相同產(chǎn)地3種龍膽屬植物根及根莖中化學(xué)成分的差異分析 Δ

李睿 ，張瑩瑩 ，劉衛(wèi)紅 ，宋艷秋 ，李龍星 ，李海峰 （1.大理大學(xué)藥學(xué)院，云南 大理 67100；.云南省滇西抗病原植物資源篩選研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 大理 67100；.大理大學(xué)圖書館，云南 大理 67100；.大理大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，云南 大理 67100；.大理大學(xué)分析測(cè)試中心，云南 大理 67100）

龍膽屬植物在全世界約有360種，我國有248種，在全國各地均有分布，且主要集中分布于西南山區(qū)[1]。在云南分布的龍膽屬植物有119種及6個(gè)變種，其中堅(jiān)龍膽Gentiana rigescens Franch.被歷版《中國藥典》所收載，是龍膽藥材的基原植物。堅(jiān)龍膽于1987年就被列入國家重點(diǎn)保護(hù)野生藥材物種，并且由于近年來生態(tài)環(huán)境被破壞（紫莖澤蘭等外來物種入侵）和過度采挖（藥廠需求激增），堅(jiān)龍膽野生資源急劇減少，瀕臨滅絕[2]。因此，尋找堅(jiān)龍膽可替代資源具有重要意義。筆者前期通過調(diào)研及探訪民間草藥醫(yī)生發(fā)現(xiàn)，白族民間將堅(jiān)龍膽G.rigescens Franch.、頭花龍膽 G. cephalantha Franch.和微籽龍膽G. delavayi Franch.這3種主要分布在云南大理的龍膽屬植物統(tǒng)稱為龍膽草，俗稱藍(lán)花根、炮仗花、苦草及青魚膽等，以其根及根莖或全草入藥。

據(jù)報(bào)道，環(huán)烯醚萜類、黃酮類化合物是龍膽藥材的主要活性成分[3―5]，其中的環(huán)烯醚萜類成分具有保肝利膽（龍膽苦苷）[6]、健脾胃（獐牙菜苦苷）[7]、抗炎殺菌（獐牙菜苷）[8]、調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝（苦龍膽酯苷）[9]等功效。本課題組前期采用高效液相色譜（HPLC）法對(duì)不同產(chǎn)地頭花龍膽根及根莖中4種環(huán)烯醚萜類有效成分（龍膽苦苷、獐牙菜苦苷、獐牙菜苷和苦龍膽酯苷）的含量進(jìn)行了測(cè)定，發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地頭花龍膽中4種環(huán)烯醚萜類成分的含量存在差異[10―11]。但考慮到藥用植物的化學(xué)成分組成不僅受遺傳因子的影響，還受氣候、土壤等生態(tài)環(huán)境因子的影響，因此，本課題組以堅(jiān)龍膽為對(duì)照，采用HPLC法對(duì)同一產(chǎn)地3種龍膽屬植物（堅(jiān)龍膽、頭花龍膽、微籽龍膽）根及根莖中上述4種環(huán)烯醚萜類成分進(jìn)行定量分析，同時(shí)借助超高效液相色譜-電噴霧-四極桿飛行時(shí)間高分辨質(zhì)譜聯(lián)用（UPLC-ESI-Q-TOF-MS）技術(shù)對(duì)上述植物根及根莖中的化學(xué)成分進(jìn)行定性分析，并對(duì)質(zhì)荷比（m/z）在50～2 000之間的化學(xué)成分進(jìn)行主成分分析（principal component analysis，PCA），為從龍膽屬植物中挖掘堅(jiān)龍膽可替代資源提供依據(jù)。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用的主要儀器包括Agilent 1200型HPLC儀（美國Agilent公司），Dionex UltiMate 3000型UPLC儀（美國Dionex公司），Compact型質(zhì)譜系統(tǒng)（德國Bruker Daltonics公司），AE240型電子天平（瑞士Mettler Toledo公司），SK5200H型超聲波清洗儀（上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司）。

