甘麥大棗復合飲料制備工藝及其抗疲勞功能研究

楊娜娜，吳迪，胡揚，韓曉宇，劉樹森，孫文斌，綦崢，姚辛敏，徐蓓蕾※

（1.哈爾濱商業(yè)大學藥學院，黑龍江 哈爾濱 150076；2.北京雙鷺藥業(yè)有限公司 北京 100043；3.黑龍江中醫(yī)藥大學，黑龍江 哈爾濱 150076）

疲勞是指當達到一定運動強度時，機體功能下降的一種狀態(tài)[1]，常伴隨著失眠、抑郁和注意力無法集中等癥狀[2]，近年來，抗疲勞產(chǎn)品開發(fā)已成為新的研究熱點之一[3]。本研究旨在針對現(xiàn)代人群開發(fā)出的一款風味天然、成分健康及口感醇香的抗疲勞飲料。

甘麥大棗飲出自于《金匱要略》，處方比例為甘草150 g、大棗10枚、浮小麥1 L[4]，具有養(yǎng)神安神、益脾保肝和緩解疲勞之效[5]。方劑組成簡單，且皆為藥食同源類中藥，能夠治療精神恍惚、抑郁，還可理氣解憂、改善情緒和睡眠不安?，F(xiàn)代研究表明，該方劑常被用于抑郁癥、睡眠障礙、阿爾茨海默病及腸易激綜合征的治療[6-11]。故本研究以此方為基礎，優(yōu)化甘麥大棗藥液提取工藝及其復合飲料的制備工藝，并對其抗疲勞、緩解抑郁功能進行研究。

1 材料與方法

1.1 實驗材料及試劑

甘草、浮小麥購買自安寧大藥房，經(jīng)哈爾濱商業(yè)大學藥學院金哲雄教授鑒定為豆科植物甘草（Glycyrrhizae uralensis Fisch.）的干燥根和根莖；浮小麥為禾本科植物小麥（Triticum aestivum L.）的干燥輕浮果實；大棗購買于家樂福超市，經(jīng)哈爾濱商業(yè)大學藥學院金哲雄教授鑒定為鼠李科植物棗（Ziziphus zizyphus）的成熟果實。娃哈哈純凈水購買自杭州娃哈哈集團有限公司；山梨酸鉀（分析純，批號：20170118）購買于天津市光復精細化工研究所；白砂糖購買于匯源公司。

1.2 實驗動物

ICR小鼠150只，體重30~40 g，雌雄各半，購買自黑龍江省佳木斯市多多藥業(yè)（批號：S0567）。

1.3 實驗儀器

DHG-9140A電熱恒溫鼓風干燥箱（上海-恒科技有限公司）；Leica（HI1210）水浴鍋；ISO9001分析天平（北京賽多利斯天平有限公司）；LMS-2B型二道生理記錄儀（北京儀器廠）；JZ-180手動界面張力儀（濟南艾克斯工業(yè)測試系統(tǒng)有限公司）；WB35F型數(shù)碼相機（三星公司）；DT001型電子體溫計（倍爾康公司）；LD3100-1型天平（金鉆計量儀器銷售部），PHS-25酸度計（上海雷磁），LDZH-150L高溫滅菌鍋（上海申安醫(yī)療器械）。

2 實驗方法與結(jié)果

2.1 工藝流程

取預處理后大棗、甘草、浮小麥按照比例混合→清洗、干燥、破碎→混合均勻→甘麥大棗藥液提取→過濾→藥液稀釋→復合飲料調(diào)配→包裝、滅菌→冷卻→成品。

2.2 技術要點

準確稱取原料，通過單因素試驗及正交試驗確定原料提取工藝，過濾藥液，再通過單因素試驗及正交試驗確定藥液稀釋倍數(shù)、甜味劑、酸味劑及防腐劑添加量，將藥液用純凈水稀釋至相應倍數(shù)，向稀釋后的藥液中依序加入甜味劑及防腐劑，充分攪拌，確保攪拌均勻。過濾，得到顏色均勻澄清的橘黃色飲料，采用高溫滅菌鍋滅菌，趁熱裝罐，冷卻至室溫，檢測其穩(wěn)定性。

