金華火腿中生物活性肽的抗高血壓活性研究

邢路娟，左慶翔，郝月靜，傅麗娟，張萬剛

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院 國家肉品質(zhì)量安全與工程技術(shù)研究中心 南京 210095）

高血壓是指血液在循環(huán)流動(dòng)時(shí)，對(duì)血管壁造成的壓力值持續(xù)高于正常值[1]。 據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）2019年統(tǒng)計(jì)顯示，全世界估計(jì)共有11.3億人患有高血壓。從年齡結(jié)構(gòu)來看，高血壓患病人群已不再局限于中老年人，逐漸呈現(xiàn)年輕化趨勢(shì)。由高血壓引發(fā)的腦中風(fēng)、動(dòng)脈硬化、腎衰竭等病發(fā)癥是導(dǎo)致高死亡率的重要原因。目前，常見的高血壓控制藥物如卡托普利等均需要長期服用，由此引發(fā)的副作用，如心悸、腎功能損害、失眠等，對(duì)生命健康帶來潛在風(fēng)險(xiǎn)。因此，研發(fā)具有降血壓作用的功能性營養(yǎng)因子來緩解高血壓病情具有廣闊的前景。 血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（Angiotensin converting enzyme，ACE） 在高血壓形成過程中發(fā)揮重要功能。 ACE 作用于血管緊張素I （Angiotensin I，Ang I）并將其轉(zhuǎn)化為Ang II，引起動(dòng)脈收縮，同時(shí)抑制緩激肽分解，導(dǎo)致機(jī)體血壓上升[2]。 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)表明，生物活性肽可通過抑制ACE 活性，達(dá)到降低血壓的效果[3]。

干腌火腿是經(jīng)過發(fā)酵成熟后的肉制品，其生產(chǎn)周期長，發(fā)酵成熟過程中產(chǎn)生的游離氨基酸、肽類物質(zhì)賦予干腌火腿獨(dú)特的產(chǎn)品品質(zhì)[4]。干腌火腿主要產(chǎn)于中國及歐洲地中海地區(qū)，其中金華火腿、宣威火腿、如皋火腿是我國有名的三大火腿[5]。 在肌肉內(nèi)源酶及微生物的作用下，干腌火腿的肌肉蛋白如肌動(dòng)蛋白、肌球蛋白、肌鈣蛋白等均可發(fā)生降解，從而生成多肽和游離氨基酸等成分[6]。 有研究表明，隨著發(fā)酵周期的延長，干腌火腿中產(chǎn)生的肽逐漸增多，提取得到的肽類含量占肌肉總量的1.58%～6.26%[7]。 干腌火腿多肽被證實(shí)具有清除自由基，螯合金屬離子，調(diào)節(jié)血管緊張素轉(zhuǎn)化酶，抑菌等活性[8-10]。 祝超智等[11]驗(yàn)證了從金華火腿中提取的多肽具有清除羥基自由基、DPPH 自由基、螯合金屬離子能力，與谷胱甘肽相比，具有顯著抗氧化能力。 Dellafiora 等[12]報(bào)道意大利帕爾瑪火腿中提取的肽類具有ACE 抑制活性，其中LGL 和SFVTT 肽段具有較強(qiáng)的ACE 抑制活性。Mora 等[13]發(fā)現(xiàn)伊比利亞干腌火腿是天然抗高血壓肽的來源，在自發(fā)高血壓大鼠體內(nèi)具有顯著降低收縮壓的功能。與西式干腌火腿相比，中式干腌火腿在加工工藝、發(fā)酵環(huán)境等方面均有不同，從中提取的生物活性肽的種類及生物活性也存在差異。目前，關(guān)于中國傳統(tǒng)干腌火腿來源多肽的降血壓活性研究還未見報(bào)道。 為探究干腌火腿多肽的高血壓調(diào)節(jié)功能，本研究以金華火腿為原料提取多肽，采用體外、體內(nèi)試驗(yàn)進(jìn)行抗高血壓活性研究，為進(jìn)一步豐富干腌火腿的功能性提供基礎(chǔ)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

pH 計(jì) （FE20），瑞 士Mettle Toledo 公 司；GM200 刀式研磨儀，德國Retsch 公司；T25 勻漿機(jī)，德國IKA 公司；Avanti J-E 高速離心機(jī)，美國Beckman Coulter 公司；ES2030 冷凍干燥機(jī)，日本Hirachi 公司；多功能酶標(biāo)儀SpectraMaxRM2e，美國Molecular Devices 公司；MRB-ⅢA 型電腦大鼠血壓心率測(cè)定儀，上海高血壓研究所；Oasis HLB 固相萃取柱，美國Waters 公司。

