玉米糖肽對(duì)酒精誘導(dǎo)損傷LO2細(xì)胞的保護(hù)效應(yīng)

王曉杰，童 玲，劉曉蘭

（齊齊哈爾大學(xué)食品與生物工程學(xué)院 黑龍江省玉米深加工理論與技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 黑龍江齊齊哈爾 161006）

據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）報(bào)告，飲酒與200 多種疾病和傷害有關(guān)[1]。 肝臟是酒精代謝的主要器官，90%的酒精攝入量由肝臟代謝，肝臟也是酒精毒性的主要靶器官[2]。長(zhǎng)期大量飲酒或酗酒容易引發(fā)肝臟損傷性疾病，且不容易受到控制。酒精性肝損傷的特征是脂肪變性、炎癥、壞死，最終導(dǎo)致纖維化和肝硬化，約有15%的酒精性肝硬化患者會(huì)發(fā)展成肝癌，其引發(fā)的健康和社會(huì)問題不容忽視[3-4]。目前，酒精性肝病的臨床治療主要采取戒酒、營(yíng)養(yǎng)支持和對(duì)癥治療等綜合療法，目的是減輕酒精性肝損傷的臨床癥狀，降解清除已經(jīng)形成或者正在形成的纖維組織，以防止肝硬化的發(fā)生。盡管現(xiàn)代醫(yī)學(xué)取得了長(zhǎng)足的進(jìn)步，但仍沒有特效藥物能使肝病患者痊愈，而且一般的抗酒精藥物會(huì)導(dǎo)致副作用或產(chǎn)生新的毒性[5-8]。 研發(fā)拮抗酒精性肝損傷的天然、低毒副作用、多途徑的肝保護(hù)劑，是目前醫(yī)學(xué)和食品科學(xué)領(lǐng)域共同關(guān)注的問題。

玉米糖肽是玉米蛋白經(jīng)蛋白酶水解獲得低分子質(zhì)量的玉米肽，然后，在轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶催化下與氨基糖共價(jià)結(jié)合的產(chǎn)物。與玉米肽相比，玉米糖肽的溶解性顯著增加，并具有更高的抗氧化活性及乙醇脫氫酶激活活性[9-10]，推測(cè)玉米糖肽具有在體內(nèi)發(fā)揮促進(jìn)酒精代謝和拮抗酒精性肝損傷的潛力。然而，目前鮮有關(guān)注玉米糖肽在細(xì)胞水平上拮抗酒精性肝損傷的活性研究。

本試驗(yàn)以細(xì)胞存活率為指標(biāo)，構(gòu)建LO2 細(xì)胞酒精性損傷模型，然后，用構(gòu)建成功的LO2 細(xì)胞損傷模型，以GSH 為陽性對(duì)照，從LO2 細(xì)胞存活率、酒精代謝酶活力、氧化應(yīng)激水平及細(xì)胞凋亡情況等角度，評(píng)價(jià)玉米糖肽對(duì)酒精誘導(dǎo)損傷的LO2細(xì)胞的保護(hù)效應(yīng)，并分析可能的保護(hù)機(jī)制，為后續(xù)用動(dòng)物模型研究玉米糖肽拮抗酒精性肝損傷的效應(yīng)及作用機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

LO2 細(xì)胞株，南京凱基生物技術(shù)有限公司；噻唑蘭（MTT），上海生工生物技術(shù)有限公司；DMEM高糖培養(yǎng)基、 胎牛血清、0.25%胰蛋白酶，Gibco 公司；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（Alanine aminotransferase，ALT）、 天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶 （Aspartate aminotransferase，AST）、乳酸脫氫酶（Lactate dehydrogenase，LDH）、活性氧簇（Reactive oxygen species，ROS）、谷胱甘肽過氧化物酶（Glutathione peroxidase，GSH-Px）和Annexin V-FITC/PI 雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒，南京建成生物工程研究所；乙醇脫氫酶（Alcohol dehydrogenase，ADH）、乙醛脫氫酶（Acetaldehyde dehydrogenase，ALDH）、 超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（Catalase，CAT）、谷胱甘肽（Glutathione，GSH）和丙二醛（Malondialdehyde，MDA）檢測(cè)試劑盒，上海江萊生物有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

