基于超快速氣相電子鼻技術(shù)研究中藥香囊放置過(guò)程中的氣味成分變化 Δ

于小聰 ，張禮欣 ，王澤琨 ，束雅春 ，張先林 ，姚毅 ，毛春琴 （.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥學(xué)部，南京 009；.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，南京 003）

中藥香囊是人類(lèi)從古至今都在使用的裝載有芳香類(lèi)中藥的預(yù)防與保健用品，現(xiàn)代香囊使用主要是佩戴于頸部、腰間、胸前、腳踝，亦可置于枕頭內(nèi)或床帳上[1]。辟疫香囊可用于預(yù)防和治療疾病，是應(yīng)用最為廣泛、使用最早的一類(lèi)中藥香囊，也是配方種類(lèi)最多的一種[2―3]。目前有關(guān)中藥香囊的文獻(xiàn)研究主要集中于香囊的藥理作用和臨床效果觀察上[4―9]，而有關(guān)香囊的質(zhì)量控制、氣味研究鮮有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。且隨著放置時(shí)間增加，香囊的揮發(fā)性成分必然會(huì)損失，但揮發(fā)性成分的損失程度與放置時(shí)間的具體關(guān)系尚缺乏研究。因此對(duì)不同放置時(shí)間的中藥香囊進(jìn)行氣味與成分研究可以為其使用時(shí)間提供一定的參考價(jià)值。本實(shí)驗(yàn)所用的上工香囊分為2種，其中兒童型香囊配方為全國(guó)名中醫(yī)汪受傳教授的經(jīng)驗(yàn)方，主要由肉桂、蒼術(shù)、艾葉、山柰等藥材組成；成人型香囊配方為國(guó)醫(yī)大師周仲瑛教授的經(jīng)驗(yàn)方，主要由艾葉、肉桂、蒼術(shù)、石菖蒲、廣藿香、丁香等藥材組成。2種中藥香囊均屬于外用品，對(duì)外感風(fēng)寒引起的感冒、頭疼、咽喉腫痛、嘔吐有一定的預(yù)防和治療功效[10]。

超快速氣相電子鼻是一款將氣相色譜技術(shù)與電子鼻識(shí)別技術(shù)相結(jié)合的仿生系統(tǒng)，其優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)快捷、靈敏度高，可檢測(cè)樣品整體信息形成氣味指紋圖譜，同時(shí)結(jié)合Kovats保留指數(shù)定性庫(kù)，可定性分析氣味成分，現(xiàn)已應(yīng)用于食品、化工、農(nóng)業(yè)等多個(gè)領(lǐng)域[11―19]。揮發(fā)油成分是中藥香囊發(fā)揮藥效的主要物質(zhì)基礎(chǔ)，而目前有關(guān)中藥香囊揮發(fā)性成分的研究尚缺少客觀的量化指標(biāo)。鑒于此，本研究采用Heracles NEO超快速氣相電子鼻技術(shù)獲取中藥香囊的氣味和成分信息，建立氣味信息圖譜，同時(shí)結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法建立判別因子分析模型對(duì)不同放置時(shí)間中藥香囊的氣味特征及成分進(jìn)行分析，以期為其合理開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 主要儀器

Heracles NEO型超快速氣相電子鼻購(gòu)自法國(guó)Alpha MOS公司（配備HS-100型自動(dòng)進(jìn)樣器）；FA1104N型電子天平購(gòu)自上海菁海儀器有限公司；20 mL頂空進(jìn)樣瓶購(gòu)自廣州市鴻洲實(shí)驗(yàn)器材科技有限公司。

1.2 香囊與混合對(duì)照品

兒童型香囊（編號(hào)A1～A15，批號(hào)20171202）和成人型香囊（編號(hào)B1～B15，批號(hào)20180101）均購(gòu)自貴州同德藥業(yè)有限公司；正構(gòu)烷烴（nC6～nC16）混合對(duì)照品（批號(hào)A0142930，每100 g混合物中含有nC6～nC16共0.02～52.27 g）購(gòu)自美國(guó)Restek公司。

2 方法

2.1 樣品前期準(zhǔn)備

將中藥香囊放置在室內(nèi)，室內(nèi)溫度19～26 ℃，濕度55%～70%，放置時(shí)間見(jiàn)表1。

表1 中藥香囊放置時(shí)間

2.2 進(jìn)樣條件考察

本實(shí)驗(yàn)采用頂空進(jìn)樣，為得到良好的分離效果，需要對(duì)檢測(cè)條件進(jìn)行優(yōu)化，以確定最佳檢測(cè)條件。參考相關(guān)文獻(xiàn)[11―12]，通過(guò)氣相色譜圖分析，分別對(duì)進(jìn)樣體積、孵化溫度、孵化時(shí)間進(jìn)行單因素考察。