1.2 主要藥品與試劑

堅(jiān)龍膽、頭花龍膽、微籽龍膽樣品均由本課題組于2020年10月采自云南大理，采集地經(jīng)度為N25°67. 55′、緯度為E99°3. 183′，每個(gè)品種隨機(jī)采集生長年限大致相同且無病蟲害的開花期植株30株，采集植株之間的株距不小于10 m。采集的植株樣品經(jīng)大理大學(xué)藥學(xué)院李海峰教授鑒定為龍膽屬植物堅(jiān)龍膽G. rigescens Franch.、頭花龍膽G.cephalantha Franch.、微籽龍膽G.delavayi Franch.。將采集的植株樣品根及根莖在40 ℃恒溫箱中干燥至恒質(zhì)量。龍膽苦苷對(duì)照品（批號(hào)ZJ0701BA13，純度≥98%）、獐芽菜苦苷對(duì)照品（批號(hào)M29J4S1，純度≥98%）、獐芽菜苷對(duì)照品（批號(hào)PN1125SA13，純度≥98%）、苦龍膽酯苷對(duì)照品（批號(hào)Z06J6S2，純度≥98%）均購自上海源葉生物科技有限公司；甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 供試品溶液 隨機(jī)選取每個(gè)品種的根及根莖質(zhì)量相近的植株10株，混合、粉碎后作為樣品。分別精密稱取粉末0.2 g于10 mL容量瓶中，加入4 mL甲醇，超聲（53 kHz、40 ℃）處理20 min，濾紙過濾，濾渣用4 mL甲醇按上述步驟重復(fù)處理1次；合并2次提取濾液至10 mL容量瓶中，冷卻至室溫，加甲醇定容，混勻。使用前用0.22 μm有機(jī)相微孔濾膜過濾，收集濾液，即得。

2.1.2 混合對(duì)照品溶液 分別精密稱取適量龍膽苦苷、獐牙菜苦苷、獐牙菜苷、苦龍膽酯苷對(duì)照品，加甲醇溶解，制備成上述4種成分質(zhì)量濃度分別為0.200 0、0.050 0、0.005 0、0.005 0 mg/mL的混合溶液，經(jīng)0.22 μm有機(jī)相微孔濾膜過濾，收集濾液，即得。

2.2 3種龍膽屬植物根及根莖中4種環(huán)烯醚萜類成分含量的測(cè)定

2.2.1 HPLC檢測(cè)條件 色譜柱為Eclipse XDB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），以甲醇（A）-水（B）為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫（0～15 min，15%A→35%A；15～40 min，35%A→80%A；40～60 min，80%A→100%A）；流速為1.0 mL/min；柱溫為25 ℃；檢測(cè)波長為274 nm（龍膽苦苷）、243 nm（獐牙菜苦苷、獐牙菜苷及苦龍膽酯苷）；進(jìn)樣量為5 μL。

2.2.2 方法學(xué)考察 按照相關(guān)方法進(jìn)行方法學(xué)考察。專屬性考察結(jié)果顯示，混合對(duì)照品及供試品溶液在相同保留時(shí)間處均有相似的色譜峰，并且特征峰與雜質(zhì)分離良好、無干擾，表明該方法專屬性較好（圖略）。以峰面積（A）對(duì)各成分進(jìn)樣量（x）進(jìn)行線性回歸，得到龍膽苦苷、獐牙菜苦苷、獐牙菜苷、苦龍膽酯苷的回歸方程分別為 A＝800.04x+40.197（R2＝1.000 0）、A＝1 704.3x－57.269（R2＝0.999 7）、A＝3 014.0x+6.815 4（R2＝0.999 8）、A＝1 763.9x+7.483（R2＝0.999 8），線性范圍分別為1.536～15.36、0.050 50～1.010 00、0.001 63～0.081 60、0.001 57～0.078 40 μg。精密度考察結(jié)果顯示，4個(gè)成分對(duì)照品溶液峰面積的RSD分別為0.44%、1.31%、1.20%、1.25%（n＝6），表明儀器精密度良好。重復(fù)性考察結(jié)果顯示，供試品溶液中上述4個(gè)成分含量的RSD分別為2.32%、2.02%、1.91%、2.78%（n＝6），表明重復(fù)性較好。穩(wěn)定性考察結(jié)果顯示，供試品溶液中上述4個(gè)成分峰面積的RSD分別為0.42%、0.49%、1.90%、2.94%（n＝6），表明供試品溶液在室溫放置12 h內(nèi)穩(wěn)定。精密量取適量已知含量的樣品，共9份，分別按已知含量的80%、100%、120%加入龍膽苦苷、獐牙菜苦苷、獐牙菜苷、苦龍膽酯苷對(duì)照品（每個(gè)濃度3份），并依法測(cè)定加樣回收率，結(jié)果80%、100%、120%加樣量樣品的平均加樣回收率分別為 100.9%、98.03%、105.3%、97.70%（RSD 分別為2.51%、1.49%、2.33%、1.28%，n＝9），表明該方法準(zhǔn)確度良好。