1.2 材料與試劑

自發(fā)性高血壓大鼠（SHR）購于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，共計(jì)20 只（SPF 級(jí)、12 周齡的雄性鼠）。 每只大鼠單籠飼養(yǎng)，放置飲水瓶和足夠的維持飼料，讓大鼠自由進(jìn)食和飲水，培養(yǎng)室內(nèi)溫度為25 ℃，相對(duì)濕度為60%。

金華火腿，金華金年火腿有限公司；血管緊張素轉(zhuǎn)化酶、胰酪蛋白胨、腎素檢測(cè)試劑盒，Sigma-Aldrich 公司；氫氧化鈉、磷酸二氫鈉、鹽酸、氯化鈉、 十二烷基硫酸鈉 （Sodium dodecyl sulfate，SDS）、甲醇、鄰苯二甲醛、乙醇、β-巰基乙醇、醋酸乙酯、硼砂，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；卡托普利，上海源葉生物科技有限公司。以上試劑均為分析純級(jí)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 金華火腿中粗肽的提取 金華火腿中多肽的提取方法參考胡亞亞等[14]的研究。 將火腿肌肉分割成小塊放入研磨儀中絞碎。 稱取碎肉粒25 g盛入500 mL 離心瓶中，并加入100 mL 磷酸緩沖液（0.02 mol/L，pH 7.0），隨后進(jìn)行勻漿處理（轉(zhuǎn)速18 000 r/min，勻漿時(shí)間12 s，間歇時(shí)間15 s）。 將勻漿液置于4 ℃靜置2 h 后，再次離心（溫度4 ℃，12 000×g，時(shí)間20 min），隨后取出上清液。 將上清液中的脂肪滴、肉糜等雜質(zhì)過濾后，加入3 倍體積的40%（體積分?jǐn)?shù)）乙醇，然后將混合溶液于4 ℃靜置8 h 后離心（4 ℃，12 000×g，20 min）得到多肽上清液。 最后將冷凍干燥的多肽粉末放置于-20℃冰箱中保存。

1.3.2 肽濃度的測(cè)定 肽濃度測(cè)定方法參照Church 等[15]并作適當(dāng)改進(jìn)。 在避光條件下配制鄰苯二甲醛混合液，取80 mg 鄰苯二甲醛溶解于1 mL 甲醇中，依次加入50 mL 硼砂溶液（100 mmol/L），5 mL SDS（20%）和200 μL β-巰基乙醇，最后用去離子水將溶液總體積定容至100 mL。 鄰苯二甲醛混合液現(xiàn)用現(xiàn)配。取150 μL 的多肽樣品與2 mL 鄰苯二甲醛混合液混勻，室溫下避光孵育2 min，在340 nm 波長處測(cè)定吸光值。同時(shí)配制含量為0，0.2，0.4，0.6，0.8 mg/mL 的胰酪蛋白胨作為標(biāo)準(zhǔn)品，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算火腿多肽樣品中的肽濃度。

1.3.3 粗肽提取物脫鹽 使用固相萃取柱Oasis HLB 20 cc 對(duì)提取的多肽樣品進(jìn)行脫鹽處理，具體過程參照Escudero 等[16]的方法。首先活化柱體，用蒸餾水淋洗萃取柱，再將提取的2.5 mL 多肽溶液（1 mg/mL）注入柱體；隨后使用蒸餾水洗脫萃取柱，洗脫量為柱體積的3 倍容量，最后使用50%（體積分?jǐn)?shù)） 甲醇溶液將洗脫液收集到5 mL 離心管。洗脫液經(jīng)過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后再冷凍干燥，得到的肽粉置于-20 ℃保存。

1.3.4 腎素抑制活性的測(cè)定 腎素抑制活性測(cè)定方法參考腎素檢測(cè)試劑盒MAK157-1KT （Sigma-Aldrich）。

1.3.5 動(dòng)物實(shí)驗(yàn) SHR 適應(yīng)環(huán)境1 周后進(jìn)行分組試驗(yàn)。 將20 只SHR 大鼠分為如下4 個(gè)處理組：

空白對(duì)照組（C）：灌胃磷酸鹽緩沖液（0.1 mol/L，pH 7.0）；藥品對(duì)照組（DC）：灌胃質(zhì)量濃度為5 mg/mL 的卡托普利溶液；低肽濃度組（LP）：灌胃質(zhì)量濃度為10 mg/mL 的粗肽溶液； 高肽濃度組（HP）：灌胃質(zhì)量濃度為20 mg/mL 的粗肽溶液。