NV 4750E 二氧化碳培養(yǎng)箱，美國(guó)紐埃爾公司；FC500 流式細(xì)胞儀，美國(guó)貝克曼庫爾特公司；SX-500 高壓蒸汽滅菌鍋，日本TOMY 公司；En-Spire 酶標(biāo)儀，美國(guó)PerkinElmer 股份有限公司；LX73 熒光倒置顯微鏡，日本Olympus 公司；VELOCITY14R 高速離心機(jī)，澳大利亞Dynamica 公司；NDA701 杜馬斯定氮儀，意大利VELP 公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品的制備 參照文獻(xiàn)[11]的方法制備玉米肽和玉米糖肽。 按蛋白基稱取配制10 mL，8 mg/mL 玉米糖肽和玉米肽溶液所需的樣品量，放于干凈小燒杯內(nèi)，于無菌條件下加入DMEM 培養(yǎng)基，用無菌移液器反復(fù)吸打使樣品充分溶解。 用0.22 μm 的無菌過濾器對(duì)玉米糖肽和玉米肽溶液進(jìn)行過濾除菌，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 LO2 細(xì)胞的培養(yǎng) 將解凍的LO2 細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到裝有5 mL DMEM 完全培養(yǎng)基 （含10%胎牛血清、1%青-鏈霉素雙抗）的25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，于37 ℃，5%CO2的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待LO2 細(xì)胞生長(zhǎng)融合度達(dá)到80%～90%時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。 選用20～30 代細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。

1.3.3 玉米糖肽對(duì)LO2 細(xì)胞的毒性試驗(yàn) 采用細(xì)胞存活率表征玉米糖肽是否對(duì)LO2 細(xì)胞產(chǎn)生毒性效應(yīng)，測(cè)定方法參照Li 等[12]描述的MTT 法，略有修改。 取96 孔板，每孔加入100 μL，密度為1×105cells/mL（以下試驗(yàn)均采用該密度）、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的LO2 細(xì)胞懸液，37 ℃培養(yǎng)24 h。 樣品組每孔加入100 μL 待測(cè)樣品溶液，使待測(cè)樣品的終質(zhì)量濃度分別為0.05，0.1，0.2，0.5，1，2，4，8 g/mL，對(duì)照組每孔加入100 μL DMEM 培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)6 h。培養(yǎng)結(jié)束后，吸棄孔內(nèi)液體，加入磷酸鹽緩沖液（0.01 mol/L，pH 7.2～7.4，下同）清洗細(xì)胞2 次，每孔再加入100 μL 磷酸鹽緩沖液和10 μL 終質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL 的MTT 溶液，37 ℃培養(yǎng)4 h。 吸棄孔內(nèi)液體，每孔加入150 μL 二甲基亞砜，將96孔板放在37 ℃，500 r/min 的微孔板振蕩儀上振蕩10 min。 用酶標(biāo)儀檢測(cè)樣品組和對(duì)照組每孔在570 nm 波長(zhǎng)處的吸光度值，按照公式（1）計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.3.4 玉米糖肽對(duì)酒精誘導(dǎo)損傷LO2 細(xì)胞的保護(hù)作用 按1.3.3 節(jié)的方法用24 孔板培養(yǎng)LO2細(xì)胞。 試驗(yàn)分為對(duì)照組、酒精組和樣品組，樣品組每孔中加入1 mL 樣品溶液，使樣品終質(zhì)量濃度為5，10，25，50 μg/mL，對(duì)照組和酒精組每孔加入1 mL DMEM 培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)6 h。吸棄孔內(nèi)液體，對(duì)照組每孔加入2 mL DMEM 培養(yǎng)基，酒精組和樣品組每孔加入2 mL 500 mmol/L 酒精溶液，37℃培養(yǎng)24 h。 收集LO2 培養(yǎng)液，用于檢測(cè)AST、ALT 和LDH 活力； 用500 μL 磷酸鹽緩沖液清洗細(xì)胞2 次，一部分平板按1.3.3 節(jié)的MTT 法測(cè)定酒精組和樣品組的細(xì)胞存活率，一部分平板用胰酶消化細(xì)胞，將細(xì)胞懸液收集于無菌離心管中。向細(xì)胞沉淀中加入高效RIPA 裂解液，4 ℃裂解30 min，10 000 r/min 離心5 min，收集上清液于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?取適量裂解液放置于冰水浴中，按照試劑盒說明書測(cè)定CAT、SOD、ADH、ALDH 和GSH-Px 活力以及MDA 和GSH 含量。

