大豆胚芽甾醇酯的分離純化

姚雙燕，張沁強(qiáng)，竇偉國(guó)，彭丹，畢艷蘭，陳競(jìng)男

（河南工業(yè)大學(xué)糧油食品學(xué)院，河南 鄭州 450001）

我國(guó)大豆的年消費(fèi)量已經(jīng)連續(xù)四年超過(guò)1億t，其中大豆的加工量約占消費(fèi)總量的84%[1]。大豆胚芽是低溫豆粕制取的副產(chǎn)物之一，占大豆總質(zhì)量的2.0%～2.5%[2]。大豆胚芽中含有豐富的粗蛋白和粗脂肪，此外包含豐富的天然活性物質(zhì)，如植物甾醇、大豆異黃酮、大豆磷脂、維生素E、角鯊烯等[3-4]。其中植物甾醇是一種天然存在于豆類、種子、谷物、堅(jiān)果、水果中以環(huán)戊烷多氫菲為基本骨架的活性甾族類化合物[5-6]。研究發(fā)現(xiàn)植物甾醇能夠在脂肪微團(tuán)的運(yùn)輸和吸收過(guò)程中與膽固醇競(jìng)爭(zhēng)，減少膽固醇的吸收，從而降低血液中總膽固醇和低密度脂蛋白濃度，有效預(yù)防心腦血管疾病[7-9]。

在食品工業(yè)中，植物甾醇多數(shù)通過(guò)脫臭餾出物皂化得到，主要以游離態(tài)形式存在，而游離態(tài)甾醇的溶解性較差，生物利用性較低[10-11]。因此，工業(yè)上常將游離甾醇與脂肪酸酯化，再以甾醇酯的形式加以利用。大豆胚芽中的植物甾醇資源含量豐富，前期研究發(fā)現(xiàn)大豆胚芽毛油中甾醇含量約為4%，其中，酯態(tài)甾醇約占80%，是一種極好的天然植物甾醇酯資源。然而，目前工業(yè)生產(chǎn)中大豆胚芽多作為加工副產(chǎn)物應(yīng)用于飼料行業(yè)，對(duì)其活性組分的開(kāi)發(fā)也主要集中于大豆胚芽中的異黃酮和皂甙等[12-14]，對(duì)大豆胚芽油脂及其豐富的植物甾醇（酯）資源并未充分開(kāi)發(fā)利用，造成了資源的極大浪費(fèi)。

相較于傳統(tǒng)的皂化再酯化生產(chǎn)植物甾醇酯工藝，本研究直接從富含植物甾醇酯的大豆胚芽粗提物中分離純化甾醇酯。采用柱層析的方法對(duì)大豆胚芽粗提物中的甾醇酯進(jìn)行分離純化，通過(guò)正交試驗(yàn)優(yōu)化最佳工藝條件，并對(duì)大豆胚芽甾醇酯產(chǎn)品進(jìn)行表征，為大豆胚芽的開(kāi)發(fā)利用與植物甾醇酯的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料與設(shè)備

大豆胚芽（粗蛋白41.45%、粗脂肪10.46%、水分9.34%、粗纖維7.49%）：山東香馳豆業(yè)集團(tuán)有限公司；正己烷、石油醚、吡啶、氫氧化鉀、冰乙酸、無(wú)水乙醇（分析純）：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；中性氧化鋁（100目～200目、200目～300目）、硅膠粉（100目～200目、200目～300目）：青島海洋化工有限公司；乙醚、丙酮、三氯甲烷（分析純）：四川西隴科學(xué)有限公司；膽固醇硬脂酸酯標(biāo)準(zhǔn)品、膽甾烷醇標(biāo)準(zhǔn)品：美國(guó)Sigma公司；N，O-雙（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺（BSTFA）：阿拉丁試劑有限公司。

2695高效液相色譜儀：美國(guó)Waters公司；7890氣相色譜儀、7890A-5975C氣質(zhì)聯(lián)用儀：安捷倫科技有限公司；370DTGS傅里葉紅外光譜儀：美國(guó)PE公司；FW-100高速粉碎機(jī)：永康市紅太陽(yáng)機(jī)電有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 大豆胚芽粗提物的制備

將大豆胚芽放置于鼓風(fēng)干燥箱中干燥（80℃，7 h），通過(guò)高速粉碎機(jī)將大豆胚芽粉碎至100目，過(guò)篩備用。稱取一定質(zhì)量的大豆胚芽粉末，分別用無(wú)水乙醚、無(wú)水乙醇、石油醚、丙酮、正己烷、氯仿對(duì)大豆胚芽粉末進(jìn)行索氏抽提，溫度設(shè)定為高于提取溶劑沸點(diǎn)15℃，抽提10 h，提取結(jié)束后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去多余溶劑，將得到的大豆胚芽粗提物放置于70℃真空干燥箱中干燥至恒重。以大豆胚芽粗提物得率及甾醇酯含量為指標(biāo)，選取最佳提取溶劑。大豆胚芽粗提物得率及甾醇酯含量按式（1）和（2）計(jì)算。

氣相色譜條件：儀器AgilentGC7890；色譜柱DB-1ht（30m×320μm×0.25μm）；載氣為氮?dú)?；流?3.0mL/min；初始柱溫100℃，50℃/min升至300℃保持5 min，20℃/min升至360℃保持15 min；進(jìn)樣口溫度350℃；FID 檢測(cè)器溫度 350 ℃；分流比 20∶1；進(jìn)樣量 1 μL。

