藥用植物種子貯藏的研究進(jìn)展

隋昕，姜業(yè)成，于海嬌，邢麗偉，郭靖，于營※

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，吉林 長春 130112；2.吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院資源與環(huán)境研究所，吉林 長春 130112；3.吉林省知識產(chǎn)權(quán)保護(hù)中心，吉林 長春 130000；4.呼倫貝爾市海拉爾區(qū)農(nóng)牧技術(shù)推廣中心，內(nèi)蒙古 呼倫貝爾 021000）

隨著藥用植物的市場需求不斷擴(kuò)大及種植技術(shù)的成熟，人工種植藥用植物的面積不斷擴(kuò)大，藥用植物種子的需求也隨之增加。種子是藥用植物新品種選育和發(fā)展農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的物質(zhì)基礎(chǔ)，也是進(jìn)行藥用植物生物學(xué)研究和種質(zhì)保存的重要材料。作為一種繁殖器官，種子在藥用植物的繁衍中起著重要作用。同時，種子作為重要的種質(zhì)資源，積累了由自然演化的遺傳性狀及人工引起的遺傳變異。藥用植物種子貯藏期間的劣變對種子活力有很大影響，現(xiàn)對貯藏時影響藥用植物種子壽命的多種因素、貯藏過程中種子的一系列變化以及種子的貯藏方法等方面進(jìn)行綜述，為延長藥用植物種子貯藏期限以及藥用植物種子的貯藏安全提供參考。

1 貯藏條件對藥用植物種子活力的影響

1.1 環(huán)境因素

1.1.1 貯藏濕度在種子貯藏時，環(huán)境濕度過高易導(dǎo)致細(xì)菌滋生，種子會發(fā)生霉變；同時也會引起種子含水量升高而發(fā)生一系列代謝反應(yīng)產(chǎn)生熱量，熱量累積易燒壞種子[1]。因此，對種子貯藏過程中濕度的把控十分重要。不同藥用植物種子對貯藏濕度的要求有所不同，過高或過低的貯藏濕度都會縮短種子的壽命。紅藤種子在15℃條件下貯存時，種子發(fā)芽率會隨著貯藏介質(zhì)濕度的上升而上升，當(dāng)貯藏介質(zhì)濕度在50%~65%時，紅藤種子保持在29%~31%的安全含水量的范圍內(nèi)，此時種子的發(fā)芽率高于貯藏前種子的發(fā)芽率[2]。在對藥用植物種子的研究中，研究者大多關(guān)注貯藏溫度、種子含水量等問題，對種子貯藏濕度的研究較少，有待繼續(xù)挖掘關(guān)于貯藏濕度的相關(guān)問題。

1.1.2 貯藏溫度貯藏溫度影響著種子的壽命，在0~50℃范圍內(nèi)，隨著貯藏溫度的升高，種子壽命明顯降低。獨活種子在室溫貯藏320 d時發(fā)芽率為0.4℃貯藏的條件下種子發(fā)芽率為24.25%，在-15℃貯藏的條件下種子發(fā)芽率為40%[3]；紅砂種子抗氧化酶系統(tǒng)隨著貯藏溫度的升高而逐漸破壞，膜系統(tǒng)損傷嚴(yán)重，貯藏溫度小于-8℃時適宜種子貯藏[4]。對黃精、白鮮和芍藥等種子的研究表明，溫度較高時，種子代謝活動增強(qiáng)，逐漸消耗有機(jī)物質(zhì)，有毒物質(zhì)不斷積累，種子壽命變短；溫度較低時，種子呼吸作用減弱，代謝活動減慢，可延長種子壽命[5,6]。

