谷物蛋白類α-淀粉酶抑制劑及其功能特性的研究進(jìn)展

劉恩澤，張琦，王秋菊，潘自強(qiáng)，鄔曉勇

（成都大學(xué)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部雜糧加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610106）

α-淀粉酶抑制劑（α-amylase inhibitor，α-AI）屬于糖苷酶抑制劑的一種，是具有抑制α-淀粉酶作用的生物活性物質(zhì)，能與α-淀粉酶分子上的相對(duì)應(yīng)的部位結(jié)合并改變?chǔ)?淀粉酶分子構(gòu)象，使α-淀粉酶的活性降低或者喪失[1]，國外稱之為“starch blocker”[2]。全球第 11大死因的糖尿病是一種復(fù)雜的慢性病，據(jù)調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，2019年，全球共有4.63億人患有這種以血糖水平升高（高血糖）為特征的代謝紊亂[3]。其中，2型糖尿?。╠iabetes mellitus type 2，T2DM）占糖尿病總病例的90%以上。α-AI能夠抑制人體內(nèi)α-淀粉酶的作用，進(jìn)而可以抑制體內(nèi)的淀粉水解過程，從而降低血糖水平，故α-AI在治療糖尿病以及減肥等方面具有極大的潛力[4]；然而，由于商業(yè)化合成的α-AI有一定的副作用，如引起腹脹、腹瀉和腹痛等胃腸道不良癥狀[5]，因此，天然獲取的α-AI因其副作用小以及有效性高等特點(diǎn)將會(huì)備受青睞。

α-AI可以分為蛋白類和非蛋白類抑制劑[6]，不同來源的抑制劑，其物理化學(xué)特性也不同。有研究表明[7]，植物種子是蛋白類α-AI的主要來源。谷物是谷類植物或糧食作物的總稱，其涵蓋的范圍較廣，主要是植物種子和果實(shí)，包括大米、小麥、小米、大豆等其它雜糧，在食物金字塔中占很大比例，是人類飲食中的主要能量來源[8]。谷物含有豐富的淀粉、蛋白質(zhì)等，有研究表明，淀粉含量越高，其蛋白類α-AI的含量也越高[9]，因此，谷物是蛋白類α-AI的良好來源。有關(guān)淀粉酶抑制劑的研究距今已有80余年的歷史，早在1933年Franco等[10]從小麥中分離得到了蛋白類α-AI。隨著不斷研究谷物對(duì)于人體的有益作用，對(duì)于谷物中α-AI的研究也逐漸深入。本文對(duì)谷物蛋白類α-AI的分離純化、活性檢測(cè)方法以及功能特性等方面進(jìn)行了總結(jié)。

1 α-淀粉酶抑制劑的概述

1.1 α-淀粉酶抑制劑的類型

目前，大多數(shù)α-AI已從微生物源（主要集中在鏈霉菌屬）、植物源（植物中普遍存在，尤其在谷物種子中含量豐富）獲得，少數(shù)來自哺乳動(dòng)物[11]，同時(shí)還可以通過化學(xué)合成獲得。天然存在的α-AI分為3種類型[12]，分別為微生物產(chǎn)生帶一個(gè)寡生物胺單位的含氮碳水化合物；微生物產(chǎn)多肽，如paim（來自微生物的豬胰腺α-AI）和 Haim（微生物起源人 α-AI）；在谷類、豆類以及其它較高等植物中被發(fā)現(xiàn)的大分子蛋白類α-AI。

1.2 蛋白類α-淀粉酶抑制劑的分類

從蛋白序列相似度以及三級(jí)結(jié)構(gòu)來看，目前已鑒定出7類天然蛋白類α-AI，其中6類是從谷物中提取[13]，即 the knottin-like type，the γ-thionin-like type，the cereal type，the kunitz type，the thaumatin-like type，the lectin-like type；另一類是微生物代謝物[14]，即the microbial type。上述7類抑制劑的分子量從3 kDa到23 kDa不等，表明該類型抑制劑具有豐富的結(jié)構(gòu)和功能多樣性。

1.3 α-淀粉酶抑制劑與α-淀粉酶的作用方式

1.3.1 互補(bǔ)型

α-淀粉酶抑制劑占據(jù)靶酶的識(shí)別位點(diǎn)與結(jié)合部位，并與靶酶的活性基團(tuán)形成氫鍵進(jìn)而封閉靶酶的活性中心[15]。如大麥的α-AI，該抑制劑為一種雙功能淀粉酶抑制劑，既能夠抑制植物內(nèi)源性的α-淀粉酶，又可以抑制昆蟲來源的α-淀粉酶。

1.3.2 相伴型

α-淀粉酶抑制劑與靶酶分子并列相伴，并在與靶酶的活性基團(tuán)形成氫鍵的同時(shí)，封鎖靶酶與底物的結(jié)合部位[16]。小麥、小米和大米等中存在此類抑制劑，該類抑制劑可以抑制哺乳、昆蟲以及細(xì)菌中的α-淀粉酶。

