農(nóng)產(chǎn)品混合樣品中農(nóng)藥殘留的快速篩選定量檢測方法

宋世文 袁娜娜 宋曉儀 張 玲 梁川州 王 瑞

（1.深圳市質(zhì)量安全檢驗(yàn)檢測研究院，廣東深圳 518101；2.深圳市安鑫寶科技發(fā)展有限公司，廣東深圳 518101；3.武漢理工大學(xué)，武漢 430070）

近年來，我國相關(guān)部門因安全監(jiān)管需要對農(nóng)產(chǎn)品中的農(nóng)藥殘留進(jìn)行了大量檢測，這些檢測有3個(gè)特點(diǎn)，分別是樣本檢測數(shù)量大、發(fā)現(xiàn)農(nóng)產(chǎn)品農(nóng)藥殘留超標(biāo)率通常在3%以下以及超標(biāo)率在逐年降低。例如，深圳市2019年對69 065批次食品和農(nóng)產(chǎn)品進(jìn)行了檢測，其中蔬菜水果抽檢數(shù)量約為3萬批次[1]；廣東省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳2021年對2 234批次蔬菜產(chǎn)品開展監(jiān)督抽查，農(nóng)藥殘留超標(biāo)率為2.5%[2]；深圳市寶安區(qū)2016年抽檢種植業(yè)產(chǎn)品768批次，農(nóng)藥殘留超標(biāo)率為3.0%，2019年抽檢682批次，超標(biāo)率為1.6%，2021年抽檢585批次，超標(biāo)率為0.85%。由于實(shí)際農(nóng)產(chǎn)品農(nóng)藥殘留檢測的批次數(shù)量大、超標(biāo)率低，因而需要精確可靠且可高效快速篩選的檢測方法。

目前，農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留的檢測方法主要分兩大類，即常規(guī)檢測方法和快速檢測方法。其中，常規(guī)檢測方法主要是氣相或液相色譜法[3]、氣相或液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[4～7]、毛細(xì)管電泳法[8～11]，這些方法的特點(diǎn)是通量大、靈敏度高、準(zhǔn)確性好，但成本高、檢測時(shí)間長；快速檢測方法包括酶反應(yīng)法、免疫分析法、生物傳感器法、光譜分析法等[12～15]，這些方法普遍存在靈敏度不夠、通量不夠、專一性不強(qiáng)等不足，因此不適合多組分定量檢測。

本文提出的農(nóng)產(chǎn)品混合樣品中農(nóng)藥殘留快速篩選定量檢測方法，將整合兩類方法的優(yōu)點(diǎn)，即將N（N≤10）個(gè)單樣品組成一個(gè)混合樣品，選擇有代表性的108種常見農(nóng)藥，利用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，研究優(yōu)化靈敏度、技術(shù)操作和質(zhì)譜參數(shù)以滿足混合樣品檢測方法要求，以期為農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測提供工作效率更高的技術(shù)方法。

一、方法概述

（一）方法基本定義按一定標(biāo)準(zhǔn)，將樣品制備成有代表性單一種類的樣品，稱其為單樣品；將N個(gè)單樣品等量混合組成1個(gè)混合樣品；N定義為混合樣品包含的單樣品個(gè)數(shù)（N≤10），簡稱包含數(shù)；應(yīng)用快速篩選定量檢測法檢測混合樣品的農(nóng)藥殘留量為初檢；初檢發(fā)現(xiàn)混合樣品有疑似陽性，再對單樣品檢測稱為復(fù)檢。

（二）方法測定過程首先，將單樣品等量混合成混合樣品。然后，應(yīng)用快速篩選定量檢測法檢測混合樣品中的農(nóng)藥殘留量，例如檢測出混合樣品中氯氰菊酯含量為0.005 6 mg/kg，需轉(zhuǎn)換成單樣品結(jié)果進(jìn)行符合性判定，若每個(gè)單樣品氯氰菊酯含量≤0.005 6×Nmg/kg，即每個(gè)單樣品氯氰菊酯含量≤0.056 mg/kg（N＝10）。再應(yīng)用GB 2763-2021《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》[16]來判定單樣品是否疑似陽性，如果疑似陽性，該單樣品需要復(fù)檢，以確認(rèn)是否超標(biāo)，若復(fù)檢單樣品超標(biāo)，則該樣品判定為超標(biāo)；如果沒有疑似陽性，則全部N個(gè)單樣品判定為陰性。