1.3.5 LO2 細(xì)胞內(nèi)ROS 含量的測(cè)定 參考Wang和Lee 等描述的方法[13-14]，略有修改。細(xì)胞培養(yǎng)、造模與1.3.4 節(jié)相同。培養(yǎng)結(jié)束后，將孔內(nèi)液體棄去，每孔用100 μL 磷酸鹽緩沖液清洗2 次，每孔加入100 μL 10 μmol/L 的2'，7'-二氯熒光黃雙乙酸鹽（2，7-Dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFHDA）探針溶液，37 ℃孵育20 min。將孔內(nèi)探針溶液棄去，用磷酸鹽緩沖液清洗2 次。 取一部分96 孔板在激發(fā)波長(zhǎng)485 nm，發(fā)射波長(zhǎng)530 nm 的條件下，測(cè)定孔內(nèi)熒光強(qiáng)度，并用公式（2）計(jì)算相對(duì)ROS 水平（%）；另取一部分孔板用熒光倒置顯微鏡觀察和記錄細(xì)胞內(nèi)綠色熒光的強(qiáng)度。

1.3.6 玉米糖肽對(duì)酒精誘導(dǎo)的LO2 細(xì)胞凋亡的拮抗作用 細(xì)胞培養(yǎng)、造模與1.3.4 節(jié)相同。 培養(yǎng)結(jié)束后，用不含EDTA 的0.25%胰酶消化細(xì)胞后，將細(xì)胞收集于無菌離心管中，用磷酸鹽緩沖液清洗細(xì)胞2 次，加入500 μL 結(jié)合液，輕輕重懸細(xì)胞，隨后分別加入5 μL Annexin V-FITC 和5 μL PI，輕輕混勻，室溫（20～25 ℃）下用鋁箔紙包上避光孵育10 min，在1 h 之內(nèi)用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞凋亡情況的檢測(cè)。

1.3.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 所有數(shù)據(jù)均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差” 表示。 試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2010和SPSS 19.0 進(jìn)行單因素方差分析，采用LSD 法進(jìn)行組間多重比較，P<0.05 為差異顯著性水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米糖肽對(duì)LO2 細(xì)胞的毒性效應(yīng)

細(xì)胞毒性分析是評(píng)估功能性食品生物安全性最重要的檢測(cè)方法之一。 將不同質(zhì)量濃度的玉米糖肽和玉米肽分別作用LO2 細(xì)胞6 h 后，采用MTT 法測(cè)定細(xì)胞存活率，以表征玉米糖肽和玉米肽是否對(duì)LO2 細(xì)胞產(chǎn)生毒性效應(yīng)，結(jié)果如圖1 所示。

由圖1 可以看出，與對(duì)照組相比，隨著玉米糖肽濃度的增加，LO2 細(xì)胞存活率呈逐漸降低的變化趨勢(shì)。 在0.05 mg/mL 質(zhì)量濃度下，玉米糖肽組的細(xì)胞存活率極顯著高于對(duì)照組（P<0.01），提示0.05 mg/mL 的玉米糖肽具有較好的促進(jìn)LO2 細(xì)胞增殖的作用；在0.1～8 mg/mL 質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，玉米糖肽處理后的LO2 細(xì)胞存活率與對(duì)照組相比差異不顯著（P>0.05），說明高質(zhì)量濃度的玉米糖肽沒有對(duì)LO2 細(xì)胞產(chǎn)生毒性效應(yīng)。 在0.05～4 mg/mL 質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，玉米肽組的細(xì)胞存活率與對(duì)照組相比差異不顯著（P>0.05），說明在此質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，玉米肽對(duì)LO2 細(xì)胞既無增殖作用，也無毒性效應(yīng)；在8 mg/mL 時(shí)，玉米肽組的LO2 細(xì)胞存活率為96.19%，與對(duì)照組相比顯著降低（P<0.05），與同質(zhì)量濃度玉米糖肽相比，經(jīng)糖基化修飾后，玉米肽的安全性得以改善。 一般情況下，當(dāng)細(xì)胞存活率小于對(duì)照組75%的樣品質(zhì)量濃度被認(rèn)為是有毒的[15]。 在本試驗(yàn)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，經(jīng)玉米糖肽和玉米肽處理6 h 后，LO2 細(xì)胞存活率均大于96%，說明玉米糖肽和玉米肽未對(duì)LO2 細(xì)胞產(chǎn)生毒副作用，是安全的生物功能因子。為了考察玉米糖肽在低質(zhì)量濃度條件下對(duì)酒精誘導(dǎo)損傷的LO2 細(xì)胞的保護(hù)效應(yīng)，在后續(xù)研究中玉米糖肽的質(zhì)量濃度選擇5～50 μg/mL。