2.2.3 含量測(cè)定 取“2.1.1”項(xiàng)下供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下HPLC檢測(cè)條件測(cè)定3種龍膽屬植物中龍膽苦苷、獐牙菜苦苷、獐牙菜苷和苦龍膽酯苷的含量，每個(gè)樣品均做3組平行實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，在頭花龍膽和堅(jiān)龍膽的根及根莖中均檢測(cè)到了上述4種成分，但在微籽龍膽根及根莖中未檢測(cè)到龍膽苦苷。其中，頭花龍膽根及根莖中龍膽苦苷含量與堅(jiān)龍膽根及根莖中含量相近，是2020版《中國藥典》（一部）“堅(jiān)龍膽”項(xiàng)下限量標(biāo)準(zhǔn)（1.50%）的4.42倍；而在微籽龍膽根及根莖中未檢測(cè)到龍膽苦苷，但微籽龍膽根及根莖中獐牙菜苦苷、苦龍膽酯苷的含量分別是堅(jiān)龍膽根及根莖的34.12、8.81倍，是頭花龍膽根及根莖的9.84、7.45倍。結(jié)果見表1。

表1 3種龍膽屬植物根及根莖中4種環(huán)烯醚萜類成分的含量比較（±s，n＝3，%%）

表1 3種龍膽屬植物根及根莖中4種環(huán)烯醚萜類成分的含量比較（±s，n＝3，%%）

－：未檢出

樣品堅(jiān)龍膽頭花龍膽微籽龍膽苦龍膽酯苷0.006 0±0.000 1 0.007 1±0.000 2 0.052 9±0.001 2龍膽苦苷7.863 0±0.020 6 6.626 0±0.632 2－獐牙菜苷0.115 5±0.004 3 0.085 8±0.006 8 0.026 9±0.000 7獐牙菜苦苷0.011 1±0.000 6 0.038 5±0.000 5 0.378 7±0.001 8

2.3 3種龍膽屬植物根及根莖的化學(xué)成分差異分析

運(yùn)用UPLC-ESI-Q-TOF-MS法分析3種龍膽屬植物根及根莖的化學(xué)成分差異。

2.3.1 色譜及質(zhì)譜檢測(cè)條件 采用Dionex-C18（150 mm×2.1 mm，3 μm）色譜柱，以甲醇（A）-水（B）為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫（0～10 min，15%A→27%A；10～20 min，27%A→35%A；20～40 min，35%A→80%A；40～45 min，80%A→100%A）；檢測(cè)波長為 243 nm；柱溫為25 ℃；流速為0.2 mL/min。采用電噴霧離子源（ESI），在正離子模式掃描；毛細(xì)管電壓為4 500 V，霧化器壓力為1.8 bar；干燥氣體為氮?dú)?，干燥氣流速? L/min；干燥溫度為220 ℃；離子源溫度為220 ℃；掃描范圍為m/z 50～2 000；碰撞氣體為氬氣，掃描時(shí)碰撞能量為8 eV；六極桿射頻電壓為70 Vpp，四極桿離子能量為8 eV。準(zhǔn)確質(zhì)量數(shù)用甲酸鈉校正液校正。

2.3.2 樣品檢測(cè)及數(shù)據(jù)處理 取“2.1.1”項(xiàng)下供試品溶液和“2.1.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，分別按“2.3.1”項(xiàng)下檢測(cè)條件進(jìn)樣測(cè)定，分別測(cè)得堅(jiān)龍膽、頭花龍膽、微籽龍膽3種龍膽屬植物的質(zhì)譜數(shù)據(jù)，并將測(cè)得的數(shù)據(jù)用Bruker Compass Data Analysis 4.3軟件進(jìn)行處理。經(jīng)課題組前期研究及查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，環(huán)烯醚萜類和酮類成分在正離子模式下響應(yīng)較好[12―14]，因此本研究選擇正離子掃摸模式，選中質(zhì)譜圖中對(duì)應(yīng)的分子離子峰，即可輸出對(duì)應(yīng)的分子式。結(jié)合對(duì)照品相關(guān)信息、相同類型化合物的裂解規(guī)律[15―17]、文獻(xiàn)報(bào)道的質(zhì)譜數(shù)據(jù)[15―22]進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，并定性分析樣品中的主要活性成分。