（三）方法檢測效率概念及推演

1.檢測效率概念。檢測效率指一批樣品用單樣品檢測法需要檢測的樣品數(shù)量/混合樣品初次檢測和復(fù)檢樣品總數(shù)量，單樣品檢測法需要檢測的樣品數(shù)量就是N的和。

2.檢測效率推演。如果100個(gè)單樣品、超標(biāo)率假定是3.0%，N取10則可以組成10個(gè)混合樣品。通常方法需要檢測100個(gè)單樣品；而用混合樣品檢測法，初次檢測10個(gè)混合樣品，因超標(biāo)率為3.0%，則最多30個(gè)單樣品疑似陽性，最少是3個(gè)單樣品疑似陽性，所以需復(fù)檢最多30個(gè)單樣品，最少3個(gè)單樣品，即初檢和復(fù)檢樣品總數(shù)是13～40個(gè)，理論檢測效率（超標(biāo)率3.0%情況下）為2.5（100/40）～7.7（100/13）。以上為理論檢測效率計(jì)算，方法的具體檢測效率還需要實(shí)際檢測數(shù)據(jù)驗(yàn)證。

（四）方法必須滿足的技術(shù)條件方法必須滿足的技術(shù)條件主要包括4點(diǎn)。（1）為滿足監(jiān)管工作的需要，方法可檢測的農(nóng)藥殘留對象應(yīng)包括重要的、常見的、常用的、易被檢出的和易檢出超標(biāo)的農(nóng)藥。（2）混合樣品檢測的靈敏度必須足夠高才能滿足單樣品判定的要求，最關(guān)鍵的是定量限須滿足用GB 2763-2021標(biāo)準(zhǔn)來判定單樣品的要求。對多數(shù)高毒劇毒類農(nóng)藥，定量限應(yīng)≤1μg/kg；對甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽，要求比較特別，定量限≤0.7μg/kg；對于其他的農(nóng)藥定量限要求不盡相同，有的≤1μg/kg，有的≤2μg/kg，也有的≤5μg/kg或更高。（3）回收率和精密度等須達(dá)到GB/T 27404-2008《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測》[17]要求?；|(zhì)效應(yīng)適當(dāng)，以保障方法有足夠的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性。（4）方法須有足夠高的檢測效率，通常應(yīng)大于3。

二、材料與方法

（一）主要儀器與設(shè)備超高效液相色譜（UPLC-ACQUITY，美國WATERS公司）；三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀（Triple Quad 5500型，美國AB SCIEX公司）；氮吹儀（N-EVAP 112型，美國Organomation Associates公司）；臺(tái)式高速離心機(jī)（K-30K型，德國SIGMA公司）。

（二）農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品108種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均為1 000 mg/L，由農(nóng)業(yè)農(nóng)村部環(huán)境質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心提供，純度≥95%。依據(jù)農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品的編號(hào)（見表1），分為A（編號(hào)1～35）、B（編號(hào)36～70）和C（編號(hào)71～108）3組。每組分別取標(biāo)準(zhǔn)品配制成20 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于-18℃冰箱中保存，有效期為6個(gè)月。用A、B、C 3組的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制成5 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，于-18℃冰箱中保存，有效期為1個(gè)月。

表1 108種農(nóng)藥化合物的保留時(shí)間、離子對質(zhì)譜參數(shù)和定量限

（三）108種農(nóng)藥組分的確定原則選擇有代表性、經(jīng)常使用、易被檢出的、易被檢出超標(biāo)的農(nóng)藥，以滿足安全監(jiān)管工作需要。目前，國內(nèi)利用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測農(nóng)藥殘留的標(biāo)準(zhǔn)主要有GB 23200.121-2021[6]和GB/T 20769-2008，本方法填補(bǔ)國內(nèi)檢測標(biāo)準(zhǔn)的14項(xiàng)檢測項(xiàng)缺失，其中包括常見菊酯類農(nóng)藥10項(xiàng)，分別是氯氰菊酯、氯氟氰菊酯、氟氯氰菊酯、生物丙烯菊酯、苯醚菊酯、苯醚氰菊酯、丙烯菊酯、甲醚菊酯、炔咪菊酯、氟丙菊酯；其他常見農(nóng)藥4項(xiàng)，分別是甲基對硫磷、克螨特、百菌清、殺螟硫磷。