1.1.3 通氣條件種子在貯藏過程中，氣調(diào)貯藏通過氮氣（N2）、二氧化碳（CO2）及氬氣（Ar）等惰性氣體含量的增加調(diào)控氣體結(jié)構(gòu)組成，減少氧氣（O2）含量，抑制種子的呼吸強(qiáng)度及氧化作用，有效降低了種子的氧化損傷，延長種子貯藏的期限，是一種安全、環(huán)保、有效的技術(shù)手段[7]。于新等[8]在銀杏種子的氣調(diào)貯藏研究中發(fā)現(xiàn)，種子的霉變率、硬化率、呼吸強(qiáng)度和失水率隨O2濃度的增加而提高；N2、CO2、二氧化硫（SO2）與O2作用相反，其中SO2對銀杏種子的作用效果尤為明顯，它對磷酸二酯酶（PE）、過氧化物酶（POD）和過氧化氫酶（CAT）3種酶有顯著的抑制作用；銀杏種子的適宜氣調(diào)貯藏條件為3%~5% O2、低于70% N2、3 %~5%CO2以及低于10%SO2。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)種子包裝材料的透氣性也影響種子的壽命。秦艽種子適宜在紙袋中（4±1）℃條件下貯藏[9]；青蒿種子低溫貯藏時適宜在布袋中貯藏，在塑料袋和紙袋中貯存效果稍差，瓶裝效果最差[10]；纈草低溫貯藏時紙袋貯藏效果優(yōu)于不透氣的聚乙烯塑料管[11]。此外，藥用植物種子在生產(chǎn)實踐中堆積貯藏時，應(yīng)定期檢查翻倒種子，注意種子的通風(fēng)散熱，避免種子因呼吸積熱、細(xì)菌侵染等引發(fā)霉變和損耗[12]。

1.2 種子自身狀態(tài)

1.2.1 遺傳因素依據(jù)種子壽命的長短，種子可分為3種類型，壽命小于3年的為短命種子，壽命在3~15年的為中命種子，壽命在15年以上的為長命種子[13]。種子自身的壽命特性影響其貯藏時的活力，壽命長的種子在貯藏中劣變速度相對較緩。依據(jù)種子的貯藏特性不同，可分為正常型、中間型和頑拗型3種類型的種子。桔梗、人參、紅花和黃芩等正常型種子在干燥狀態(tài)下可存活相對較長的時間，適合低溫及低含水量貯藏；高姜良、肉豆蔻、細(xì)辛和三七等頑拗型種子成熟時具有較高的含水量，含水量低時種子易失活，常規(guī)低溫貯藏易造成冰晶損傷，常溫貯藏存放時間較短；中間型種子介于二者之間，對低溫環(huán)境敏感，能忍耐一定程度的脫水，但干燥至相對低的含水量（7%~12%）時會造成種子損傷，無法在低溫、低含水量條件下長期保存[14,15]。種子的壽命在很大程度上受遺傳因素的影響，深入研究不同物種種子的遺傳特性，可有效提高種子貯藏的期限。

1.2.2 種子含水量種子含水量會直接影響其貯藏的壽命，種子含水量越高其代謝活動越強(qiáng)，內(nèi)源物質(zhì)消耗速度加快，有毒物質(zhì)加快積累，種子壽命縮短。不同藥用植物的種子貯藏的適宜含水量有所不同，黨參種子常溫貯藏15個月后，含水量1.58%~3.37%的種子發(fā)芽率在90%以上，含水量6.17%的種子發(fā)芽率僅為36.25%[16]；白術(shù)種子室溫貯藏1年后，含水量12.05%的種子發(fā)芽率為0，含水量5.5%的種子發(fā)芽率為40%[17]?？梢?，探究藥用植物種子貯藏的適宜含水量對延長種子壽命有重要意義。

1.2.3 其他因素種子的貯藏壽命受其自身結(jié)構(gòu)、成熟度和飽滿度等多種因素影響，即使是同一品種的種子品質(zhì)也存在差異，在貯藏前對種子質(zhì)量的把控十分重要。種皮可防止害蟲和微生物等侵襲而保護(hù)種子，但種皮硬實會限制水分吸收，對種子發(fā)芽率產(chǎn)生負(fù)面影響[18-20]，蒙古黃芪、甘草和紫云英等硬實種子可貯藏較長時間，但其萌發(fā)時需對種皮進(jìn)行處理才能提高發(fā)芽率[21-23]。成熟度高的知母種子貯藏后發(fā)芽率和出苗率高[24]。鳳丹種子在4℃和25℃的條件下貯藏60 d后，發(fā)芽率隨種子成熟度的增加而升高[25]。