灌胃劑量根據(jù)大鼠體質(zhì)量進(jìn)行換算 （5 mL/kg），灌胃后每隔2 h 測(cè)定SHR 大鼠的心率、收縮壓以及舒張壓，分別記錄灌胃后2，4，6，8，10，12 h 的血壓數(shù)據(jù)。 相同時(shí)間點(diǎn)同一只鼠的血壓指標(biāo)重復(fù)測(cè)量3 次，最終結(jié)果取平均值。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)過程中所得數(shù)據(jù)使用SAS 8.0 進(jìn)行分析，方差分析方法使用One-Way ANOVA，采用鄧肯多重比較，顯著性檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)為P<0.05，極顯著性檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)為P<0.01。 半抑制濃度（IC50）的分析使用SPSS 23.0 軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 金華火腿中的多肽含量及體外抗高血壓活性

在干腌火腿發(fā)酵成熟過程中，肌肉蛋白質(zhì)在內(nèi)源酶及微生物的作用下發(fā)生水解并產(chǎn)生豐富的肽類物質(zhì)。前期研究顯示，干腌火腿中肽的含量與發(fā)酵周期密切相關(guān)[17]。 Zhu 等[18]采用鹽酸浸提的方法得到金華火腿中多肽含量為1.16%。 發(fā)酵周期為16 個(gè)月的宣威火腿中多肽含量為3.44%[19]。 由表1 可知，使用磷酸鹽法提取的金華火腿中，生物活性肽含量高達(dá)12.19%。 本試驗(yàn)的金華火腿中較高的肽含量可能與火腿較長的發(fā)酵周期有關(guān)，多肽含量的增加為研究其生理調(diào)節(jié)活性奠定了基礎(chǔ)。

表1 金華火腿中的肽含量Table 1 Peptides contents in Jinhua dry-cured ham

體內(nèi)腎素-血管緊張素系統(tǒng) （Renin-angiotensin system，RAS）是機(jī)體的升壓系統(tǒng)，激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)（Kallikrein-kinin system，KKS）是機(jī)體的降壓系統(tǒng)，兩者在調(diào)節(jié)血壓的過程中存在拮抗關(guān)系，只有當(dāng)兩者達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡時(shí)，機(jī)體的血壓才能維持正常水平。 ACE 主要通過參與體內(nèi)循環(huán)系統(tǒng)來影響機(jī)體血壓[20]。 當(dāng)機(jī)體血壓降低后，流經(jīng)腎臟的血液量減少，腎臟將分泌腎素進(jìn)入血液，血管緊張素原在腎素作用下產(chǎn)生Ang Ι，Ang Ι 進(jìn)入血循環(huán)后在ACE 作用下裂解為Ang II，Ang II 具有強(qiáng)收縮血管的作用；同時(shí)Ang II 可促進(jìn)醛固酮產(chǎn)生，刺激腎上腺素釋放和Na+重吸收，導(dǎo)致血壓升高[7]。 在KKS 系統(tǒng)中，激肽原在激肽釋放酶的作用下產(chǎn)生舒緩激肽（Bradykinin，BK），進(jìn)而刺激血管壁釋放出具有強(qiáng)作用的血管舒張因子，從而擴(kuò)張毛細(xì)血管使血壓降低。 ACE 則可以通過切除部分活性位點(diǎn)使BK 失活，導(dǎo)致血壓升高[21]。 從高血壓形成的過程可知，有效控制ACE 的活性是緩解血壓升高的有效途徑。前期研究發(fā)現(xiàn)，牛肉蛋白[22]、骨膠原蛋白[23]、魚皮明膠[24]等蛋白水解后提取的生物活性肽均具有ACE 抑制活性。 在SHR降壓試驗(yàn)中，鮭魚皮明膠中鑒定得到的2 條ACE抑制肽GLP 和LP，均可顯著降低SHR 的收縮壓[24]。在金華火腿多肽的穩(wěn)定性研究中，其ACE 抑制率隨著肽質(zhì)量濃度的增加而提升，當(dāng)肽質(zhì)量濃度低于2.5 mg/mL 時(shí)，ACE 抑制率增長速率最快，超過2.5 mg/mL 時(shí)，增長速率逐漸降低；在肽質(zhì)量濃度為10 mg/mL 時(shí)，ACE 抑制率最高為53.53%[25]。 在本試驗(yàn)中，火腿多肽的腎素抑制率也隨著質(zhì)量濃度的升高逐漸增強(qiáng) （圖1）。 當(dāng)肽質(zhì)量濃度為10 mg/mL 時(shí)，腎素抑制率達(dá)到62.21%。 通過擬合公式可以計(jì)算得到火腿多肽的IC50值為6.69 mg/mL。 以上結(jié)果初步證明了火腿多肽具有潛在的血壓調(diào)節(jié)功能。