1.3.3 覆蓋型

以類似線性分子的網(wǎng)絡(luò)形式覆蓋到靶酶活性中心附近的區(qū)域上，從而阻止靶酶的活性中心與底物接觸而使靶酶失活[17]。豆類植物存在此類抑制劑，該類抑制劑可以抑制來源于哺乳、昆蟲以及真菌中的α-淀粉酶。

2 谷物蛋白類α-淀粉酶抑制劑的分離純化

蛋白質(zhì)以及多肽的純化普遍采用柱層析法[18]。親和層析、凝膠過濾層析和離子交換層析是最常用的蛋白以及酶的純化方法[19-20]。根據(jù)原料特性的不同，分離方法也有所不同，圖1是從植物中分離蛋白類淀粉酶抑制劑的過程。隨著新興技術(shù)的不斷發(fā)展，谷物蛋白類α-AI的分離純化方法也逐漸多樣化，表1介紹了谷物蛋白類α-AI不同的分離純化方法。

圖1 植物蛋白類淀粉酶抑制劑的分離純化步驟Fig.1 Separation and purification steps of plant protein amylase inhibitors

表1 谷物蛋白類α-淀粉酶抑制劑的分離純化方法比較Table 1 Comparison of separation and purification methods of cereal protein α-amylase inhibitors

2.1 親和分離法

2.1.1 親和沉淀法

通過將配體偶聯(lián)到水溶性聚合物來形成生物偶聯(lián)物，配體-聚合物復(fù)合物選擇性地結(jié)合粗提液中的目標(biāo)蛋白，通過簡單改變環(huán)境（如：pH值、溫度、離子強(qiáng)度或添加某些試劑）從溶液中沉淀出蛋白質(zhì)-聚合物復(fù)合物。最后，再將所需的蛋白質(zhì)從聚合物中解離[21]。Kumar等[22]提出了1種基于熱敏共聚物固定化金屬親和沉淀的從小麥粉中分離純化蛋白類α-AI的方法，結(jié)果表明：1-乙烯基咪唑與N-異丙基丙烯酰胺聚合得到的聚合物具有金屬離子與蛋白質(zhì)抑制劑的特異性相互作用，將聚合物溶解在咪唑緩沖液中用鹽誘導(dǎo)沉淀，從該聚合物中回收了單一的蛋白類α-AI，回收率為89%，其分子量為14 000 kDa。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，抑制劑與Cu（II）-聚合物共軛化合物的結(jié)合取決于共聚物中Cu（II）濃度和蛋白質(zhì)的濃度。Bhat等[23]利用蛋白樣多肽融合到蛋白單一的Z型結(jié)構(gòu)域中，從復(fù)雜混合物中親和沉淀純化得到了單克隆抗體，最終單克隆抗體純度大于95%，回收率大于80%。

2.1.2 親和層析法

將具有特殊結(jié)構(gòu)的親和分子制成固相吸附劑置于層析柱中，蛋白混合液通過層析柱時(shí)，與固相吸附劑有親和能力的蛋白質(zhì)被吸附并滯留在層析柱中，其它雜蛋白直接流出，再選用適當(dāng)?shù)南疵撘?，改變結(jié)合條件將被結(jié)合的目標(biāo)蛋白洗脫下來[24]。El-lat[25]通過硫酸銨分級(jí)沉淀和DEAE-Sephadex G-25柱層析從兩種小麥中分離純化得到分子量為16、24 kDa的蛋白類α-AI，分離出的抑制劑在 40 °C～50 °C 時(shí)活性最高，在80°C以下穩(wěn)定，并且在較寬的pH值范圍內(nèi)（2～12）穩(wěn)定。Maghsoudi等[26]采用乙醇沉淀和殼聚糖珠柱親和層析的方法從白豆中純化得到了富含蛋白類α-AI的組分，該組分對(duì)豬胰腺α-淀粉酶具有較強(qiáng)的抑制活性且具有明顯的熱穩(wěn)定性，即使在60℃孵育30 min，其抑制率仍可達(dá)80%左右。Bharadwaj等[27]通過緩沖液提取、硫酸銨分級(jí)分離、CM-纖維素和sephadex G-75層析從浸泡過的黧豆種子中純化得到了蛋白類α-AI。純化后的抑制劑特異性抑制活性為61.18，純度為36.68倍，得率為14.01%。同時(shí)，該抑制劑對(duì)人唾液α-淀粉酶活性有抑制作用且具有較好的熱穩(wěn)定性，在65℃時(shí)仍可保持80.50%的活性。