2.3 甘草、大棗和小麥的預處理

挑選無雜質(zhì)、無霉變的甘草，清洗，60℃烘干后放入研缽中，破碎至2~4mm的甘草片段，精密稱量6.8g。

挑選無雜質(zhì)、無霉變和無蟲蛀的圓潤碩大的大棗原料10枚清洗（約20 g），60℃烘干后去核放入到研缽中，破碎，破碎程度同甘草。

挑選無雜質(zhì)、無霉變的浮小麥原料，清洗，60℃烘干后放入到研缽中，破碎，破碎程度同甘草。精密稱量11.3 g。

2.4 甘麥大棗藥液提取工藝優(yōu)化

2.4.1 提取時間、提取溫度、提取次數(shù)及加水量的選擇精密稱取預處理后原料，混合均勻。提取條件為60℃下回流提取80 min（溫控水浴鍋調(diào)節(jié)藥液提取溫度），提取1次。依次考察提取時間、提取溫度、提取次數(shù)及加水量對甘麥大棗藥液出膏率及感官評分影響?？疾煲蛩丶八揭姳?。

表1 甘麥大棗藥液提取單因素水平考察表Table 1 Investigation table of extraction factor level of Ganmai Jujube liquid medicine

2.4.2正交試驗考察提取時間、提取次數(shù)以及提取溫度對感官評分的影響根據(jù)單因素試驗結(jié)果，將影響甘麥大棗藥液提取主要因素提取次數(shù)設為A（1次、2次和3次）、提取時間設為B（30 min、60 min和90 min）、提取溫度設為C（60℃、80℃和100℃）、加水量設為D（300 mL、400 mL和500 mL），采用L9（34）正交試驗優(yōu)化甘麥大棗藥液最佳提取工藝。正交試驗因素水平設計見表2。

表2 甘麥大棗藥液提取正交試驗因素水平考察表Table 2 Investigation table of orthogonal experimental factors for the extraction of Ganmai Jujube liquid medicine

2.5 甘麥大棗復合飲料制備工藝研究

2.5.1 藥液稀釋倍數(shù)、甜味劑添加量、防腐劑添加量的選擇根據(jù)甘麥大棗藥液最佳提取工藝優(yōu)化結(jié)果進一步篩選甘麥大棗復合飲料制備工藝，考察藥液稀釋倍數(shù)、甜味劑添加量及防腐劑添加量對甘麥大棗復合飲料感官評分影響，單因素試驗考察因素水平見表3。

表3 甘麥大棗復合飲料制備單因素水平考察表Table 3 Investigation table of the single factor level in the preparation of Ganmai Jujube compound beverage

2.5.2 正交試驗考察最佳稀釋倍數(shù)以及輔料添加量根據(jù)單因素試驗結(jié)果，將甘麥大棗復合飲料制備工藝主要影響因素藥液稀釋倍數(shù)設為E（2倍、5倍和10倍），甜味劑添加量設為F（2%、3%和4%），防腐劑添加量設為G（0.1%、0.2%和0.3%），采用L9（34）正交試驗優(yōu)化甘麥大棗復合飲料制備工藝。正交試驗因素水平設計見表4。

表4 甘麥大棗復合飲料制備正交試驗因素水平考察表Table 4 Investigation table of orthogonal experimental factors for the preparation of the compound beverage of sweet wheat and jujube

2.5.3 感官評定標準感官評定由12人組成，從飲料外觀性狀、氣味、色澤及滋味4方面進行感官評分，評分標準見表5，評分均值為感官評定的最終得分。

表5 感官評分標準Table 5 Sensory scoring standard

2.5.4 飲料穩(wěn)定性測試觀察甘麥大棗復合飲料50 d內(nèi)外觀性狀變化，并每隔5 d測定其pH，評價其穩(wěn)定性。

2.6 甘麥大棗復合飲料抗疲勞及抗抑郁研究

2.6.1 甘麥大棗復合飲料制備根據(jù)“2.4.1”及“2.4.2”實驗結(jié)果制備甘麥大棗復合飲料，平行制備3組，設置1 g/kg、0.5 g/kg和0.25 g/kg 3個濃度組。