（四）單樣品及混合樣品制備單樣品制備：取有代表性的蔬菜、水果、食用菌組成的樣品1 kg，先切成小塊，用高速組織粉碎機(jī)充分粉碎，取300 g，冷凍備用。混合樣品制備：將10個(gè)上述備用的單樣品各取30 g，組成1個(gè)混合樣品，再用高速組織粉碎機(jī)充分混勻，冷凍備用。

（五）混合樣品前處理方法稱取20.00 g試樣于80 mL塑料離心管中，加入20 mL乙腈及1顆陶瓷均質(zhì)子，劇烈振蕩1 min，加入4 g無水硫酸鎂、2 g氯化鈉、2 g檸檬酸鈉二水合物、1 g檸檬酸二鈉鹽倍半水合物，再劇烈振蕩3 min后在4 500 r/min條件下離心5 min。定量吸取上清液10 mL至內(nèi)含除水劑和凈化材料的塑料離心管中（每毫升提取液使用150 mg無水硫酸鎂、25 mgN-丙基乙二胺、25 mg C18粉、5 mg石墨化碳黑），以4 500 r/min離心5min，吸取上清液4 mL，氮吹后至近干，用1mL丙酮-水-甲醇溶液（2∶3∶5，體積比）復(fù)溶，過微孔濾膜后待測定。

續(xù)表1

續(xù)表1

（六）超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜條件C18色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.8μm）；流動(dòng)相A為0.1%甲酸鹽水溶液（含5 mmol/L乙酸銨溶液），流動(dòng)相B為0.1%甲酸甲醇溶液（含5 mmol/L乙酸銨溶液）。流動(dòng)相梯度條件為0 min，98%A；0.5 min，98%A；1.0 min，90%A；4.0 min，85%A；4.5 min，60%A；5.5 min，50%A；8.5 min，30%A；9.0 min，5%A；10.0 min，85%A；10.5 min，98%A；12.0 min，98%A。流速為0.3 mL/min；柱溫為40℃；進(jìn)樣量為4～6μL。離子源類型為電噴霧離子源（ESI）；掃描方式為正離子和負(fù)離子同時(shí)掃描；電噴霧電壓為正離子5 500 V、負(fù)離子-4 500 V；離子源溫度為600℃；霧化氣壓力為413.69 kPa；輔助加熱氣壓力為379.21 kPa；氣簾氣壓力為275.79 kPa。優(yōu)化后的108種農(nóng)藥化合物的離子對質(zhì)譜參數(shù)和定量限見表1。

三、結(jié)果與分析

（一）氮吹復(fù)溶溶劑的配比氮吹復(fù)溶溶劑配比優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)V丙酮∶V水∶V甲醇分別為0∶1∶1（配比A）、1∶4∶5（配比B）、2∶3∶5（配比C）、3∶2∶5（配比D）的4種配比條件，做3次重復(fù)，以優(yōu)化丙酮-水-甲醇溶液的比例。用陰性基質(zhì)做回收，各農(nóng)藥加標(biāo)10μg/kg。選擇有代表性的7類農(nóng)藥9種組分的數(shù)據(jù)來考察，結(jié)果見表2。由表2得出，在4種配比條件下，苯并咪唑類殺菌劑多菌靈、新煙堿類殺蟲劑吡蟲啉、氨基甲酸酯類殺蟲劑克百威、有機(jī)磷類殺蟲劑氧樂果和甲拌磷的回收率和精密度均符合GB/T 27404-2008標(biāo)準(zhǔn)的要求，即回收率在60%～120%范圍內(nèi)，變異系數(shù)≤32%；在丙酮量低的配比A、配比B條件下，菊酯類殺蟲劑甲氰菊酯和氯氰菊酯、大環(huán)內(nèi)酯類殺蟲劑甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽的回收率較低，最低達(dá)到0%（氯氰菊酯）；在丙酮量相對高的配比C、配比D條件下，全部20種菊酯類農(nóng)藥的回收率分別為69.5%～118.7%和77.0%～118.6%，其他88種組分的回收率分別為61.5%～114.0%和64.2%～118.8%，回收率和精密度都符合GB/T 27404-2008標(biāo)準(zhǔn)要求。配比C和配比D條件下，108種農(nóng)藥化合物的回收率和精密度沒有明顯差異，因配比C的丙酮量相對較少而水量相對較多，復(fù)溶時(shí)可能會(huì)少溶解一些葉綠素和有機(jī)物質(zhì)，對降低基質(zhì)效應(yīng)有利，因此本文最終選擇V丙酮∶V水∶V甲醇＝2∶3∶5的配比條件。