2.2 色譜法

色譜法是待分離的物質(zhì)在固定相和流動(dòng)相之間分配平衡的過程，利用不同物質(zhì)在兩相之間分配不同的特點(diǎn)，因不同物質(zhì)隨流動(dòng)相運(yùn)動(dòng)速度各不相同，使混合物中的不同組分隨著流動(dòng)相的運(yùn)動(dòng)在固定相上完成相互分離[28]。Sun等[29]利用離子交換和排阻色譜相結(jié)合的方法，從大麥中純化獲得分子量為22 kDa的α-淀粉酶/枯草桿菌素抑制劑，該抑制劑在pH6、50℃的條件下具有最大的抑制活性。Meera等[30]利用離子交換色譜從Leucas aspera中分離純化到分子量為28 kDa蛋白類 α-AI，該抑制劑在 pH6～7、溫度 30℃～50℃范圍內(nèi)對(duì)α-淀粉酶活性較高，有望成為抗糖尿病藥物。Wang等[31]采用硫酸銨沉淀、離子交換層析和反相液相色譜分離純化得到鷹嘴豆成熟種子中的蛋白質(zhì)類α-AI，它對(duì)多種α-淀粉酶均有抑制活性，且對(duì)各種α-淀粉酶的抑制活性受溫度、pH值、孵育時(shí)間、底物濃度和抑制劑濃度的影響較大。

2.3 無機(jī)吸附法

有研究人員[32]基于無機(jī)吸附劑Zn（OH）2的應(yīng)用，開發(fā)了菜豆蛋白類α-AI純化的新方法。研究發(fā)現(xiàn)，Zn（OH）2與大多數(shù)可溶性菜豆蛋白結(jié)合，而將α-AI留在溶液中。Zn（OH）2質(zhì)量分?jǐn)?shù)在1%～2%時(shí)，沉淀結(jié)合的菜豆α-AI明顯較低，而Zn（OH）2質(zhì)量分?jǐn)?shù)在4%濃度范圍內(nèi)，菜豆中大約98%的蛋白質(zhì)與沉淀相結(jié)合，未與Zn（OH）2結(jié)合的富含α-AI的組分再經(jīng)過二乙氨基乙基柱層析和凝膠過濾層析進(jìn)一步純化。該方法比其他提純方法更快速。

2.4 雙水相萃取、三相分配法

雙水相萃?。╝queous two phase extraction，ATPE）是一種新型的液-液分離方法，是利用組分在兩水相之間分配系數(shù)的不同而進(jìn)行分離提純的技術(shù)[33]。陳曉春等[34]采用新型聚乙二醇/果糖-1，6-二磷酸三鈉雙水相體系從小麥粉中分離純化α-AI。該體系由聚乙二醇濃度、果糖-1，6-二磷酸三鈉鹽濃度、體系pH值等因素共同影響α-AI的分布。在頂相中加入11.7%（質(zhì)量比）的聚乙二醇2000和19%（質(zhì)量比）的果糖-1，6-二磷酸三鈉，最終得到的α-AI純度為3.2倍，回收率為79%。該結(jié)果證明，用新型聚乙二醇/果糖-1，6-二磷酸三鈉雙水相體系純化蛋白類α-AI的可行性。張佰鵬等[35]利用聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）/（NH4）2SO4雙水相體系萃取白蕓豆中的α-AI，當(dāng)PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%，（NH4）2SO4的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 13.3%，NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.003%時(shí)，分配系數(shù)、相比和活力回收率分別為4.40，0.57，71.41%。并且其還討論了當(dāng) PEG、（NH4）2SO4分別一定時(shí)對(duì)α-AI提取的影響。三相分配（threephase partitioning，TPP）是一種新興的生物分離技術(shù)，它采用了鹽析法、等離子沉淀法、共溶劑沉淀法、蛋白質(zhì)的滲透和共滲沉淀法等多種技術(shù)原理結(jié)合的集體操作[36]。Saxena[37]等采用TPP技術(shù)從龍爪稷粗提物中分離純化得到一種具有雙功能蛋白類α-淀粉酶/胰蛋白酶抑制劑。該方法包括在粗提物中加入硫酸銨，然后再加入叔丁醇。在硫酸銨存在下，叔丁醇的加入將蛋白質(zhì)推出溶液，在上層有機(jī)層和下層水之間形成界面沉淀層。此過程分為兩步，在第一、二步純化過程中，淀粉酶抑制劑純化分別達(dá)到8.9倍和20.1倍，回收率分別為83%和39.5%。Hafid等[38]利用TPP技術(shù)從番木瓜中提取分離到分子量為23.2 kDa的木瓜蛋白酶。試驗(yàn)結(jié)果表明，在 pH 為 6.0、溫度為 25 ℃、（NH4）2SO4用量為40%、粗提物∶叔丁醇為1.0∶0.75的條件下，TPP純化倍數(shù)為11.45倍，活力回收率為134%。在pH 6.0，溫度為50°C時(shí)酶活最大，Km和Vmax參數(shù)的最大值分別為10.83 mg/mL和33.33 U/mL。