2.6.2 動物分組及給藥將150只小鼠隨機分為空白對照組、百憂解對照組、甘麥大棗飲高濃度組（1g/kg）、甘麥大棗飲中濃度組（0.5 g/kg）和甘麥大棗飲低濃度組（0.25 g/kg），每組30只小鼠?？瞻讓φ战M小鼠灌胃給予純凈水；百憂解對照組小鼠灌胃給予百憂解；甘麥大棗飲料組分別灌胃給予高、中、低濃度的甘麥大棗飲料，灌胃劑量均為10 mL/（kg d），2次/d，連續(xù)5 d。在末次灌胃1 h后進行試驗。

2.6.3 小鼠懸尾試驗在離小鼠尾尖部大概1cm處用膠貼上絲線一端，絲線另一端連接二導記錄儀的張力換能器，小鼠頭部離臺面約7 cm，保持室內(nèi)溫度恒定（25±1）℃。懸掛總時長為6 min，用二導記錄儀記錄2 min后小鼠累積不動時間。

2.6.4 小鼠強迫游泳試驗將小鼠放入高135 cm、直徑30cm的裝滿水的塑料桶內(nèi)，保持水溫恒定（24±1）℃，用數(shù)碼相機記錄下小鼠游泳的過程，總共6 min，記錄2 min后小鼠累積不動時間。小鼠不再掙扎或漂浮于水面上，四肢輕微動作以保持頭部能露出水面即可記錄為不動時間。

2.6.5 拮抗利血平試驗對小鼠腹腔注射利血平4 mg/kg，記錄小鼠肛溫、眼瞼下垂率及小鼠出圈率。肛溫：注射利血平4 h后，將電子體溫計插入小鼠肛門內(nèi)約1 cm左右，測量其肛溫，記錄溫度，比較不同組之間肛溫的差異。眼瞼下垂：注射利血平1 h后，觀察小鼠眼瞼，并記錄眼瞼下垂個數(shù)，計算百分率（%）。出圈率：腹腔注射利血平1 h后，把小鼠放在直徑8cm的圓圈內(nèi)觀察15 s，并記錄各組的出圈小鼠數(shù)量，計算出圈率。

2.7 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計分析，所有數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為表示差異具有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 甘麥大棗提取工藝單因素考察結(jié)果

3.1.1 提取時間、提取溫度、提取次數(shù)及加水量對甘麥大棗藥液感官評分影響提取時間、提取溫度、提取次數(shù)及加水量對甘麥大棗藥液感官評分與出膏率影響分別見圖1~4、圖5~8，結(jié)果表明，當提取時間為60 min、提取溫度為80℃、提取次數(shù)為3、加水量為300 mL時，甘麥大棗藥液感官評分分別為76、78、88和83，出膏率分別為12.5%、11.8%、12.1%和10%。

圖1 提取時間對甘麥大棗藥液感官評分的影響Fig.1 Effect of the extraction time on the sensory score

圖5 不同提取時間對甘麥大棗藥液出膏率的影響Fig.5 Effect of the different extraction time on the extraction rate of Ganmai Jujube liquid medicine

圖2 提取溫度對對甘麥大棗藥液感官評分的影響Fig.2 Effect of the extraction temperature on sensory score

圖3 提取次數(shù)對對甘麥大棗藥液感官評分的影響Fig.3 Effect of the extraction time on sensory score

圖4 加水量對甘麥大棗藥液感官評分的影響Fig.4 Effect of the water addition on the sensory score of Ganmai Jujube liquid medicine

圖6 不同提取溫度對甘麥大棗藥液出膏的影響Fig.6 Effect of the different extraction temperature on the paste extraction of Ganmai Jujube liquid medicine

圖7 不同提取次數(shù)對甘麥大棗藥液出膏率的影響Fig.7 Effect of the different extraction time on the paste yield of Ganmai Jujube liquid medicine.