2 種子貯藏過程中的生理生化變化

2.1 有機(jī)物質(zhì)的變化

種子的有機(jī)物質(zhì)主要分為脂肪、蛋白質(zhì)和糖3大類，這些物質(zhì)為種子的生命活動提供能量[26]。種子呼吸作用的底物主要來自糖類，磷脂和蛋白質(zhì)是組成細(xì)胞膜的主要成分。有研究顯示，在逆境條件下可溶性蛋白與可溶性糖參與細(xì)胞的滲透調(diào)節(jié)，提高種子的抗逆境能力[27]。當(dāng)歸種子在15℃的條件下貯藏10個月，可溶性糖含量變化幅度較小，蛋白質(zhì)含量呈下降趨勢[28]；室溫貯藏1~8年的沙蔥種子可溶性糖含量逐漸下降，可溶性蛋白質(zhì)含量呈先上升后略有下降的趨勢[29]。隨著種子貯藏時間的延長，種子的有機(jī)物質(zhì)不斷代謝消耗及相互轉(zhuǎn)化，不同種子有機(jī)物質(zhì)的變化規(guī)律不同，但最終有機(jī)物質(zhì)都趨于減少趨勢，減慢有機(jī)物質(zhì)的消耗速率可以延緩種子失活。

2.2 酶活性的變化

酶參與了種子全部代謝及生命活動，并起到了重要的催化調(diào)節(jié)作用。種子體內(nèi)很多酶促反應(yīng)極易受溫度影響，溫度較高時酶促反應(yīng)劇烈，溫度過高時酶蛋白結(jié)構(gòu)被破壞而失去活力，溫度較低時酶促反應(yīng)緩慢，有利于種子延長壽命。大量研究顯示，種子在貯藏過程中過氧化物和自由基不斷產(chǎn)生與積累，質(zhì)膜因膜脂過氧化而完整性降低，種子逐漸劣變最終失活[30]。谷胱甘肽還原酶（GR）、抗壞血酸過氧化物酶（APX）、CAT、POD和超氧化物歧化酶（SOD）等抗氧化酶在種子貯藏過程中可以清除種子體內(nèi)的自由基及過氧化物，起到抗氧化作用。白鮮、芍藥和北細(xì)辛等的種子隨著貯藏時間的延長CAT、SOD及POD等抗氧化酶活性逐漸下降[6,31]。種子體內(nèi)的酶促反應(yīng)是一個復(fù)雜的過程，不同種類酶的變化也各不相同，通過酶活性的變化可以在一定程度上反映出種子貯藏期間的生理生化變化規(guī)律。

2.3 有毒物質(zhì)的積累

在種子中，活性氧（ROS）如超氧化物、過氧化氫（H2O2）和羥基自由基等會氧化細(xì)胞成分，造成膜系統(tǒng)損傷和蛋白質(zhì)、DNA等功能障礙，導(dǎo)致膜脂過氧化，被認(rèn)為是損害細(xì)胞膜的完整性的首要因素[32]。超氧陰離子（O2）是大多數(shù)ROS的前體，可以歧化產(chǎn)生H2O2，H2O2可以自由穿過細(xì)胞膜并產(chǎn)生具有高攻擊性的HO[33]。同時，O2也是氧化鏈反應(yīng)的介質(zhì)，可與其他自由基反應(yīng)，如與NO反應(yīng)生成亞硝酸根[34]。不同含水量的蒙古黃芪種子在貯藏12個月后產(chǎn)生速率和H2O2含量均呈上升趨勢[35]。作為膜脂過氧化作用的主要產(chǎn)物之一，丙二醛（MDA）具有很強(qiáng)的毒性，對細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的損傷有很大影響，MDA含量過高會加劇質(zhì)膜完整性的破壞，還會抑制抗氧化酶活性，降低其對自由基和過氧化物的清除能力。北細(xì)辛、香椿和黃精等的種子MDA含量隨貯藏時間的延長而不斷增加[5,31,36]。種子在貯藏過程中會發(fā)生阿馬道里-美拉德反應(yīng)（Amadori-Maillard reactions,A-M），該反應(yīng)產(chǎn)生的物質(zhì)會抑制抗氧化酶和DNA修復(fù)酶等的活性，并通過非酶促反應(yīng)糖基化修飾造成蛋白質(zhì)和DNA功能和結(jié)構(gòu)改變，最終導(dǎo)致蛋白質(zhì)降解和染色體畸變[37,38]。有研究表明，酮醛類、高級糖基化合物、過氧化氫和糖化蛋白等反應(yīng)產(chǎn)物會隨種子貯藏時間的延長而不斷增加，種子自我修復(fù)能力和抗脅迫能力下降，最終劣變失活[39,40]。、MDA、H2O2和美拉德產(chǎn)物等有毒物質(zhì)的含量與種子的活力呈負(fù)相關(guān)，是反映種子膜脂過氧化程度和劣變程度的重要指標(biāo)。