2.5 蛋白水解法

蛋白類α-AI也含有小分子肽，這些小分子肽主要是通過蛋白酶水解來提取分離的。在水解過程中內(nèi)肽酶首先發(fā)揮作用，其次是外肽酶（主要是三肽基和二肽基肽酶、氨基肽酶和羧肽酶）發(fā)揮作用。上述過程產(chǎn)生的多肽可以通過胃腸進(jìn)一步消化，產(chǎn)生序列和長度不等的多肽，其中一些多肽與生物活性有關(guān)[39]。當(dāng)提取蛋白質(zhì)時(shí)，堿法溶解后用等電點(diǎn)沉淀法使其沉淀，大約90%～95%的蛋白質(zhì)可以被分離出來。利用不同的蛋白酶來水解蛋白質(zhì)提取生物活性肽，并利用不同截留分子量的超濾膜分離得到不同的多肽組分，同時(shí)測(cè)定各水解多肽組分對(duì)α-淀粉酶的抑制率來確定活性組分分布，最后結(jié)合凝膠色譜法、離子交換色譜法等來進(jìn)行相應(yīng)的純化[40]。Rang等[41]提出了一種從白菜豆種子得到蛋白類α-AI的酶解制備方法，該方法主要包括熱處理、酶解、等電沉淀和70%乙醇沉淀等過程，用風(fēng)味酶酶解后將酶解液進(jìn)行等電點(diǎn)沉淀，最終該方法的雜蛋白損失和純化倍數(shù)雖較低（分別為85.84%和4.74），但α-AI活性得率（67.12%）遠(yuǎn)高于色譜法，這對(duì)于實(shí)際應(yīng)用至關(guān)重要，同時(shí)該方法還可以進(jìn)行擴(kuò)展。Uraipong[42]利用4種蛋白酶對(duì)米糠蛋白進(jìn)行酶解，結(jié)合超濾以及離子交換層析進(jìn)行分離活性組分，最終發(fā)現(xiàn)利用蛋白水解后活性顯著增強(qiáng)，且活性與蛋白水解度呈正相關(guān)。堿性蛋白酶以及復(fù)合蛋白酶酶解后的水解物對(duì)于α-淀粉酶的抑制活性與標(biāo)準(zhǔn)抗糖尿病藥物阿卡波糖相當(dāng)，有望作為一種抗糖尿病的膳食或營養(yǎng)補(bǔ)充劑。Olusegun等[43]利用蛋白酶對(duì)豇豆種子進(jìn)行酶解，α-淀粉酶抑制實(shí)驗(yàn)表明，胃蛋白酶水解物具有較好的抑制活性[IC50=（0.127±0.012）mg/mL]，胃蛋白酶水解物表現(xiàn)出較高的結(jié)合親和力（ki=0.089 mg/mL）。

2.6 超臨界二氧化碳萃取法

超臨界二氧化碳萃取法是利用超臨界狀態(tài)下的二氧化碳對(duì)某些特殊天然產(chǎn)物具有特殊的溶解作用，利用超臨界二氧化碳的溶解能力與其密度之間的關(guān)系，即利用壓力和溫度對(duì)超臨界二氧化碳溶解能力的影響而進(jìn)行的[44]。米切爾·什科普等[45]將研磨后的白菜豆在真空壓力條件下，利用超臨界二氧化碳對(duì)其進(jìn)行提取除雜，同時(shí)留下豆塊，然后用去離子水保溫該豆塊，得到包含第一固體組分和第一液體組分的第一白菜豆懸浮液。將上述兩組分分離，隨后用去離子水保溫第一固體組分，即得到第二白菜豆懸浮液。將第二固體、液體組分分離，然后使第一和第二液體組分混合以獲得最終液體組分溶液。對(duì)最終液體組分溶液進(jìn)行熱交換而獲得濃縮白菜豆提取物，對(duì)濃縮白菜豆提取物進(jìn)行干燥，即可獲得純化α-AI。Arumugham等[44]利用超臨界二氧化碳作為溶劑從乳清分離蛋白中分離出α-乳清蛋白和β-乳球蛋白蛋白。結(jié)果表明，最佳的制備條件為壓力8 MPa和溫度55℃。需要注意的是，利用超臨界二氧化碳萃取時(shí)要考慮到溫度和壓力對(duì)蛋白類物質(zhì)的活性以及結(jié)構(gòu)可能產(chǎn)生的影響。

現(xiàn)階段，對(duì)于蛋白類α-AI的分離純化方法不斷涌現(xiàn)，雖然植物蛋白類淀粉酶抑制劑與谷物蛋白類α-AI方法相似，但應(yīng)根據(jù)物料特性、溶解度以及等電點(diǎn)等特性進(jìn)行分離純化，可以將以上介紹的方法有效結(jié)合使用，但在純化過程中，需要將蛋白類α-AI的活性作為分離純化的重要參考指標(biāo)之一。

3 谷物蛋白類α-淀粉酶抑制劑的檢測(cè)

目前，對(duì)于α-AI的檢測(cè)項(xiàng)目主要包括其活性、含量純度及相對(duì)分子質(zhì)量等。蛋白質(zhì)類α-AI的含量、純度和相對(duì)分子質(zhì)量都可依照蛋白質(zhì)的測(cè)定方法進(jìn)行，其活性可以通過直接測(cè)定淀粉水解還原糖生成量以及間接測(cè)定淀粉剩余量來表征?，F(xiàn)階段，蛋白類α-AI抑制活性的測(cè)定方法常用碘比色法和3，5-二硝基水楊酸比色法。隨著現(xiàn)代新興技術(shù)的不斷發(fā)展，一些快速簡便的方法被發(fā)現(xiàn)并應(yīng)用于蛋白類α-AI的篩選檢測(cè)，如：高效陰離子交換色譜-脈沖安培檢測(cè)（highperformance anion-exchange chromatography coupled with pulsed amperometric detection，HPAEC-PAD）法[46]、電泳法[47]、微孔法[48]等。