圖1 不同質(zhì)量濃度的玉米糖肽和玉米肽對(duì)LO2 細(xì)胞存活率的影響Fig.1 Effect of corn glycopeptide and zein peptide at different mass concentrations on viability of LO2 cells

2.2 玉米糖肽對(duì)酒精誘導(dǎo)損傷的LO2 細(xì)胞存活率的影響

以GSH 為對(duì)照，研究玉米糖肽和玉米肽對(duì)酒精誘導(dǎo)損傷的LO2 細(xì)胞存活率的影響，結(jié)果如圖2 所示。

圖2 玉米糖肽對(duì)酒精誘導(dǎo)損傷的LO2 細(xì)胞存活率的影響Fig.2 The effect of corn glycopeptide on the viability of LO2 cells induced by alcohol

由圖2 可以看出，與對(duì)照組相比，模型組的細(xì)胞存活率極顯著降低，降低了42.71%，說明LO2細(xì)胞損傷模型構(gòu)建成功。與模型組相比，玉米糖肽以劑量依賴的方式顯著抑制了酒精的細(xì)胞毒性，使LO2 細(xì)胞存活率顯著提高，在質(zhì)量濃度為50 μg/mL 時(shí)，玉米糖肽使LO2 細(xì)胞存活率提高23.3%，極顯著高于同質(zhì)量濃度的玉米肽（P<0.01），顯著高于同質(zhì)量濃度的GSH（P<0.05），說明玉米糖肽、玉米肽和GSH 均顯示出針對(duì)酒精誘導(dǎo)損傷的LO2 細(xì)胞的保護(hù)作用，且玉米糖肽的保護(hù)效果更顯著。

2.3 玉米糖肽對(duì)酒精誘導(dǎo)損傷的LO2 細(xì)胞的保護(hù)效果

2.3.1 培養(yǎng)液中ALT 和AST 活力 細(xì)胞未受到刺激時(shí)，肝轉(zhuǎn)氨酶（AST 和ALT）只存在于細(xì)胞內(nèi)，當(dāng)細(xì)胞受到刺激時(shí)，細(xì)胞膜損傷，將AST 和ALT釋放到胞外，使培養(yǎng)液中轉(zhuǎn)氨酶活力升高[16]。 因此，AST 和ALT 的釋放是LO2 細(xì)胞損傷的主要指標(biāo)，酒精誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性也可以直接通過檢測(cè)培養(yǎng)液中的ALT 和AST 泄漏量進(jìn)行評(píng)估，結(jié)果如圖3 和圖4 所示。

圖3 玉米糖肽對(duì)酒精誘導(dǎo)損傷的LO2 細(xì)胞培養(yǎng)液中AST 活力的影響Fig.3 The effect of corn glycopeptide on the AST activity in culture medium of the LO2 cells induced by alcohol

圖4 玉米糖肽對(duì)酒精誘導(dǎo)損傷的LO2 細(xì)胞培養(yǎng)液中ALT 活力的影響Fig.4 The effect of corn glycopeptide on the ALT activity in culture medium of the LO2 cells induced by alcohol

如圖3 和4 所示，經(jīng)酒精處理后，LO2 細(xì)胞培養(yǎng)液中的ALT 和AST 活力分別增加了5.09 和8.35 倍，表明LO2 細(xì)胞膜和線粒體受到了嚴(yán)重破壞，這一結(jié)果也進(jìn)一步證實(shí)了500 mmol/L 酒精對(duì)LO2 細(xì)胞的毒性效應(yīng)。