2.4 遺傳物質(zhì)的變化

種子在貯藏過程中的劣變伴隨著核酸降解，其完整性被破壞[41]。種子細(xì)胞內(nèi)自由基逐漸積累，DNA鏈上脫氧核糖的糖基以及嘧啶、嘌呤的堿基受到破壞，DNA雙鏈結(jié)構(gòu)因糖基的破壞而解鏈，從而造成染色體異常和畸變，包括聯(lián)橋、斷裂、突變和缺失等[42,43]。種子貯藏中的劣變引起遺傳物質(zhì)含量下降，產(chǎn)生缺陷并逐漸積累，種子修復(fù)能力下降，DNA出現(xiàn)片段化，最終造成無法逆轉(zhuǎn)的損傷[44]。川牛膝種子老化后根尖分生組織染色體出現(xiàn)落后、單橋、雙橋和多橋等畸變現(xiàn)象[45]。與DNA相比，RNA的單鏈結(jié)構(gòu)更容易受到環(huán)境信號的氧化損傷。RNA結(jié)構(gòu)的損傷會影響基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯，低活力的種子會表現(xiàn)出蛋白質(zhì)等代謝的改變[46]。魯海坤等[47]在研究蒙古黃芪種子老化時發(fā)現(xiàn)5,10-亞甲基四氫葉酸、二氫葉酸等代謝物質(zhì)的含量逐漸增加，葡萄糖基神經(jīng)酰胺、棉子糖等含量逐漸減少。種子在貯藏過程中逐漸老化，合成蛋白質(zhì)、DNA和RNA等生物大分子能力降低，隨著種子老化加劇，合成遺傳物質(zhì)的酶活性降低，新的遺傳物質(zhì)合成較慢甚至無法合成，受損的遺傳物質(zhì)無法修復(fù)，這也是種子最終失活的重要原因之一[48]。

3 藥用植物種子的貯藏

3.1 超低溫貯藏

種子的超低溫保存是指種子貯藏在液氮（-196℃）、超低溫冰箱（-80℃）等環(huán)境中，此時種子的代謝活動處于極為緩慢的狀態(tài)，從而延長種子壽命，使種子可以長期貯藏[49]。該技術(shù)可應(yīng)用于藥用植物種質(zhì)資源的保存，但其成本較高，無法在生產(chǎn)中大批量保存種子。超低溫貯藏包括包埋脫水法、玻璃化法、預(yù)凍法和兩步法等，其中兩步法和玻璃化法較為常用[50]。目前紅豆杉、降香黃檀和白木香等種子在超低溫保存方面的研究取得了很大的進(jìn)展[51-53]。有研究顯示，液氮超低溫貯藏對種子的萌發(fā)有促進(jìn)作用。杜若、過江藤和皺果莧等種子貯藏在液氮中，經(jīng)直接冷凍、緩慢冷凍及玻璃化冷凍等不同處理后種子發(fā)芽率高于對照組[54]，有學(xué)者猜測是液氮冷凍打破了種子休眠，但超低溫貯藏對種子的影響及其促進(jìn)種子萌發(fā)的機(jī)制還需要深入研究。

3.2 超干貯藏

種子的超干貯藏是指含水量低于5%的種子在室溫下貯藏，是通過降低種子含水量代替低溫貯藏從而達(dá)到相同貯藏效果的一種貯藏方法。超干貯藏成本較低，但一般適用于正常型種子，頑拗型種子和中間型種子會因水分過低而干燥失活。硅膠干燥高效低耗、操作簡單，是常用的超干處理方法，但部分藥用植物種子超干困難，需運用真空冷凍干燥進(jìn)行超干處理[55]。鄭曉鷹等[56]研究發(fā)現(xiàn)番茄種子經(jīng)真空冷凍干燥、加溫干燥、硅膠干燥或低溫低濕干燥處理后常溫貯藏10年發(fā)芽率仍在90%以上。含水量2.921%~4.645%的塔落巖黃芪種子室溫貯藏12個月后發(fā)芽率在80%左右[57]；含水量3.3%的杜仲種子貯藏2年后發(fā)芽率為97%[58]；含水量3.1%的沙芥種子在20℃下貯藏1年，發(fā)芽率為97%；含水量2.2%的斧形沙芥種子在20℃下貯藏1年，發(fā)芽率為100%[59]。探究藥用植物種子超干貯藏的安全含水量范圍對藥用植物的種質(zhì)資源保存有重要意義，是非常值得研究的課題。