圖8 不同加水量對甘麥大棗藥液出膏率影響Fig.8 Effect of the different water addition on the paste yield of Ganmai Jujube liquid medicine

3.1.2正交試驗考察提取因素結(jié)果由表6和表7可知，影響出膏率4個因素的主次關系為A＞B＞C＞D，影響感官評分4個因素主次關系為D＞B＞A＞C，比較了K1，K2，K3及k1、k2、k3值，綜合兩個正交試驗結(jié)果及試驗成本，確定甘麥大棗藥液的提取優(yōu)選工藝為A3B2C1D1，即加入300 mL水，60℃提取3次，每次60 min。

表6 甘麥大棗藥液提取工藝正交試驗結(jié)果Table 6 Orthogonal experimental results of the extraction technology of Ganmai Jujube liquid medicine

表7 提取工藝正交試驗方差分析結(jié)果Table 7 Results of the variance analysis of the orthogonal test of the extraction process

3.2 甘麥大棗復合飲料制備工藝

3.2.1 單因素試驗結(jié)果在確定甘麥大棗藥液最佳提取工藝基礎上進一步通過單因素試驗及正交試驗優(yōu)化其制備工藝，對其最佳稀釋倍數(shù)、甜味劑添加量及防腐劑添加量進行考察，結(jié)果見圖9~11。結(jié)果表明，當藥液稀釋5倍、甜味劑添加量為3%、防腐劑添加量為0.2%時，甘麥大棗復合飲料顏色澄清均勻，味道酸甜可口，具有甘麥大棗的天然香氣，沉淀周期適中，且沉淀物少。

圖9 藥液稀釋倍數(shù)對甘麥大棗復合飲料感官評分影響Fig.9 Effect of the dilution ratio of the liquid medicine on the sensory score of Ganmai Jujube compound beverage

圖10 甜味劑添加量對甘麥大棗復合飲料感官評分影響Fig.10 Effect of the sweetener addition on the sensory score of Ganmai Jujube compound beverage

圖11 防腐劑添加量對甘麥大棗復合飲料感官評分影響Fig.11 Effect of the preservative addition on the sensory score of Ganmai Jujube compound beverage

3.2.2 酸味劑添加量選擇的結(jié)果由于藥液中帶有大棗的原始酸味，在藥液中添加不同含量的酸味劑，經(jīng)過感官評分，對飲料未造成明顯影響，所以本次試驗希望保留原料的天然風味，暫不添加酸味劑。

3.2.3 甘麥大棗復合飲料制備工藝正交試驗結(jié)果根據(jù)甘麥大棗復合飲料制備工藝單因素考察結(jié)果，進一步進行正交試驗。正交試驗及方差分析結(jié)果見表8和表9，結(jié)果表明甘麥大棗復合飲料最佳制備工藝為A2B2C1，即藥液稀釋倍數(shù)為5，甜味劑添加量為3%，防腐劑添加量為0.1%。由數(shù)據(jù)可知，影響感官評分的3個因素主次關系為A＞B＞C，即藥液稀釋倍數(shù)對飲料的感官評分具有顯著性影響。

表8 甘麥大棗復合飲料制備工藝正交試驗結(jié)果Table 8 Orthogonal test results of the preparation technology of the compound beverage of sweet wheat and jujube

表9 甘麥大棗復合飲料制備工藝正交試驗方差分析結(jié)果Table 9 Results of ANOVA of the orthogonal Test on the preparation technology of Ganmai Jujube Compound Beverage

3.3 穩(wěn)定性實驗的結(jié)果

根據(jù)實驗篩選出最佳制備工藝制成甘麥大棗復合飲料，測定其pH為6.23，且口感醇香，具有甘草、小麥和大棗的天然風味，酸甜適中，飲料呈均勻澄清的橘黃色。

50 d內(nèi)每隔5 d測定其pH分別為6.14、6.35、6.22、6.19、6.05、6.28、6.37、6.22、6.08、6.23和6.12，且飲料無異味，無沉淀及懸浮物出現(xiàn)，色澤穩(wěn)定無明顯變化，證明該制備工藝制得的甘麥大棗復合飲料穩(wěn)定性良好。