2.3.3 結(jié)果分析 經(jīng)分析，從堅(jiān)龍膽、頭花龍膽、微籽龍膽根及根莖中共鑒定出33個(gè)化合物，包括環(huán)烯醚萜類化合物8個(gè)（化合物5、6、7、8、16、18、23、27）酮類化合物8個(gè)（化合物3、4、10、11、24、28、29、33），黃酮類化合物8個(gè)（化合物2、9、12、20、26、30、31、32），生物堿類化合物4個(gè)（化合物14、15、17、21），酚酸類化合物3個(gè)（化合物1、13、19），三萜類化合物1個(gè)（化合物22），苯甲酸酯類化合物1個(gè)（化合物25）。3種龍膽屬植物根及根莖中有8個(gè)共有成分（化合物1～8），主要為環(huán)烯醚萜類化合物；堅(jiān)龍膽與頭花龍膽根及根莖中有17個(gè)共有化合物（化合物1～17），主要為環(huán)烯醚萜類和酮類化合物；堅(jiān)龍膽與微籽龍膽根及根莖中有9個(gè)共有化合物（化合物1～8、化合物20），主要為環(huán)烯醚萜類化合物。有4個(gè)化合物（化合物26～29）僅在堅(jiān)龍膽根及根莖中鑒定出，為環(huán)烯醚萜類和酮類化合物；有5個(gè)化合物（化合物21～25）僅在頭花龍膽根及根莖中鑒定出，其中化合物22（三萜類化合物）和化合物25（苯甲酸酯類化合物）為頭花龍膽根及根莖中特有成分；有4個(gè)化合物（化合物30～33）僅在微籽龍膽根及根莖中鑒定出，均為黃酮類化合物。3種龍膽屬植物的UPLC-ESI-Q-TOF-MS基峰色譜圖（base peak chromatogram，BPC）見圖1，化學(xué)成分鑒定結(jié)果如表2。

表2 3種龍膽屬植物的化學(xué)成分鑒定結(jié)果

圖1 3種龍膽屬植物的BPC

2.4 3種龍膽屬植物根及根莖的PCA

將“2.3.1”下測(cè)得的3種龍膽屬植物根及根莖的液質(zhì)數(shù)據(jù)導(dǎo)入Bruker Compass ProfilAnalysis 2.2軟件進(jìn)行PCA，結(jié)果見圖2。結(jié)果顯示，堅(jiān)龍膽及頭花龍膽的主成分在空間分布較聚集，差異較小；微籽龍膽與其他2種植物的主成分空間分布較遠(yuǎn)，存在較大差異。進(jìn)一步對(duì)3種龍膽屬植物根及根莖的主要差異峰進(jìn)行分析，結(jié)果見圖3。結(jié)果顯示，在PCA模式下3種龍膽屬植物中m/z 50～2 000的主成分分布較聚集，但在以下幾個(gè)峰存在差異：色譜峰46.52 min、m/z 701.500 0對(duì)應(yīng)點(diǎn)離中心距離最遠(yuǎn)，37.52 min、m/z 717.500 0次之，這2個(gè)點(diǎn)對(duì)差異的貢獻(xiàn)率最大。進(jìn)一步檢索SDBS及ChemSpider等數(shù)據(jù)庫對(duì)這2個(gè)差異峰進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，這2個(gè)差異化合物均為三萜類化合物，且該化合物僅存在于堅(jiān)龍膽的根及根莖中。其次，32.52 min、m/z 701.500 0，1.52 min、 m/z 543.500 0，46.52 min、m/z 814.500 0，35.52 min、m/z 814.500 0，45.52 min、m/z 814.500 0，34.52 min、m/z 814.500 0，34.52 min、m/z 701.500 0，1.52 min、m/z 229.500 0等10個(gè)點(diǎn)和中心也有一定距離，差異也較大。進(jìn)一步檢索上述數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)這些差異化合物主要為脂肪族化合物和氨基酸。

