨機在市場上抽取7種肉類各3份，用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測確認為陰性后，再用膠體金快速檢測卡進行檢測以驗證其假陽性率。結(jié)果顯示，膠體金免疫層析法檢測恩諾沙星、四環(huán)素和頭孢氨芐的假陽性率均為0%（見表4）。

表4 膠體金免疫層析法檢測恩諾沙星、四環(huán)素和頭孢氨芐的假陽性率 （n＝3）

（三）假陰性率準確稱取恩諾沙星、四環(huán)素和頭孢氨芐標準品，用甲醇溶解，均配置成濃度為10μg/mL的標準溶液，再將標準溶液加入已確認為陰性的肉類樣品中，使其在肉類樣品中的終濃度分別為0.05、0.08、0.02 mg/kg，然后用膠體金快速檢測卡進行加標驗證，結(jié)果見表5。由表5可以看出，膠體金免疫層析法檢測恩諾沙星、四環(huán)素和頭孢氨芐的假陰性率均為0%。

表5 膠體金免疫層析法檢測恩諾沙星、四環(huán)素和頭孢氨芐的假陰性率 （n＝3）

（四）實物陽性樣品驗證實物陽性樣品驗證試驗結(jié)果見表6。如表6所示，實物陽性樣品驗證恩諾沙星、四環(huán)素和頭孢氨芐的假陽性率和假陰性率均為0%，與參比方法均無顯著性差異（χ2＜3.84）。

表2 膠體金免疫層析法檢測四環(huán)素的靈敏度試驗結(jié)果 （n＝3）

表6 恩諾沙星、四環(huán)素和頭孢氨芐的實物陽性樣品的驗證結(jié)果 （n＝10）

（五）交叉反應(yīng)測試用100個恩諾沙星膠體金快速檢測卡測試上文“（七）交叉反應(yīng)測試”中配置的0.05 mg/kg混合標準溶液，結(jié)果均為陰性；用100個四環(huán)素膠體金快速檢測卡測試上文“（七）交叉反應(yīng)測試”中配置的0.08 mg/kg混合標準溶液，結(jié)果均為陰性；用100個頭孢氨芐膠體金快速檢測卡測試上文“（七）交叉反應(yīng)測試”中配置的0.02 mg/kg混合標準溶液，結(jié)果均為陰性。

三、結(jié)論

本研究對膠體金免疫層析法快速檢測肉類中恩諾沙星、四環(huán)素、頭孢氨芐殘留的適用性、準確性等開展應(yīng)用驗證，結(jié)果表明，方法靈敏度較高，檢測肉類基質(zhì)中恩諾沙星、四環(huán)素、頭孢氨芐的檢出限分別為0.05、0.08、0.02 mg/kg，基本能滿足一般基質(zhì)中恩諾沙星、四環(huán)素和頭孢氨芐殘留的檢測要求。此外，方法的檢測結(jié)果與液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法的檢測結(jié)果無顯著性差異，且檢測更快捷，15 min內(nèi)即可完成1件樣品從前處理到讀取結(jié)果的全部檢測工作。

本研究所用的膠體金免疫層析法操作簡便，檢測人員只需稍加培訓(xùn)即可進行檢測操作，適合市場監(jiān)管部門和基層農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)管部門日?？焖俸Y查使用。但該方法目前能檢測的獸藥品種不多，與實際生產(chǎn)的需求還有一定差距，市場上經(jīng)權(quán)威機構(gòu)驗證的產(chǎn)品也很少，需要進一步提高該類產(chǎn)品在生產(chǎn)和基層一線的適用性驗證，以滿足當前我國肉類監(jiān)管的實際需求，實現(xiàn)源頭監(jiān)管的理念。