3.4 甘麥大棗復合飲料抗疲勞及抗抑郁作用研究

3.4.1 小鼠懸尾實驗及強迫游泳實驗結(jié)果小鼠懸尾實驗及強迫游泳實驗結(jié)果見表10和圖12。實驗結(jié)果表明，甘麥大棗復合飲料能夠減少小鼠懸尾不動時間及游泳累積不動時間，均具有顯著性差異，說明甘麥大棗復合飲料能夠起到一定的抗疲勞作用。

表10 小鼠懸尾實驗及強迫游泳實驗（±）Table 10 Results of the mouse tail suspension experiment and the forced swimming experiment（ ±）

圖12 小鼠懸尾不動時間及小鼠游泳累計不動時間Fig.12 Immobility time of the mouse tail suspension and the accumulative immobility time of the mouse swimming

3.4.2拮抗利血平試驗的結(jié)果甘麥大棗飲料能夠顯著提高小鼠肛溫及小鼠出圈率，降低利血平導致的小鼠眼瞼下垂率。結(jié)果見表11和圖13。

表11 小鼠肛溫、眼瞼下垂率及出圈率（±）Table 11 Anal temperature,blepharoptosis rate and out-of-loop rate of mice(±)

圖13 甘麥大棗復合飲料拮抗利血平實驗Fig.13 Experiment on the ntagonistic ffect of Ganmai Jujube ompound everage on eserpine

4 討論

有研究表明，利血平可導致抑郁——一種中樞神經(jīng)的不良反應[12]，作為治療輕中度高血壓的安定藥，利血平作用效果緩慢，持續(xù)作用時間較長，能夠消耗周圍交感神經(jīng)末梢的腎上腺素，抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)，是一種阻斷性抗高血壓藥。其能夠產(chǎn)生鎮(zhèn)靜作用，但不會導致動物嗜睡及麻醉。低劑量注射后會導致動物出現(xiàn)眼瞼下垂、瞳孔縮小及體溫下降等抑郁癥狀，能夠誘導動物抑郁模型，具有造模時間短、操作簡便等優(yōu)點。百憂解又名氟西汀[13]，其作為選擇性5-羥色胺再攝取抑制劑（selectiveserotoninreuptakeinhibitor,SSRIs）的代表藥物[14]，目前已有大量研究證明其對抑郁癥具有良好治療作用[15-17]，故本研究選取百憂解作為對照藥物，采用注射低劑量利血平誘導小鼠抑郁模型，并通過懸尾實驗和強迫游泳實驗建立壓迫環(huán)境，使動物無法回避，產(chǎn)生“絕望扭曲行為”[18-20]，即不動狀態(tài)，提高小鼠對抗抑郁藥物敏感狀態(tài)。該方法常用于抗疲勞、抗抑郁類研究。從實驗結(jié)果中可看出，甘麥大棗飲料可以有效地縮短小鼠懸尾不動時間及小鼠游泳不動時間，使注射利血平組的小鼠肛溫上升、眼瞼下垂率降低及小鼠出圈率上升，說明甘麥大棗飲料具有一定的抗疲勞及緩解抑郁作用。

甘麥大棗湯方劑組成簡單，且皆為藥食同源類中藥，現(xiàn)代研究表明，甘麥大棗湯具有寧心安神，緩急調(diào)脾之效[21]，其加減方常用于抑郁癥治療[22]。隨著現(xiàn)代生活節(jié)奏加快，抑郁癥患病率逐年上升[23]，患者常伴有疲勞、長時間情緒低落及情感障礙等癥狀，已經(jīng)嚴重危害人們的身心健康，而甘麥大棗湯中浮小麥能夠養(yǎng)心護肝，配以甘草和中緩急、大棗益心脾，既可補養(yǎng)心脾之虛，又可緩肝之急。目前對甘麥大棗湯的研究主要集中于其抗抑郁機制，并未見有相關保健飲料報道。本研究在確定甘麥大棗復合飲料制備工藝基礎上，進一步研究該飲料抗疲勞、緩解抑郁功能。實驗結(jié)果表明，甘麥大棗復合飲料制備工藝簡單，風味天然，且具有一定的抗疲勞和緩解抑郁功能，為甘麥大棗湯的進一步開發(fā)利用提供了新思路。