圖2 3種龍膽屬植物根及根莖的PCA結(jié)果

圖3 3種龍膽屬植物根及根莖主要差異峰分析

3 討論

3.1 4種定量分析指標(biāo)的選擇

有許多含有龍膽藥材的傳統(tǒng)中藥方劑都有很好的治療肝膽脾胃的作用，如出自宋代《太平惠民和劑局方》的中藥制劑龍膽瀉肝湯等。龍膽屬植物主要藥效成分為環(huán)烯醚萜類化合物，其中以龍膽苦苷為代表，其是龍膽藥材的質(zhì)量控制指標(biāo)性成分。此外，獐牙菜苦苷作為日本當(dāng)藥的主要活性成分，具有很好的健胃功效[7]；Wang等[8]研究發(fā)現(xiàn)，在治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的藏藥翼首草中起抗炎作用的主要活性成分可能是獐牙菜苷；Potunuru等[9]研究發(fā)現(xiàn)，口服苦龍膽酯苷可以減弱糖尿病介導(dǎo)的新生內(nèi)膜增厚以及脂質(zhì)在主動(dòng)脈內(nèi)膜的沉積，從而降低動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。因此，本研究采用HPLC法測(cè)定了上述4種環(huán)烯醚萜類成分含量。

3.2 頭花龍膽和堅(jiān)龍膽中化學(xué)成分的差異分析

經(jīng)HPLC分析，在堅(jiān)龍膽、頭花龍膽中均可檢測(cè)到上述4種成分，且龍膽苦苷含量均達(dá)到2020年版《中國藥典》（一部）“堅(jiān)龍膽”項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)含量限度的4倍以上，這提示頭花龍膽具有替代堅(jiān)龍膽的可能性。通過UPLC-ESIQ-TOF-MS技術(shù)從堅(jiān)龍膽和頭花龍膽根及根莖中共鑒定出17個(gè)共有化合物，主要為酮類和環(huán)烯醚萜類成分。另外，苯甲酸酯類化合物苯甲酸酯B和三萜類化合物3β-Urs-12-en-3-yl palmitate為頭花龍膽所特有。近年來，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，苯甲酸酯類化合物對(duì)阿爾茨海默病有治療作用[23]。經(jīng)PCA發(fā)現(xiàn)，頭花龍膽和堅(jiān)龍膽的主成分空間分布聚集在一起，表明頭花龍膽和堅(jiān)龍膽的根及根莖主成分差異較小，這進(jìn)一步驗(yàn)證了頭花龍膽的可替代性。

3.3 微籽龍膽與堅(jiān)龍膽根及根莖中化學(xué)成分的差異分析

經(jīng)HPLC分析，微籽龍膽中未檢測(cè)到龍膽苦苷，但可以檢測(cè)到獐牙菜苦苷、獐牙菜苷和苦龍膽酯苷3種成分，其中獐牙菜苷、苦龍膽酯苷的含量高于堅(jiān)龍膽。通過UPLC-ESI-Q-TOF-MS技術(shù)定性分析，在微籽龍膽根及根莖中鑒定出15個(gè)化合物，其中有9個(gè)化合物也同時(shí)在堅(jiān)龍膽中被鑒定出，這9個(gè)共有化合物主要為環(huán)烯醚萜類成分，并且龍膽藥材的主要活性成分龍膽苦苷也在微籽龍膽中被檢測(cè)出。此外，有4種化合物僅在微籽龍膽根中被鑒定出，主要為黃酮類成分，分別是葛根素、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷、hypolaetin-8-O-β-D-glucoside和酮（3個(gè)羥基，2個(gè)甲氧基）。黃酮類成分具有較好的抗炎、抗氧化活性[16]，由此推測(cè)微籽龍膽可能比堅(jiān)龍膽具有更好的健胃抗炎等藥理作用。經(jīng)PCA發(fā)現(xiàn)，微籽龍膽根及根莖的主成分空間分布與堅(jiān)龍膽分布在不同區(qū)域，距離較遠(yuǎn)，表明微籽龍膽與堅(jiān)龍膽主成分差異較大。這與含量分析結(jié)果相符，進(jìn)一步證明了微籽龍膽與堅(jiān)龍膽的根及根莖存在差異。

綜上所述，同一產(chǎn)地堅(jiān)龍膽與頭花龍膽根及根莖中4種主要活性成分含量差異較小，但微籽龍膽與堅(jiān)龍膽根及根莖的4種主要活性成分含量差異較大。三者化學(xué)成分組成也存在差異，堅(jiān)龍膽和頭花龍膽根及根莖中主要為環(huán)烯醚萜類和酮類成分，而微籽龍膽根及根莖中主要含有環(huán)烯醚萜類和黃酮類成分。因此，微籽龍膽不能代替堅(jiān)龍膽入藥。而頭花龍膽與堅(jiān)龍膽的根及根莖中化學(xué)成分差異較小，替代后者入藥的可能性較大，但仍需通過藥理實(shí)驗(yàn)加以驗(yàn)證。