與模型組相比，玉米糖肽、玉米肽和GSH 均以劑量依賴方式抑制了培養(yǎng)液中ALT 和AST 活力的升高，尤其是在25 μg/mL 質(zhì)量濃度下，玉米糖肽的干預(yù)使ALT 和AST 活力降低至正常水平，且ALT 的降低效果顯著高于同濃度的GSH，說明玉米糖肽對(duì)LO2 細(xì)胞的酒精性損傷具有保護(hù)效果，使ALT 和AST 泄漏量降低。

2.3.2 培養(yǎng)液中LDH 活力 LDH 存在于所有細(xì)胞中，一旦細(xì)胞質(zhì)膜受損，就會(huì)迅速釋放到細(xì)胞培養(yǎng)液中，因此，LDH 泄漏是細(xì)胞毒性的另一個(gè)經(jīng)典指標(biāo)[17]。 玉米糖肽對(duì)酒精誘導(dǎo)損傷的LO2 細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH 活力的影響如圖5 所示。

如圖5 所示，與對(duì)照組相比，模型組LDH 的活力極顯著增加（P<0.01），說明500 mmol/L 酒精的干預(yù)使LO2 細(xì)胞膜受損而促進(jìn)了LDH 的釋放。在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，玉米糖肽、玉米肽和GSH 的干預(yù)均可以抑制LDH 水平的升高，尤其是在50 μg/mL 時(shí)，三者均使LDH 活力恢復(fù)到正常水平，這可能與三者的自由基清除能力有關(guān)，維持了LO2 細(xì)胞膜的完整性，減少了LDH 的釋放。

圖5 玉米糖肽對(duì)酒精誘導(dǎo)損傷的LO2 細(xì)胞培養(yǎng)液中LDH 活力的影響Fig.5 The effect of corn glycopeptide on the LDH activity in culture medium of the LO2 cells induced by alcohol

2.3.3 細(xì)胞中MDA 含量 MDA 作為脂質(zhì)過氧化的主要終產(chǎn)物之一，可以與磷脂酰乙醇胺和蛋白質(zhì)交聯(lián)，產(chǎn)生脂褐素沉積而破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致細(xì)胞腫脹壞死[18]。因此，MDA 水平可以反映脂質(zhì)過氧化和細(xì)胞損傷的程度。 經(jīng)玉米糖肽干預(yù)后LO2細(xì)胞中MDA 的含量如圖6 所示。

圖6 玉米糖肽對(duì)酒精誘導(dǎo)損傷的LO2 細(xì)胞中MDA 含量的影響Fig.6 Effect of corn glycopeptide on MDA content in alcohol-induced LO2 cells

由圖6 可以看出，與對(duì)照組相比，模型組細(xì)胞內(nèi)的MDA 含量由3.64 nmol/mL 增加到6.43 nmol/mL，說明酒精氧化代謝產(chǎn)生的過量ROS 自由基使細(xì)胞膜上的不飽和脂肪酸氧化產(chǎn)生MDA，進(jìn)而產(chǎn)生細(xì)胞毒性。與模型組相比，經(jīng)玉米糖肽干預(yù)后，MDA 含量呈劑量依賴式降低，在蛋白質(zhì)量濃度為25 μg/mL 時(shí)，MDA 含量降低30.79%，比同質(zhì)量濃度的玉米肽和GSH 分別高18.97%和13.06%，說明在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，玉米糖肽降低細(xì)胞內(nèi)MDA 含量的效果優(yōu)于玉米肽和GSH，可能與玉米糖肽具有多重生物學(xué)活性有關(guān)，可以從多角度清除ROS 自由基而減少M(fèi)DA 的產(chǎn)生，使細(xì)胞內(nèi)的毒性環(huán)境大大降低。

2.3.4 細(xì)胞中酒精代謝酶ADH 和ALDH 活力經(jīng)玉米糖肽干預(yù)后測(cè)定酒精誘導(dǎo)損傷的LO2 細(xì)胞內(nèi)的ALDH 和ADH 活力，表征玉米糖肽對(duì)LO2細(xì)胞內(nèi)酒精氧化代謝能力的影響，結(jié)果如圖7 和8 所示。

圖7 玉米糖肽對(duì)酒精誘導(dǎo)損傷的LO2 細(xì)胞中ALDH 活力的影響Fig.7 Effect of corn glycopeptide on ALDH activity in alcohol-induced LO2 cells