3.3 種質(zhì)庫保存

種質(zhì)庫主要貯藏耐干燥和低溫的正常型種子，是以種子為繁殖和遺傳材料進(jìn)行資源保存的方法，具有簡單、普遍和性價比高等特點。藥用植物種子種質(zhì)庫的保存條件分別為中期庫（溫度-4℃±2℃，相對濕度<45%）、長期庫（溫度-18℃±2℃，相對濕度<50%）[60]。目前我國已在北京、四川和海南建立了國家藥用植物種質(zhì)庫。芍藥種子在中期庫和長期庫貯藏1年后發(fā)芽率在94%左右[6]。在中期庫貯藏4年后，荊芥種子發(fā)芽率下降了2.2%，黃芩種子發(fā)芽率下降了5.4%，桔梗種子發(fā)芽率下降了8.9%，黨參種子發(fā)芽率下降了14.3%，益母草種子發(fā)芽率下降了12%，穿心蓮種子發(fā)芽率下降了12.2%，冬凌草種子發(fā)芽率下降了17%[61]。目前，種質(zhì)庫保存的藥用植物種子活力監(jiān)測時間還比較短，應(yīng)長期監(jiān)測其活力變化，以確定種子更新時間[62]。

3.4 倉儲保存

種子倉庫是生產(chǎn)中保藏種子的場所，廣泛應(yīng)用于種子的商品化生產(chǎn)及大批量儲存，有安全、便捷和成本低等特點。依據(jù)種子的堆裝形式可分為散裝倉庫和包裝倉庫；依據(jù)溫度可分為低溫庫（≤15℃）、準(zhǔn)低溫庫（15~20℃）和常溫庫。杜松種子在冷藏（5℃）、泥房（15℃）、混凝土房（17℃）以及鐵房（20℃）中貯藏42個月后，在冷藏室中貯藏的種子發(fā)芽率最高，其次是泥房、鐵房和混凝土房[63]。含水量低于12.2%的香椿種子在貯藏溫度低于15℃的條件下貯藏90 d后發(fā)芽率高于65%，含水量低于9.1%的香椿種子在貯藏溫度15~20℃條件下發(fā)芽率高于65%[36]。含水量小于8.5%的白花桔梗種子在室內(nèi)及室外貯藏12個月后發(fā)芽率均在95%以上[64]。在種子倉儲中，可依據(jù)種子貯藏的研究結(jié)果和實際的生產(chǎn)情況對種子的倉儲條件作出適當(dāng)調(diào)整。

4 展望

我國有藥用植物11 146種，其中栽培品種達(dá)300多種?，F(xiàn)階段，桔梗、蒙古黃芪和黃精等少數(shù)藥用植物種子的貯藏研究取得一定的進(jìn)展，但是研究工作不夠系統(tǒng)和全面。藥用植物種子貯藏是一項長期的工作，仍有許多問題有待解決，諸如藥用植物種類繁多，多種藥用植物種子貯藏特性、貯藏溫度、安全含水量和適宜的貯藏方式等尚不明確，有待進(jìn)一步研究；對藥用植物種子貯藏的研究多集中在種子活力及生理生化方面，在基因和通路等方面研究較少，可通過組學(xué)研究包括轉(zhuǎn)錄組、代謝組和蛋白質(zhì)組等研究挖掘種子劣變的機(jī)制和原理，也可對種子的超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察研究，探究種子貯藏中劣變的過程和規(guī)律，為延緩種子劣變和種子修復(fù)提供理論基礎(chǔ)；藥用植物種子的商品化處理有待發(fā)展，貯藏技術(shù)推廣應(yīng)用到藥用植物種子商品化處理中，可減少種子的成本損耗，種子貯藏后的修復(fù)也會提高藥用植物的生產(chǎn)效率，如何降低種子加工、貯藏成本以及提高種子的修復(fù)效果是需要解決的問題。