圖1 金華火腿粗肽提取物的腎素抑制能力Fig.1 The renin inhibitory activity of peptides extracted from Jinhua dry-cured ham

2.2 動(dòng)物體內(nèi)的降血壓效果

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選取SHR 大鼠，通過與高血壓藥物（卡托普利）對(duì)比，探究灌胃金華火腿多肽對(duì)SHR大鼠的血壓調(diào)節(jié)功能，測(cè)量灌胃后不同時(shí)間點(diǎn)的心率、收縮壓、舒張壓等指標(biāo)。

2.2.1 金華火腿粗肽提取物對(duì)大鼠心率的影響高血壓與心率變化密切相關(guān)，心率加快會(huì)增加高血壓的風(fēng)險(xiǎn)，高血壓患者的臨床癥狀也通常伴隨心率的升高。 靜息心率的增加反映了機(jī)體內(nèi)交感神經(jīng)系統(tǒng)持續(xù)興奮，系統(tǒng)過度驅(qū)動(dòng)將對(duì)多部位的器官及其相應(yīng)功能產(chǎn)生不利影響[26]。 已有研究表明，高血壓患者靜息心率加快，可導(dǎo)致血管、心臟、腎臟損傷，進(jìn)而影響機(jī)體的正常功能[27]。 降血壓藥物進(jìn)入機(jī)體血液循環(huán)后會(huì)對(duì)心率造成一定程度的影響[28]。 由圖2a 可知，當(dāng)給SHR 大鼠以低肽質(zhì)量濃度10 mg/mL 進(jìn)行灌胃時(shí)，各時(shí)間點(diǎn)測(cè)得SHR大鼠心率與空白組相比并無顯著差異（P>0.05）。從圖2b 可以看出，高質(zhì)量濃度20 mg/mL 灌胃后，SHR 大鼠在2 h 和6 h 的心率顯著低于空白對(duì)照組（P<0.05）。 從圖2c 可以看出，卡托普利灌胃后，SHR 大鼠的心率在2～6 h 內(nèi)顯著低于空白對(duì)照組，其中SHR 大鼠心率在灌胃2 h 與4 h 后呈極顯著降低（P<0.01）。 較高濃度的粗肽提取物表現(xiàn)出了降低心率的活性，雖在灌胃2 h 和4 h 后效果不及藥物對(duì)照組，但在灌胃后8 h 高肽濃度組SHR 大鼠心率顯著低于藥品對(duì)照組（P<0.05）。由此可知，高濃度多肽灌胃對(duì)心率的控制作用更為穩(wěn)定。

圖2 金華火腿粗肽提取物對(duì)SHR 大鼠心率的影響Fig.2 Effect of peptides extracted from Jinhua dry-cured ham on the heart rate of SHR after intragastric administration

2.2.2 金華火腿粗肽提取物對(duì)大鼠收縮壓的影響

收縮壓是指當(dāng)心臟收縮時(shí)，血液由心臟流向四肢時(shí)血液對(duì)血管的壓力。 當(dāng)收縮壓持續(xù)≥140 mmHg（壓力21.3 kPa）則可診斷為高血壓[29]。 收縮壓是反應(yīng)機(jī)體血壓變化的最重要指標(biāo)。Fatani 等[30]研究表明高血壓患者收縮壓的變化，可作為獨(dú)立預(yù)測(cè)重大心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)的依據(jù)。由圖3 可知，低肽質(zhì)量濃度組、高肽質(zhì)量濃度組、藥品對(duì)照組在灌胃后的2～10 h，均有顯著降低收縮壓的效果，測(cè)量值均顯著低于空白對(duì)照組（P<0.05）。 低肽質(zhì)量濃度組在灌胃2 h 后，對(duì)大鼠收縮壓的控制能力較弱，隨后對(duì)收縮壓的控制效果逐漸增強(qiáng)。 在8 h后，多肽灌胃處理的兩組大鼠均呈現(xiàn)較低的收縮壓，且與空白組的差異極顯著（P<0.01）。在4～10 h 內(nèi)，多肽與卡托普利處理組的收縮壓均極顯著低于空白組（P<0.01），且3 個(gè)處理組之間無顯著差異（P>0.05）。 由此可知，與卡托普利相比，高肽質(zhì)量濃度組對(duì)SHR 大鼠收縮壓的調(diào)節(jié)作用呈延緩降低的趨勢(shì)，即卡托普利可在給藥2 h 內(nèi)實(shí)現(xiàn)快速降壓，而在6 h 得到最佳效果，多肽灌胃后則在8 h 達(dá)到最佳降壓效果。