表2 氮吹復(fù)溶溶劑丙酮-水-甲醇的配比優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果 （%）

（二）方法定量限、線性范圍和相關(guān)系數(shù)在本文條件下，選擇葉綠素含量高的混合基質(zhì)（由甘薯葉、蔥、綠辣椒、綠莧菜、菠菜、韭菜、綠甘藍(lán)、香菜、油麥菜、蕹菜10種單一基質(zhì)組成）、其他色素含量高的混合基質(zhì)（由黃甜椒、紅辣椒、胡蘿卜、紅甜椒、黑木耳、紫甘藍(lán)、橙、南瓜、番茄、西瓜10種單一基質(zhì)組成）、色素含量低的混合基質(zhì)（由大白菜、黃瓜、西葫蘆、小白菜、蓮藕、白蘿卜、冬瓜、香蕉、梨、蘋果10種單一基質(zhì)組成）、食用菌混合基質(zhì)（由香菇、平菇、草菇、金針菇、杏鮑菇、猴頭菇、雞腿菇、鮮銀耳、蟲草花、白蘑菇10種單一基質(zhì)組成）等4種陰性混合基質(zhì)，取一定量的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，配成0、0.5、1.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0μg/L的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液，以儀器響應(yīng)峰面積對各農(nóng)藥化合物的質(zhì)量濃度進(jìn)行線性回歸分析。結(jié)果表明，各農(nóng)藥化合物在0～20.0μg/L的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)大于0.990。同樣取上述4種混合基質(zhì)添加混合標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.5、1.0、5.0μg/kg，得到108種農(nóng)藥組分的定量限（LOQ，信噪比≥10）在0.5～5.0μg/kg范圍內(nèi) （見表1)。 經(jīng)查詢GB 2763-2021標(biāo)準(zhǔn)，本方法的定量限均低于標(biāo)準(zhǔn)中各農(nóng)藥最大殘留限量（MRLs），滿足檢測要求。

（三）基質(zhì)效應(yīng)

1.混合樣品基質(zhì)效應(yīng)分析。本方法在氮吹濃縮的同時(shí)加大了進(jìn)樣體積以提高靈敏度，但基質(zhì)效應(yīng)不可忽視。為此特別設(shè)計(jì)了基質(zhì)效應(yīng)試驗(yàn)，以上述氮吹復(fù)溶溶劑為對照，以葉綠素含量高的、色素含量低的、其他色素含量高的混合基質(zhì)和食用菌混合基質(zhì)為試驗(yàn)組，參照混合樣品操作，添加15 μg/L混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，測定108種農(nóng)藥化合物的峰面積，結(jié)果見表3。

表3 混合樣品基質(zhì)效應(yīng)試驗(yàn)結(jié)果 （%）

以復(fù)溶溶劑中農(nóng)藥化合物的峰面積為100對照分析，結(jié)果顯示，4種混合基質(zhì)中108種農(nóng)藥的平均峰面積明顯降低，只有對照峰面積的53.0%～74.0%；葉綠素含量高的混合基質(zhì)的基質(zhì)效應(yīng)最大，其次為色素含量低的和其他色素含量高的混合基質(zhì)，食用菌混合基質(zhì)最小。以這4種混合基質(zhì)中108種農(nóng)藥的平均峰面積為100進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，從平均值看，4種混合基質(zhì)之間每個(gè)農(nóng)藥組分峰面積差異不明顯（在±25%范圍內(nèi)）；從變化范圍看，在葉綠素含量高的、色素含量低的以及其他色素含量高的混合基質(zhì)中各農(nóng)藥相對峰面積平衡分布在100%上下（在±25%范圍內(nèi)），但食用菌混合基質(zhì)中各農(nóng)藥相對峰面積分布在102.1%～129.2%。