3.1 直接法

直接法是通過測(cè)定試驗(yàn)組（α-淀粉酶+淀粉，添加α-AI）與對(duì)照組（α-淀粉酶+淀粉，不添加 α-AI）各自反應(yīng)過后還原糖的生成量來表征α-AI的活性。試驗(yàn)組還原糖生成量越少，表明α-AI抑制α-淀粉酶水解淀粉的作用越強(qiáng)。

3.1.1 高效陰離子交換色譜-脈沖安培檢測(cè)法

高效陰離子交換色譜-脈沖安培檢測(cè)法（HPAECPAD）是以離子交換樹脂為固定相，氫氧化鈉或氫氧化鈉-醋酸為流動(dòng)相，在淀粉酶抑制劑存在或不存在的情況下，測(cè)定淀粉酶對(duì)淀粉作用產(chǎn)生單糖的含量。Mosca等[46]采用HPAEC-PAD法對(duì)膳食補(bǔ)充劑菜豆中α-AI的含量和活性進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果證明該方法是一種靈敏度高，準(zhǔn)確性好的快速檢測(cè)方法。Joyce等[49]以HPAEC-PAD法快速量化通過內(nèi)切木聚糖酶消化釋放的阿拉伯木聚糖，并表征4種冷季型牧草中的阿拉伯木聚糖結(jié)構(gòu)，并對(duì)濃度范圍、檢測(cè)限、定量限、保留時(shí)間和相對(duì)響應(yīng)因子等方面進(jìn)行方法驗(yàn)證。

3.1.2 3，5-二硝基水楊酸（3，5-dinitrosalicylic acid，DNS）比色法

3，5-二硝基水楊酸（DNS）比色法：試驗(yàn)組加入可溶性淀粉、α-淀粉酶以及α-AI，對(duì)照組不加α-AI，其他條件一致，反應(yīng)完成后加入3，5-二硝基水楊酸，沸水浴后取出反應(yīng)液室溫冷卻，測(cè)定吸光度值。該方法調(diào)整抑制劑溶液及α-淀粉酶溶液的濃度或用量，吸光度在0.4～0.7為宜。趙蓉等[50]建立DNS比色法測(cè)定從白蕓豆中分離純化α-AI活性的方法。最終確定在470 nm，2 mL DNS試劑以及反應(yīng)時(shí)間5 min條件下結(jié)果最好。該方法平均回收率為99.95%（n=9），精密度實(shí)驗(yàn)RSD=1.01%。該方法具有簡便、快捷、重復(fù)性良好等特點(diǎn)，適用于常規(guī)α-AI的測(cè)定。

3.1.3 微孔法

3，5-二硝基水楊酸（DNS）微孔法是基于DNS（3，5-二硝基水楊酸）比色法之上，對(duì)于檢測(cè)波長、顯色劑用量、顯色時(shí)間等因素進(jìn)行優(yōu)化，該方法可大幅度降低試劑和時(shí)間的消耗，簡化實(shí)驗(yàn)操作，更快速地對(duì)于α-AI進(jìn)行常規(guī)檢測(cè)。鐘穎穎等[51]利用該方法對(duì)白蕓豆中的α-AI進(jìn)行了活性測(cè)定，最佳試驗(yàn)條件為測(cè)定波長 482 nm、DNS 用量 80 μL、反應(yīng)時(shí)間 15 min、靜置時(shí)間10 min。Negrulescu等[52]提出了一種基于DNS比色，適用于微量滴定板，并在改進(jìn)的微波處理水浴中檢測(cè)了蜂蜜樣品及葡萄酒樣品還原糖的方法。該方法結(jié)果準(zhǔn)確，減少了檢測(cè)時(shí)間和試劑用量，降低了檢測(cè)的整體成本，且可同時(shí)分析多個(gè)樣品，是一種高通量的檢測(cè)技術(shù)。

3.1.4 血糖監(jiān)測(cè)法

消化道中α-AI的存在可以延緩淀粉的消化和吸收，這對(duì)緩解餐后血糖升高具有重要意義。α-AI的體內(nèi)活性可以通過腸道和血液中的葡萄糖水平來表征。研究人員[53]在一項(xiàng)研究中，采用腸腔外翻來測(cè)量小腸對(duì)葡萄糖吸收的方法，去除脂肪和腸系膜碎片后，在腸腔內(nèi)加入葡萄糖和抑制劑進(jìn)行體外培養(yǎng)，并在不同采樣時(shí)間測(cè)定血糖水平。結(jié)果表明，分子量小于1 kDa的蛋白質(zhì)水解物抑制了α-淀粉酶活性，降低了小腸對(duì)葡萄糖的攝取。Mojica等[54]利用高血糖大鼠模型，通過飼喂黑豆提取的蛋白類α-AI，最后通過測(cè)量大鼠血液中的血糖水平來評(píng)價(jià)黑豆α-AI對(duì)大鼠血糖的調(diào)控作用。