圖3 金華火腿粗肽提取物對(duì)SHR 大鼠收縮壓的影響Fig.3 Effect of peptides extracted from Jinhua dry-cured ham on the systolic blood pressure of SHR after intragastric administration

2.2.3 金華火腿粗肽提取物對(duì)大鼠舒張壓的影響

舒張壓是指在心臟舒緩狀態(tài)下，動(dòng)脈血管壁回縮時(shí)產(chǎn)生的壓力，正常狀態(tài)下舒張壓應(yīng)介于60～90 mmHg（12 kPa）。 金華火腿多肽對(duì)SHR 大鼠舒張壓的影響如圖4 所示。 低肽質(zhì)量濃度組SHR 大鼠的舒張壓略低于空白對(duì)照組，然而并無顯著性差異（P>0.05）；在灌胃4～10 h 內(nèi)，高質(zhì)量濃度組大鼠的舒張壓顯著低于空白組（P<0.05），其中在6 h 和8 h 時(shí)，呈極顯著降低趨勢(shì)（P<0.01）；在灌胃2～6 h 內(nèi)，卡托普利對(duì)大鼠的舒張壓呈極顯著降低趨勢(shì)（P < 0.01），其余時(shí)間無顯著變化（P >0.05）。 由此可見，卡托普利降低舒張壓見效快，然而高濃度粗肽提取物可在更長時(shí)間內(nèi)維持舒張壓在較低水平，作用效果顯著。火腿多肽在生物體內(nèi)發(fā)揮作用時(shí)間晚于卡托普利，可能因?yàn)榕c多肽的吸收過程相關(guān)。有研究顯示，生物活性肽在體內(nèi)經(jīng)消化后會(huì)產(chǎn)生更短的多肽，而特定序列的短肽具有較強(qiáng)的降壓活性[31]。

圖4 金華火腿多肽對(duì)SHR 大鼠舒張壓的影響Fig.4 Effect of peptides extracted from Jinhua dry-cured ham on the diastolic blood pressure of SHR after intragastric administration

綜合以上指標(biāo)可知，高肽質(zhì)量濃度 （20 mg/mL）的火腿多肽與5 mg/mL 卡托普利的降血壓功效相近，同時(shí)火腿多肽的降壓作用延遲于卡托普利，且降壓作用持續(xù)更長。造成這一現(xiàn)象的潛在原因如下：在生物體中，消化系統(tǒng)中的胃蛋白酶、胰蛋白酶等將火腿多肽進(jìn)一步水解，生成具有降血壓活性的肽段進(jìn)而被消化吸收，然后發(fā)揮體內(nèi)降血壓作用。金華火腿多肽中肽成分復(fù)雜，降血壓活性肽的結(jié)構(gòu)功能存在較大差異，部分生物活性多肽可能發(fā)揮藥物前體作用。

3 結(jié)論

在體外降血壓活性研究中，金華火腿多肽呈現(xiàn)出較強(qiáng)的腎素抑制活性，其IC50值為6.69 mg/mL。 在SHR 大鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，通過灌胃不同質(zhì)量濃度的火腿多肽與卡托普利進(jìn)行對(duì)比發(fā)現(xiàn)，火腿多肽具有顯著調(diào)節(jié)大鼠心率、收縮壓、舒張壓的功能。 當(dāng)灌胃質(zhì)量濃度為20 mg/mL 時(shí)，大鼠的收縮壓與舒張壓在8 h 后呈現(xiàn)最佳抑制效果，而心率指標(biāo)則恢復(fù)正常。與卡托普利相比，高質(zhì)量濃度多肽的血壓調(diào)節(jié)功能更顯著，且時(shí)間更長。以上研究證實(shí)了金華火腿多肽具有體外調(diào)節(jié)腎素活性的功能，同時(shí)在高血壓大鼠的灌胃實(shí)驗(yàn)中具有降血壓功效，以上結(jié)果為開展火腿多肽的體內(nèi)生理調(diào)節(jié)功能研究奠定了基礎(chǔ)。