具體應(yīng)用時(shí)，須用與樣品接近的基質(zhì)配制標(biāo)準(zhǔn)溶液，這樣可以盡可能消除基質(zhì)效應(yīng)的影響。如果樣品全部是食用菌混合基質(zhì)，則須用相應(yīng)的食用菌基質(zhì)配制標(biāo)準(zhǔn)溶液。除食用菌混合樣品外，其他樣品的混合基質(zhì)可以通用來配制標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2.混合樣品與單樣品基質(zhì)效應(yīng)的對比分析。除選定上述葉綠素含量高的、色素含量低的、其他色素含量高的混合基質(zhì)和食用菌混合基質(zhì)外，增加一個(gè)不分色素含量高低的混合基質(zhì)，添加15μg/L混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，測定108種農(nóng)藥化合物的峰面積，結(jié)果見表4。以混合基質(zhì)中108種農(nóng)藥化合物的峰面積為100，不分色素含量高低的10種單一基質(zhì)中各組分的相對峰面積在48.5%～203.2%之間，說明單樣品與混合樣品相比，基質(zhì)效應(yīng)明顯。再觀察根據(jù)色素含量分類的其他4類基質(zhì)，108種農(nóng)藥組分的相對峰面積變化范圍在平均值的±30%范圍內(nèi)，可見依據(jù)色素含量分類的混合樣品的基質(zhì)效應(yīng)與單樣品的基質(zhì)效應(yīng)相比較小。實(shí)際應(yīng)用中，按本文依據(jù)色素含量分類混合樣品是一種可行方案，之后試驗(yàn)可對基質(zhì)效應(yīng)作更詳細(xì)的分析研究，以求方法更方便檢測和應(yīng)用。

表4 混合樣品與單樣品基質(zhì)效應(yīng)比較結(jié)果

（四）方法回收率與精密度添加回收試驗(yàn)選擇了上述葉綠素含量高的、色素含量低的、其他色素含量高的混合基質(zhì)和食用菌混合基質(zhì)4類混合基質(zhì)。各類基質(zhì)添加標(biāo)準(zhǔn)溶液在一種單一基質(zhì)中，添加濃度換算成混合樣品中濃度為低濃度0.5～5.0 μg/kg(即定量限）、中濃度10.0μg/kg、高濃度20.0μg/kg。每個(gè)基質(zhì)做6次重復(fù)，每次重復(fù)在不同的單樣品基質(zhì)添加標(biāo)準(zhǔn)溶液（見表5）。

由表5可見，4種混合基質(zhì)中，低濃度加標(biāo)水平下108種農(nóng)藥的回收率在60%～120%范圍內(nèi)，中濃度和高濃度加標(biāo)水平下回收率在80%～110%范圍內(nèi)，符合或優(yōu)于GB 27404-2008標(biāo)準(zhǔn)對檢測方法回收率的要求；低濃度加標(biāo)水平下變異系數(shù)≤20%，中濃度和高濃度加標(biāo)水平下變異系數(shù)＜11%，也完全符合GB 27404-2008標(biāo)準(zhǔn)對檢測方法精密度的要求。

表5 方法回收率和精密度試驗(yàn)結(jié)果

四、結(jié)論

本文提出了基于超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜的農(nóng)產(chǎn)品混合樣品中108種農(nóng)藥殘留快速篩選定量檢測方法，推薦依據(jù)色素含量分類混合樣品。通過對氮吹復(fù)溶溶劑的配比優(yōu)化和方法學(xué)考察，得到選定V丙酮∶V水∶V甲醇＝2∶3∶5為配比條件時(shí)，各組分有較好的回收率；108種農(nóng)藥化合物的定量限在0.5～5.0μg/kg之間，全部低于GB 2763-2021標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的各農(nóng)藥最大殘留限量，符合檢測要求；方法的線性范圍為0～20.0μg/L，相關(guān)系數(shù)大于0.990；低濃度0.5～5.0μg/kg加標(biāo)水平下108種農(nóng)藥化合物的回收率在60%～120%范圍內(nèi)，中濃度10.0μg/kg、高濃度20.0μg/kg加標(biāo)水平下其回收率在80%～110%范圍內(nèi)，低濃度和中高濃度加標(biāo)水平下變異系數(shù)分別≤20%和＜11%，上述指標(biāo)完全符合通用標(biāo)準(zhǔn)GB/T 27404-2008對檢測方法的要求。本方法可以滿足混合樣品中多種農(nóng)藥殘留的實(shí)際檢測工作需要。