2.2.1 進(jìn)樣體積考察 精密稱定樣品粉末0.5 g（編號(hào)A1）于頂空進(jìn)樣瓶中，設(shè)置孵化時(shí)間為5 min，振搖溫度為45 ℃，考察進(jìn)樣體積為1 000、2 000、3 000、4 000、5 000 μL時(shí)各色譜圖中色譜峰峰形及色譜峰數(shù)量的變化。結(jié)果顯示，當(dāng)進(jìn)樣體積為4 000 μL時(shí)，各色譜峰峰形穩(wěn)定且色譜峰強(qiáng)度達(dá)到飽和，故確定4 000 μL為最佳進(jìn)樣體積。

2.2.2 孵化溫度考察 精密稱定樣品粉末0.5 g（編號(hào)A1）于頂空進(jìn)樣瓶中，設(shè)置進(jìn)樣體積為4 000 μL，孵化時(shí)間為5 min，考察孵化溫度分別為55、60、65、70、75 ℃時(shí)各色譜圖中色譜峰峰形及色譜峰數(shù)量的變化。結(jié)果顯示，當(dāng)孵化溫度為65 ℃時(shí)，各色譜峰峰形穩(wěn)定且色譜峰強(qiáng)度達(dá)到飽和，故確定65 ℃為最佳孵化溫度。

2.2.3 孵化時(shí)間考察 精密稱定樣品粉末0.5 g（編號(hào)A1）于頂空進(jìn)樣瓶中，設(shè)置進(jìn)樣體積為4 000 μL，孵化溫度為65 ℃，考察孵化時(shí)間分別為5、10、15、20、25 min時(shí)各色譜圖中色譜峰峰形及色譜峰數(shù)量的變化。結(jié)果顯示，當(dāng)孵化時(shí)間為15 min時(shí)，各色譜峰峰形穩(wěn)定且色譜峰強(qiáng)度達(dá)到飽和，故確定15 min為最佳孵化時(shí)間。

2.3 電子鼻檢測(cè)參數(shù)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)考察確定的檢測(cè)條件，使用Heracles NEO型超快速氣相電子鼻對(duì)放置不同時(shí)間的2種香囊進(jìn)行氣味分析。相關(guān)檢測(cè)參數(shù)如下：樣品瓶容積20 mL；樣品量為0.5 g；進(jìn)體積為4 000 μL；孵化溫度為65 ℃；孵化時(shí)間為15 min；注射速度為125 μL/s；注射持續(xù)時(shí)間為37 s；進(jìn)樣口溫度為200 ℃；進(jìn)樣口壓力為10 kPa；捕集阱初始溫度為50 ℃，最終溫度為240 ℃；柱溫初始為50 ℃，采用程序升溫（以1 ℃/s升溫至70 ℃；以2 ℃/s升溫至 90 ℃；以 0.2 ℃/s升溫至 105 ℃；以 5 ℃/s升溫至250 ℃）；采集時(shí)間為136 s；火焰化離子檢測(cè)器增益為12。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度考察 精密稱定樣品粉末0.5 g（編號(hào)A1），共6份，按“2.3”項(xiàng)下條件進(jìn)樣分析。選取峰面積較大且穩(wěn)定的7、8、9號(hào)峰作為特征峰，測(cè)定特征峰的峰面積。結(jié)果顯示，3個(gè)特征峰峰面積的RSD分別為3.5%、1.1%、1.7%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.4.2 重復(fù)性考察 分別取6次樣品粉末0.5 g（編號(hào)A1），精密稱定，按“2.3”項(xiàng)下條件進(jìn)樣分析。選取峰面積較大且穩(wěn)定的7、8、9號(hào)峰作為特征峰，測(cè)定特征峰的峰面積。結(jié)果顯示，3個(gè)特征峰峰面積的RSD分別為2.5%、1.5%、1.5%（n＝6），表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.3 穩(wěn)定性考察 精密稱定樣品粉末0.5 g（編號(hào)A1），共6份，于進(jìn)樣瓶中放置0、2、4、8、12、24 h時(shí)按“2.3”項(xiàng)下條件進(jìn)樣分析。選取峰面積較大且穩(wěn)定的7、8、9號(hào)峰作為特征峰，測(cè)定特征峰的峰面積。結(jié)果顯示，3個(gè)特征峰峰面積的RSD分別為1.7%、0.6%、1.5%（n＝6），表明樣品在進(jìn)樣瓶中24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5 判別因子分析

判別因子分析是一種用于構(gòu)建模型和判定個(gè)體所屬類(lèi)別的統(tǒng)計(jì)方法。與主成分分析相比，其可使不同類(lèi)組群數(shù)據(jù)間差異盡可能擴(kuò)大，而使同類(lèi)組群數(shù)據(jù)間差異盡可能縮小，從而建立更好識(shí)別的數(shù)據(jù)模型，更好地體現(xiàn)出樣品的差異性[11―12]。本研究采用Heracles NEO型超快速氣相電子鼻自帶的Alpha Soft V14.2軟件對(duì)不同放置時(shí)間中藥香囊的色譜圖數(shù)據(jù)進(jìn)行判別因子分析。