圖8 玉米糖肽對(duì)酒精誘導(dǎo)損傷的LO2 細(xì)胞中ADH 活力的影響Fig.8 Effects of corn glycopeptide on the ADH activity in alcohol-induced LO2 cells

由圖7 可以看出，與對(duì)照組相比，模型組ALDH 活力極顯著降低（P<0.01），降低了29.94%，說明酒精氧化代謝產(chǎn)物乙醛會(huì)在LO2 細(xì)胞內(nèi)堆積，乙醛的增加會(huì)破壞線粒體功能而對(duì)LO2 細(xì)胞的毒性效應(yīng)增強(qiáng)，且乙醛加合物還會(huì)誘導(dǎo)免疫反應(yīng)以促進(jìn)肝細(xì)胞凋亡[19]。 與模型組相比，在質(zhì)量濃度為25 μg/mL 時(shí)，玉米糖肽和玉米肽的干預(yù)使ALDH 活力極顯著增加（P<0.01），而在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，GSH 對(duì)ALDH 活力沒有產(chǎn)生顯著性影響。因此，玉米糖肽可以通過提高ALDH 的活力而減輕乙醛誘導(dǎo)的LO2 細(xì)胞損傷。

由圖8 可以看出，與對(duì)照組相比，模型組ADH 活力降低21.66%，說明500 mmol/L 酒精作用LO2 細(xì)胞后，導(dǎo)致LO2 細(xì)胞氧化代謝酒精的能力下降，增加了酒精對(duì)LO2 細(xì)胞的毒性效應(yīng)。 與模型組相比，質(zhì)量濃度為25 μg/mL 的玉米糖肽和玉米肽使ADH 活力恢復(fù)至正常水平，而在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，GSH 對(duì)ADH 活力沒有產(chǎn)生顯著性影響。

綜合以上分析，玉米糖肽和玉米肽通過增強(qiáng)LO2 細(xì)胞內(nèi)的ADH 和ALDH 活力，加速了酒精氧化代謝，降低了酒精及其代謝產(chǎn)物對(duì)LO2 細(xì)胞的毒性效應(yīng)，而同濃度GSH 沒有此效果。 分析可能與玉米糖肽和玉米肽富含Glu、Leu、Ala 和Pro 有關(guān)（見參考文獻(xiàn)[10]），這4 種氨基酸的代謝產(chǎn)物可以使TCA 循環(huán)和線粒體呼吸鏈反應(yīng)增強(qiáng)，從NADH 到NAD+的再生速度加快，ADH 活力被上調(diào)[20-22]。 而GSH 作為天然抗氧化劑，只能從抗氧化的角度降低酒精代謝對(duì)細(xì)胞的氧化損傷，無加速酒精代謝的效果，進(jìn)一步說明增加ADH 和ALDH活力是玉米糖肽保護(hù)酒精誘導(dǎo)損傷的LO2 細(xì)胞的主要機(jī)制之一。

2.3.5 細(xì)胞中GSH 含量和抗氧化酶活力 玉米糖肽對(duì)酒精誘導(dǎo)損傷的LO2 細(xì)胞內(nèi)的GSH 含量以及CAT、SOD 和GSH-Px 活力的影響如表1 所示。

表1 玉米糖肽對(duì)損傷LO2 細(xì)胞中CAT、SOD、GSH-Px 活力和GSH 含量的影響Table 1 Effects of corn glycopeptide on CAT，SOD，GSH-Px activities and GSH content in alcohol-induced LO2 cells

由表1 可知，與對(duì)照組相比，經(jīng)500 mmol/L酒精誘導(dǎo)后，LO2 細(xì)胞內(nèi)GSH 含量以及CAT、SOD 和GSH-Px 活力均極顯著降低 （P<0.01），分別降低了34.86%，40.86%，39.06%，61.12%，說明500 mmol/L 酒精誘導(dǎo)LO2細(xì)胞產(chǎn)生大量ROS，ROS 抑制了抗氧化酶的活力，消耗了GSH，使細(xì)胞處于氧化應(yīng)激狀態(tài)。 于亞莉等[23]利用HepG2 細(xì)胞構(gòu)建酒精性損傷模型時(shí)也得到了相同的結(jié)果。