3.2 間接法

間接法是通過測(cè)定試驗(yàn)組（α-淀粉酶+淀粉，添加α-AI）與對(duì)照組（α-淀粉酶+淀粉，不添加 α-AI）各自反應(yīng)后，淀粉的剩余量來表征α-AI的活性。試驗(yàn)組淀粉剩余量越多，表明α-AI抑制α-淀粉酶水解淀粉的作用越強(qiáng)。

3.2.1 碘-淀粉比色法

試驗(yàn)組加入可溶性淀粉、α-淀粉酶以及α-AI，對(duì)照組不加α-AI，空白組不加α-淀粉酶和α-AI，其他條件一致，根據(jù)吸光度的差異計(jì)算抑制劑的相對(duì)活度。謝雨杉等[55]利用此方法通過對(duì)淀粉液濃度和反應(yīng)溫度系列試驗(yàn)條件進(jìn)行研究，確定α-AI的碘-淀粉比色法的最佳試驗(yàn)條件為：淀粉液濃度2.5%，反應(yīng)最適溫度40℃。此方法精密度為RSD=1.82%，平均回收率為99.03%（n=6）。由上可見，該檢測(cè)方法簡便、快捷、重復(fù)性好，可用于α-AI活性的常規(guī)檢測(cè)。

3.2.2 電泳法

電泳法是基于提取蛋白在含有淀粉的凝膠上進(jìn)行電泳分離，然后在α-淀粉酶溶液中孵育后凝膠電泳檢測(cè)α-AI，最終通過碘與未消化的淀粉結(jié)合的染色方法顯示α-AI。Fossum等[56]利用淀粉-聚丙烯酰胺凝膠對(duì)生物材料中淀粉酶抑制劑進(jìn)行檢測(cè)，該方法比Bernfeld法更加方便。Giri等[57]建立了一種利用凝膠電泳分離蛋白質(zhì)類淀粉酶抑制劑的方法，該方法可以篩選單獨(dú)的淀粉酶抑制劑對(duì)于各種淀粉酶的特異性。Fontanini等[58]優(yōu)化了一種淀粉-聚丙烯酰胺凝膠雙向分離的二維非變性體系，該方法可以提高蛋白條帶的分辨率，并且在不需要純化的情況下分離復(fù)雜蛋白質(zhì)混合物中的單一抑制組分，并且可以分離和鑒定抑制斑點(diǎn)。毛細(xì)管電泳（capillary electrophoresis，CE）是一種全自動(dòng)定量分析方法，具有分辨率高、分析時(shí)間短、樣品用量少等優(yōu)點(diǎn)，非常適合蛋白質(zhì)的分離。毛細(xì)管電泳已成為臨床、法醫(yī)學(xué)和生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域蛋白質(zhì)分析的常規(guī)方法，同時(shí)也可用于從植物組織中提取蛋白質(zhì)和對(duì)多肽進(jìn)行分離[59]。在親和毛細(xì)管電泳法中，配體以遞增的濃度進(jìn)入緩沖液中，并獲得蛋白質(zhì)溶液的色譜圖。觀察到的遷移時(shí)間（或峰面積）變化是配體與蛋白質(zhì)分子發(fā)生相互作用，與已經(jīng)得到的圖譜比較來確定配體與蛋白質(zhì)是否結(jié)合；在孵育方法中，蛋白質(zhì)和配體在同一溶液中孵育，然后進(jìn)行電泳，配體與蛋白質(zhì)形成穩(wěn)定的復(fù)合物，則復(fù)合物的峰可能與其他物質(zhì)分離開[60]。Hamdan等[61]利用毛細(xì)管電泳法對(duì)植物中的α-AI篩選，結(jié)合紫外驗(yàn)證，最終發(fā)現(xiàn)了7種具有明顯α-淀粉酶抑制效果的抑制劑，該方法后期結(jié)合質(zhì)譜，則可能會(huì)將抑制劑相關(guān)的結(jié)構(gòu)信息解析。Hodek等[62]建立了一種利用毛細(xì)管電泳研究淀粉與α-淀粉酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的方法，用此方法對(duì)木犀草素、楊梅素和槲皮素單一以及混合作用抑制α-淀粉酶效果進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)它們對(duì)α-淀粉酶的抑制沒有協(xié)同作用。該方法適用于多種化合物及其混合物的快速檢測(cè)，也適用于植物提取物的檢測(cè)。

目前，對(duì)α-淀粉酶體外抑制活性的檢測(cè)已經(jīng)相當(dāng)成熟，然而，α-淀粉酶的體內(nèi)抑制活性檢測(cè)還需進(jìn)一步加強(qiáng)。隨著計(jì)算機(jī)技術(shù)的進(jìn)步，通過分子模擬將抑制劑和淀粉酶結(jié)合起來，已經(jīng)成為篩選檢測(cè)淀粉酶抑制劑的一種重要方法。蛋白類α-AI檢測(cè)方法的比較見表2。

表2 蛋白類α-AI檢測(cè)方法的比較Table 2 Comparison of detection methods for protein α-amylase inhibitors