3 結(jié)果

3.1 兒童型香囊氣味成分分析結(jié)果

通過(guò)對(duì)兒童型香囊（編號(hào)A1～A15）樣品粉末進(jìn)行分析，得到不同放置時(shí)間樣品的色譜圖，見(jiàn)圖1。由圖1可知，隨著放置時(shí)間的延長(zhǎng)，色譜峰的峰高逐漸降低、數(shù)量逐漸變少，說(shuō)明不同放置時(shí)間兒童型香囊的氣味存在明顯差異。通過(guò)Kovats保留指數(shù)定性分析，并與電子鼻自帶的Arochembase數(shù)據(jù)庫(kù)信息匹配后共鑒定出10種氣味成分，結(jié)果見(jiàn)表2。其中，α-蒎烯（9號(hào)峰）作為天然香料，有著和松木樹(shù)脂類(lèi)似的香氣，具有抗菌、殺菌作用，可以減輕炎癥反應(yīng)、抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、抗病毒等[20―21]；β-蒎烯（10號(hào)峰）同樣具有抑菌、抗腫瘤作用[20―22]。因此，可將α-蒎烯和β-蒎烯作為兒童型香囊的功能性指標(biāo)成分。

表2 兒童型香囊氣味物質(zhì)基礎(chǔ)及感官描述信息

圖1 不同放置時(shí)間兒童型香囊的疊加色譜圖

不同放置時(shí)間下兒童型香囊的氣味信息鏡像對(duì)比圖見(jiàn)圖2。由圖2可知，兒童型香囊放置0.25 d后，有5種氣味成分消失。與放置0 d相比，放置0.25 d后，7號(hào)峰強(qiáng)度下降了45.8%，8號(hào)峰強(qiáng)度下降了21.8%，9號(hào)峰強(qiáng)度下降了14.4%；放置3.5 d后，7號(hào)峰強(qiáng)度下降了90.8%，8號(hào)峰強(qiáng)度下降了70.1%，9號(hào)峰強(qiáng)度下降了50.8%；放置7 d后，大部分氣味成分基本消失，9號(hào)峰強(qiáng)度下降了56.8%；放置30 d后，9號(hào)峰基本消失。

圖2 不同放置時(shí)間兒童型香囊的氣味信息鏡像對(duì)比圖

3.2 成人型香囊氣味成分分析結(jié)果

通過(guò)對(duì)成人型香囊（編號(hào)B1～B15）樣品粉末進(jìn)行分析，得到不同放置時(shí)間樣品的色譜圖，見(jiàn)圖3。由圖3可知，隨著放置時(shí)間的延長(zhǎng)，色譜峰的峰高逐漸降低、數(shù)量逐漸變少。尤其是放置15 d之后，色譜峰的峰高明顯降低。這說(shuō)明不同放置時(shí)間成人型香囊的氣味存在明顯差異。通過(guò)Kovats保留指數(shù)定性分析，再與Arochem‐base數(shù)據(jù)庫(kù)信息匹配后共鑒定出8種氣味成分，詳見(jiàn)表3。其中，α-水芹烯（7號(hào)峰）是一種有薄荷味的天然香料，存在于桉樹(shù)油、小茴香油、肉桂葉油、松節(jié)油等多種揮發(fā)油中，具有抑菌、抗菌活性，可作為祛痰劑[23―25]。因此，可將α-蒎烯和α-水芹烯作為成人型香囊的功能性指標(biāo)成分。

表3 成人型香囊氣味物質(zhì)基礎(chǔ)及感官描述信息

圖3 不同放置時(shí)間成人型香囊的疊加色譜圖

不同放置時(shí)間成人型香囊的氣味信息鏡像對(duì)比圖見(jiàn)圖4。由圖4可知，成人型香囊放置0.25 d后，有4種氣味成分消失；放置15 d后，6～8號(hào)峰消失，5號(hào)峰強(qiáng)度較放置0 d時(shí)下降了34.3%；放置30 d后，9號(hào)峰基本消失。