由表1 可以看出，與模型組相比，僅50 μg/mL的玉米糖肽使GSH 含量極顯著增加至正常水平；在質(zhì)量濃度為50 μg/mL 時(shí)，玉米糖肽使CAT 活力提高至正常水平，分別比同質(zhì)量濃度的玉米肽和GSH 高22.68%和23.37%； 在質(zhì)量濃度為25 μg/mL 時(shí)，玉米糖肽組的SOD 活力比酒精組高45.66%，分別比同質(zhì)量濃度玉米肽和GSH 高2.73%和4.35%。

由表1 還可以看出，在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，玉米糖肽、玉米肽和GSH 均可以極顯著提高酒精誘導(dǎo)損傷的LO2 細(xì)胞內(nèi)的GSH-Px 活力，且在質(zhì)量濃度為50 μg/mL 時(shí)，玉米糖肽的提高效果與同質(zhì)量濃度GSH 相當(dāng)，極顯著高于同質(zhì)量濃度的玉米肽。 GSH-Px 清除H2O2時(shí)需要GSH 巰基的參與，GSH 組的外源GSH 供應(yīng)充足，故GSH-Px 活力較高，而經(jīng)糖基化修飾后，玉米肽提供氫和電子的能力增強(qiáng)，故玉米糖肽清除H2O2的能力高于玉米肽，減少了抗氧化酶系的損耗，使GSH-Px 活力提高。

綜合以上分析，玉米糖肽對(duì)酒精誘導(dǎo)損傷的LO2 細(xì)胞內(nèi)的抗氧化酶系和GSH 有積極調(diào)節(jié)作用，說明玉米糖肽可能會(huì)直接或間接參與調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)與ROS 代謝及氧化應(yīng)激相關(guān)信號(hào)通路的表達(dá)，如Keap1-Nrf2-ARE 信號(hào)通路等，進(jìn)而有效改善酒精引起的LO2 細(xì)胞損傷。 因此，玉米糖肽對(duì)酒精誘導(dǎo)損傷的LO2 細(xì)胞的保護(hù)作用也與其清除由酒精代謝產(chǎn)生的自由基的能力有關(guān)。

2.3.6 細(xì)胞內(nèi)的ROS 含量 采用DCFH-DA 探針法測(cè)定LO2 細(xì)胞內(nèi)ROS 的水平，玉米糖肽預(yù)處理對(duì)酒精誘導(dǎo)損傷的LO2 細(xì)胞內(nèi)綠色熒光強(qiáng)度的影響如圖9 所示，通過相對(duì)熒光強(qiáng)度計(jì)算的ROS 相對(duì)含量如圖10 所示。

圖9 熒光顯微鏡下觀察LO2 細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度的變化（400×）Fig.9 The changes of fluorescence intensity in LO2 cells using a fluorescence microscope （400×）

圖10 玉米糖肽對(duì)酒精誘導(dǎo)損傷的LO2 細(xì)胞內(nèi)ROS 含量的影響Fig.10 Effects of corn glycopeptide on the ROS content in alcohol-induced LO2 cells

由圖9 可以看到，與對(duì)照組相比，500 mmol/L酒精處理組細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，說明在酒精作用下，細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶活力降低和GSH 含量減少，脂質(zhì)過氧化產(chǎn)生的MDA 造成線粒體膜通透性增大，線粒體內(nèi)的ROS 進(jìn)入細(xì)胞，LO2 細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激。結(jié)合2.3.5 節(jié)的結(jié)果，經(jīng)玉米糖肽、玉米肽和GSH 預(yù)處理后，LO2 細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶如SOD、CAT、GSH-Px 活力增加，ROS 含量降低，細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度也呈劑量依賴式減弱。

如圖10 所示，與對(duì)照組相比，模型組ROS 含量顯著增加（P<0.05），增加了25.95%，而與模型組相比，玉米糖肽、玉米肽和GSH 的干預(yù)使ROS 含量顯著降低，尤其是在質(zhì)量濃度為5 μg/mL 時(shí)，玉米糖肽處理使ROS 含量降低15.9%，效果高于同質(zhì)量濃度的GSH 和玉米肽，說明玉米糖肽通過增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶活力和GSH 含量而加速ROS的清除，減輕細(xì)胞的氧化性損傷，達(dá)到保護(hù)LO2細(xì)胞的效果。