4 谷物蛋白類α-AI的功能特性

4.1 谷物蛋白類α-AI的降血糖作用

2型糖尿病以及由此引發(fā)的代謝綜合征等問題在醫(yī)學(xué)上是一個(gè)難題。以往研究一直認(rèn)為α-AI對(duì)糖尿病患者僅僅是輔助降糖作用，而無直接治療作用，近幾年研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病病人長時(shí)間高血糖狀態(tài)是導(dǎo)致病人多系統(tǒng)多臟器損害的最主要原因[63]，而α-AI可直接降低餐后血糖含量。因此，其對(duì)于預(yù)防或者減輕2型糖尿病具有重要作用。GI血糖指數(shù)（glycemic index，GI）反映食物對(duì)人體血糖水平的影響程度。在臨床營養(yǎng)學(xué)上，GI的概念主要被用于指導(dǎo)糖尿病人的日常飲食[64]。越來越多的研究表明[65]，通過抑制負(fù)責(zé)碳水化合物消化的酶來減少碳水化合物的吸收是一種良好的方法，即向食品中添加天然來源的淀粉酶或糖苷酶抑制劑，這些抑制劑通過抑制腸道內(nèi)淀粉酶或糖苷酶的活力，延緩或阻礙碳水化合物的分解，減少葡萄糖的生成與吸收，降低餐后的血糖水平。

在天然存在的抑制劑中，α-淀粉酶抑制劑得到了極大的關(guān)注。自然界中存在的α-AI相比合成的來說，安全性較高，而谷物更是人們經(jīng)常食用的糧食作物，因此，來自谷物天然的α-AI的生物安全性更高[66]，因而在防控糖尿病及其引起的疾病方面具有更為廣闊的前景。楊寧等[67]對(duì)受試者進(jìn)餐前服用白蕓豆蛋白提取物對(duì)餐后血糖的改變進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)餐前15 min服用6 g白蕓豆蛋白提取物可以有效降低進(jìn)食白米飯后的血糖反應(yīng)，血糖水平與服用劑量存在一定關(guān)系。在本試驗(yàn)研究范圍內(nèi)，服用最大劑量6 g時(shí)，其餐后血糖水平控制效果更佳。Ramli[68]研究了白米、糙米和糯米3種類型米的蛋白提取物對(duì)α-淀粉酶的抑制作用。在3種米中，抑制蛋白含量最高的是糙米（0.030±0.002 mg/mL）、糯米（0.006±0.001 mg/mL）和白米（0.005±0.001 mg/mL）次之。從α-淀粉酶的抑制率來看，在麥芽糖釋放量最低的3種米中，糙米的抑制率最高（61.22%）。糙米中含有醇溶性的抑制蛋白，具有抑制α-淀粉酶等碳水化合物水解酶的能力，為糖尿病患者的飲食選擇提供了參考。Kazumi[69]等發(fā)現(xiàn)蕎麥中的α-AI白蛋白能夠抑制淀粉水解成糖，可以減少餐后血糖升高，有助于預(yù)防糖尿病。研究發(fā)現(xiàn)，盡管蕎麥中α-AI很容易被消化酶水解，但其水解產(chǎn)物仍具有抑制活性，同時(shí)其熱穩(wěn)定性好，這表明其在預(yù)防糖尿病方面具有很大的潛力。Jhan等[70]對(duì)5種次要無麩質(zhì)谷物進(jìn)行了化學(xué)成分、功能、結(jié)構(gòu)、熱學(xué)和營養(yǎng)特性的研究，發(fā)現(xiàn)高粱對(duì)于體外α-淀粉酶的抑制作用最強(qiáng)，顯示出良好的抗糖尿病活性。張曉琦等[71]研究發(fā)現(xiàn)，連續(xù)使用劑量為150 mg/kg的白蕓豆α-AI在7d后可明顯降低高血糖大鼠的空腹血糖含量；使用劑量達(dá)到300 mg/kg時(shí)，對(duì)高血糖大鼠的糖耐受量具有明顯的改善作用。張琪等[72]以45 mg/kg量的小麥α-AI灌胃四氧嘧啶糖尿病小鼠，發(fā)現(xiàn)小麥α-AI能夠增加四氧嘧啶糖尿病小鼠的淀粉耐量，因此對(duì)糖尿病小鼠有降血糖作用，該作用機(jī)制可能與小腸內(nèi)各腸段麥芽糖酶與蔗糖酶的活性有關(guān)。

綜上所述，谷物蛋白類α-淀粉酶抑制劑通過抑制體內(nèi)α-淀粉酶水解淀粉，從而達(dá)到降血糖的作用，如圖2所示。

圖2 谷物蛋白類α-AI的降血糖作用Fig.2 Hypoglycemic effect of cereal protein α-amylase inhibitors