圖4 不同放置時(shí)間成人型香囊的氣味信息鏡像對(duì)比圖

3.3 2種香囊的判別因子分析結(jié)果

兒童型香囊色譜數(shù)據(jù)的判別因子分析結(jié)果顯示，判別因子1的貢獻(xiàn)率為95.643%，判別因子2的貢獻(xiàn)率為3.582%，累計(jì)貢獻(xiàn)率為99.225%，這說(shuō)明判別因子分析模型可明顯區(qū)分不同放置時(shí)間的兒童型香囊樣品（圖5）。由圖5可知，放置0.25 d的香囊氣味成分與放置0 d的香囊可明顯區(qū)分；從放置3.5 d開(kāi)始，隨著放置時(shí)間的延長(zhǎng)，樣品點(diǎn)聚集，說(shuō)明氣味成分變化越來(lái)越小。結(jié)合色譜圖的分析結(jié)果可知，放置7 d的兒童型香囊的功能性成分已經(jīng)基本揮發(fā)?？梢?jiàn)，判別因子分析結(jié)果與色譜圖分析結(jié)果一致。

圖5 不同放置時(shí)間兒童型香囊樣品判別因子分析圖

成人型香囊色譜數(shù)據(jù)的判別因子分析結(jié)果顯示，判別因子1的貢獻(xiàn)率為66.635%，判別因子2的貢獻(xiàn)率為25.330%，累計(jì)貢獻(xiàn)率為91.965%，這說(shuō)明判別因子分析模型可明顯區(qū)分不同放置時(shí)間的成人型香囊樣品（圖6）。由圖6可知，放置0.25 d的樣品與放置0 d的樣品有明顯區(qū)別。隨著放置時(shí)間的延長(zhǎng)，各樣品點(diǎn)距離放置0 d的樣品點(diǎn)越來(lái)越遠(yuǎn)，說(shuō)明其氣味成分發(fā)生了較大變化。結(jié)合色譜圖的分析結(jié)果可知，放置15 d的成人型香囊的功能性成分已經(jīng)基本揮發(fā)。由此可見(jiàn)，判別因子分析模型分析結(jié)果與色譜分析結(jié)果一致。

圖6 不同放置時(shí)間成人型香囊樣品判別因子分析圖

4 討論

我國(guó)自古以來(lái)就有佩帶中藥香囊預(yù)防疾病的做法。中藥香囊源于傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)“衣冠療法”，通過(guò)口鼻吸入和皮膚、經(jīng)絡(luò)吸收而發(fā)揮避穢濁、防御疾病的功效。其使用歷史悠久，早在殷商甲骨文中即有熏燎、艾蒸和釀制香酒的記載；《山海經(jīng)》曰：“佩之可以已癘”；漢代已有使用香囊進(jìn)行避穢、防御疾病的記載，明清時(shí)期發(fā)展到頂峰。清徐大椿著《神農(nóng)本草經(jīng)百種錄》曰：“香者，氣之正，正氣盛則除邪辟穢也”。至今，民間有“帶個(gè)香草包，不怕五蟲(chóng)害”之風(fēng)俗。佩戴香囊是極具特色的中醫(yī)外治法，目前廣泛用于避邪除穢、調(diào)攝養(yǎng)生和預(yù)防疾病。

目前電子鼻多用于酒、茶、飲料、果蔬、肉制品、油脂等食品領(lǐng)域，以及飲片產(chǎn)地加工炮制等中藥領(lǐng)域。應(yīng)用電子鼻系統(tǒng)代替人類(lèi)的嗅覺(jué)系統(tǒng)，將氣味差異和氣味濃淡這種主觀評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)化成為數(shù)字化的客觀定量描述，能夠反映中藥“整體氣味特征”，符合中藥“整體論”觀點(diǎn)。同時(shí)，電子鼻與其他檢驗(yàn)儀器相比，具有快速、低檢測(cè)限、高靈敏度等優(yōu)點(diǎn)。

根據(jù)本研究色譜圖與判別因子分析結(jié)果可知，兒童型香囊在放置3.5 d后其中的α-蒎烯和β-蒎烯2個(gè)成分峰的強(qiáng)度大幅下降；放置7 d后，大部分成分基本消失。因此，筆者建議兒童型香囊的使用時(shí)間為7 d。成人型香囊在放置15 d后，其中α-蒎烯和α-水芹烯2個(gè)成分峰消失。因此。筆者建議成人型香囊的使用時(shí)間不超過(guò)15 d。不同藥味組成的香囊組方，其放置時(shí)間有所不同，但總體而言，隨著放置時(shí)間的延長(zhǎng)，香囊中芳香揮發(fā)性成分將日益減少，有效性會(huì)逐漸降低。因此，建議消費(fèi)者購(gòu)買(mǎi)香囊以后，使用時(shí)再行拆封、佩戴。若晚間不佩戴時(shí)，用密封袋（盒）盡可能封好，以減少揮發(fā)性成分的損失。此外，香囊的氣味變化還可能與溫濕度有關(guān)，并與香囊的有效期、保質(zhì)期有關(guān)。

綜上所述，隨著放置時(shí)間延長(zhǎng)，2種中藥香囊的氣味成分均在不斷減少；建議兒童型香囊的使用時(shí)間為7 d，成人型香囊的使用時(shí)間為15 d。