2.3.7 玉米糖肽對(duì)酒精誘導(dǎo)的LO2 細(xì)胞凋亡的影響 目前，肝損傷伴隨著細(xì)胞凋亡的觀點(diǎn)已被廣泛接受，細(xì)胞凋亡在酒精性肝病進(jìn)展中起關(guān)鍵作用[24-25]。 因此，抑制細(xì)胞凋亡可以減慢甚至逆轉(zhuǎn)酒精性肝病的發(fā)展。 選擇50 μg/mL 玉米糖肽預(yù)處理LO2 細(xì)胞，用500 mmol/L 酒精誘導(dǎo)LO2 細(xì)胞損傷，通過Annexin V-FITC/PI 雙重染色后用流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果如圖11 所示。

圖11 玉米糖肽對(duì)酒精誘導(dǎo)的LO2 細(xì)胞凋亡情況的影響Fig.11 The effect of corn glycopeptide on the LO2 cells apoptosis induced by alcohol

如圖11 所示，與對(duì)照組相比，添加500 mmol/L酒精導(dǎo)致早期凋亡細(xì)胞和死亡細(xì)胞的百分比大大增加。 研究表明，大多數(shù)形式的細(xì)胞凋亡是通過ROS 誘導(dǎo)線粒體膜破壞觸發(fā)的[26]，結(jié)合2.3.5 節(jié)的試驗(yàn)結(jié)果，酒精誘導(dǎo)的ROS 過量產(chǎn)生及線粒體損傷是LO2 細(xì)胞凋亡的誘發(fā)因素。 與酒精組相比，劑量為50 μg/mL 玉米糖肽、 玉米肽和GSH 的干預(yù)均能顯著抑制早期細(xì)胞凋亡，且抑制效果的順序?yàn)橛衩滋请?玉米肽>GSH，說明玉米糖肽表現(xiàn)出良好的抗酒精誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的效果，也說明其保護(hù)肝臟的活性與抑制肝細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。

研究表明，玉米肽可以通過其抗氧化活性逆轉(zhuǎn)與細(xì)胞凋亡相關(guān)的蛋白質(zhì)表達(dá) （如Bax、Caspase-3 等）而拮抗肝細(xì)胞的凋亡[27-29]。 D-氨基葡萄糖的共價(jià)結(jié)合改善了玉米肽的生物活性，因此，玉米糖肽也可能是通過逆轉(zhuǎn)與細(xì)胞凋亡相關(guān)的蛋白質(zhì)表達(dá)而拮抗LO2 細(xì)胞的凋亡。 另外，結(jié)合2.3.3節(jié)的試驗(yàn)結(jié)果，玉米糖肽還可以通過增加ALDH活力而減少乙醛的生成，進(jìn)而抑制由乙醛介導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡途徑。

綜合以上分析，玉米糖肽對(duì)酒精誘導(dǎo)損傷的LO2 細(xì)胞的保護(hù)作用，是其促進(jìn)酒精代謝、增強(qiáng)抗氧化活力以及抑制肝細(xì)胞凋亡的綜合效果，也正是這種多途徑的綜合效果，使玉米糖肽的保護(hù)效果優(yōu)于陽性對(duì)照GSH。

3 結(jié)論

為了研究開發(fā)拮抗酒精性肝損傷的天然、低毒副作用、 多途徑的肝保護(hù)劑，本試驗(yàn)通過構(gòu)建LO2 細(xì)胞酒精性損傷模型，在細(xì)胞水平上研究了玉米糖肽干預(yù)對(duì)損傷LO2 細(xì)胞的保護(hù)效應(yīng)。 研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)50 μg/mL 玉米糖肽的干預(yù)對(duì)酒精誘導(dǎo)損傷的LO2 細(xì)胞具有保護(hù)作用，是其促進(jìn)酒精代謝、 增強(qiáng)抗氧化活力以及抑制肝細(xì)胞凋亡的綜合效果。在此基礎(chǔ)上，可以采用分子生物學(xué)及蛋白質(zhì)組學(xué)方法深入研究玉米糖肽拮抗酒精性肝細(xì)胞損傷的分子機(jī)制。綜上，玉米糖肽可能作為一種潛在的功能性食品或膳食補(bǔ)充劑來保護(hù)酒精性肝損傷。