4.2 谷物蛋白類α-淀粉酶抑制劑的減肥作用

現(xiàn)階段，肥胖問題已經(jīng)成為人們關(guān)注的熱點(diǎn)問題，而如何減肥也隨之被重視。2016年，全球39%的男性和40%的18歲及以上女性超重，11%的男性和15%的女性肥胖[73]。在過去的40年中，超重和肥胖均顯著增加，肥胖與超重逐漸趨于低齡化。α-AI能夠抑制α-淀粉酶的活性，進(jìn)而抑制或者減緩淀粉被轉(zhuǎn)化為糖類的過程，即可減少糖向脂肪轉(zhuǎn)化，增加脂肪消耗以減輕體重，故其在減肥領(lǐng)域有待深入研究。吳永宏等[74]研究發(fā)現(xiàn)，高、中劑量的小麥α-AI對(duì)于肥胖小鼠的肥胖評(píng)定指數(shù)以及脂肪濕重均有降低作用，高劑量的作用更加明顯，且其減肥效應(yīng)與其劑量呈正相關(guān)。陳一昆等[75]采用高（352 mg/kg）、中（141 mg/kg）、低（70 mg/kg）3 個(gè)劑量組的蕓豆 α-AI連續(xù)灌胃 SD（sprague dawley，SD）大鼠45 d后發(fā)現(xiàn)，α-AI均對(duì)降低SD大鼠體重、睪丸周圍脂肪墊質(zhì)量及大鼠血液總膽固醇有顯著效果（p＜0.05），說明蕓豆中的α-AI對(duì)于小鼠具有減肥的作用。這有望將蕓豆中的α-AI開發(fā)為降血糖或者體重控制的膳食補(bǔ)充劑。Wang等[76]采用隨機(jī)、雙盲和對(duì)照的研究方法，評(píng)價(jià)西南地區(qū)種植的菜豆對(duì)肥胖志愿者的減肥效果。試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，菜豆蛋白提取物組35 d后平均減重2.24 kg（平均每周0.448 kg），對(duì)照組平均減重0.29 kg（平均每周0.058 kg）。體重指數(shù)平均下降0.79，體脂平均下降1.53%，皮下脂肪厚度、腰圍和臀圍均顯著減小。結(jié)果表明，菜豆蛋白提取物能在短時(shí)間內(nèi)顯著降低體重。徐君利[77]對(duì)44名志愿者進(jìn)行分組試驗(yàn)，分為對(duì)照組（常規(guī)飲食管理）和觀察組（常規(guī)飲食管理+白蕓豆α-AI功能性食品）。最后發(fā)現(xiàn)，觀察組在90 d時(shí)的體重以及身體質(zhì)量指數(shù)（body mass index，BMI）顯著低于對(duì)照組（p＜0.05），觀察組人員的低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDLC）、總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）指標(biāo)和糞便脂肪率顯著低于對(duì)照組（p＜0.05），HDL-C和血糖與對(duì)照組不存在顯著差異（p＞0.05），說明納米白蕓豆α-淀粉酶抑制劑脂質(zhì)體功能性食品具有良好的減脂減重、改善血脂的效果。

如圖3所示，谷物蛋白類α-淀粉酶抑制劑通過抑制體內(nèi)的α-淀粉酶水解淀粉，降低葡萄糖的生成，從而抑制血糖轉(zhuǎn)化為脂肪，最終實(shí)現(xiàn)減肥的目的。

圖3 谷物蛋白類α-AI的減肥作用Fig.3 Weight loss effect of cereal protein α-amylase inhibitors

5 展望

隨著生活水平的提高，人們會(huì)出現(xiàn)一系列的疾病問題，如：糖尿病、高血脂、高血壓、肥胖癥等。對(duì)于患有上述疾病的人，為了減少或者避免化學(xué)藥物帶來的副作用以及出于對(duì)安全性、高效性的考慮，天然食物源的α-AI成為了更好的選擇對(duì)象。目前，市場(chǎng)上用于減肥的商品化α-AI產(chǎn)品的制備原料僅限于北美白蕓豆，也有對(duì)添加α-AI的方便粥以及納米脂質(zhì)功能性食品研究，但未進(jìn)行體內(nèi)、外的系統(tǒng)化研究驗(yàn)證，因此，這些產(chǎn)品未能在市場(chǎng)上進(jìn)行推廣，對(duì)于其他谷物來源的α-AI還有待于進(jìn)一步的研究開發(fā)和利用。目前α-AI在食品中的應(yīng)用還并不是很廣泛，未來發(fā)展的方向傾向于開發(fā)降糖或者減肥的功能性食品。同時(shí)，對(duì)于α-AI在人體中發(fā)揮相應(yīng)的作用以及相關(guān)的機(jī)制應(yīng)進(jìn)一步研究闡明。

α-AI對(duì)于肥胖、減肥以及潛在的藥用作用等方面有重要的意義。本文對(duì)于天然的蛋白類α-AI的分離純化、篩選檢測(cè)以及功能特性進(jìn)行了總結(jié)闡述，但僅僅依靠本文介紹的制備方法來獲得蛋白類α-AI劑耗時(shí)耗力，產(chǎn)品成本較高。因此，未來可利用基因工程菌進(jìn)行大量制備，將表達(dá)后的產(chǎn)物進(jìn)行分離純化，最終對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行生物活性、毒理學(xué)等安全性試驗(yàn)后進(jìn)行利用，降低生產(chǎn)成本。