1.2.3.1 吸附劑種類對(duì)大豆胚芽甾醇酯純度和得率的影響

以正己烷∶乙醚∶乙酸=90∶10∶1（體積比）為洗脫劑比例，12∶1為層析柱高度與直徑比（H/D），2.0 g為上樣

1.2.2 大豆胚芽粗提物的理化性質(zhì)分析

水分及揮發(fā)物含量參考GB 5009.236—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)植物油脂水分及揮發(fā)物的測(cè)定》測(cè)定；酸價(jià)參考GB 5009.229—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中酸價(jià)的測(cè)定》測(cè)定；過(guò)氧化值參考GB 5009.227—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中過(guò)氧化值的測(cè)定》測(cè)定；皂化值參考GB/T 5534—2008《動(dòng)植物油脂皂化值的測(cè)定測(cè)定》；不皂化物含量參考GB/T 5535.2—2008《動(dòng)植物油脂不皂化物測(cè)定第2部分：己烷提取法》測(cè)定；生育酚含量參考Huang等[15]的方法測(cè)定；總甾醇含量參考GB/T 25223—2010《動(dòng)植物油脂甾醇組成和甾醇總量的測(cè)定氣相色譜法》測(cè)定；游離甾醇含量參考李妲汨等[16]的方法測(cè)定。

1.2.3 柱層析純化甾醇酯單因素試驗(yàn)

稱取一定質(zhì)量的大豆胚芽粗提物，并配制不同體積比的洗脫劑（正己烷∶乙醚∶乙酸）待用。稱取適量的吸附劑于燒杯中，倒入適量的洗脫劑混勻并用漏斗注入層析柱中，使吸附劑沉降，用壓力球加壓至吸附劑壓實(shí)。將稱取的大豆胚芽粗提物均勻添加至制備好的層析柱中，洗脫至甾醇酯全部流出（用薄層色譜進(jìn)行判斷），收集甾醇酯組分旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，在真空干燥箱中干燥至恒重后稱重。以膽固醇硬脂酸酯為標(biāo)準(zhǔn)品，采用氣相色譜測(cè)定其純度并按式（3）計(jì)算得率。量，考察4種吸附劑對(duì)柱層析分離純化甾醇酯的影響。

1.2.3.2 洗脫劑體積比對(duì)大豆胚芽甾醇酯純度和得率的影響

在上樣量2.0 g，填充劑200目～300目硅膠粉，H/D12∶1條件下，選取不同極性比例的洗脫劑分離純化甾醇酯，考察5種洗脫劑體積比對(duì)甾醇酯純度和得率的影響，洗脫劑極性大小見(jiàn)表1。

表1 不同體積比洗脫劑的總極性Table 1 Total polarity of different eluent ratios

1.2.3.3 上樣量對(duì)大豆胚芽甾醇酯純度和得率的影響

以200目～300目硅膠粉為層析柱填充劑，正己烷∶乙醚∶乙酸=90∶10∶1（體積比）為洗脫劑比例，H/D12∶1，考察上樣量（0.5、2、3、4、5 g）對(duì)柱層析純化甾醇酯得率和純度的影響。

1.2.3.4 填柱高度與直徑比（H/D）對(duì)大豆胚芽甾醇酯純度和得率的影響

以200目～300目硅膠粉為層析柱填充劑，正己烷∶乙醚∶乙酸=90∶10∶1（體積比）為洗脫劑比例，上樣量 2.0 g，考察填柱高度與直徑比 H/D（8∶1、10∶1、12∶1、14∶1、16∶1）對(duì)柱層析純化甾醇酯得率與純度的影響。

1.2.4 正交試驗(yàn)

依據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以 H/D（A）、上樣量（B）、洗脫劑比例（C）為變量，以大豆胚芽甾醇酯的得率及純度為考察指標(biāo)，通過(guò)正交試驗(yàn)優(yōu)化出大豆胚芽甾醇酯最佳分離純化工藝條件。正交試驗(yàn)因素水平見(jiàn)表2。

表2 L9（33）純化工藝正交因素水平表Table 2L9（33）orthogonal factors and levels for the purification process

1.2.5 大豆胚芽甾醇酯產(chǎn)品的表征

1.2.5.1 甾醇酯純化產(chǎn)品的高效液相色譜分析

將純化后的大豆胚芽甾醇酯與膽固醇硬脂酸酯標(biāo)準(zhǔn)品溶于色譜純正己烷，分別進(jìn)行高效液相色譜分析，分析條件：硅膠色譜柱（5 μm×4.6 mm×250 mm）；進(jìn)樣量10 μL；柱溫30℃；采用等度洗脫，流動(dòng)相為正己烷-異丙醇（體積比=20∶1），流速 0.8mL/min；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm。

1.2.5.2 甾醇酯純化產(chǎn)品的紅外光譜分析

將溴化鉀壓成薄片，放入傅里葉紅外光譜儀掃描背景，再將待測(cè)樣品置于溴化鉀薄片上，使其均勻分布。分析條件為采樣32次，掃描范圍4 500 cm-1～400 cm-1。

1.2.5.3 大豆甾醇酯的甾醇組成及脂肪酸組成分析

將純化后的甾醇酯產(chǎn)品用KOH-乙醇溶液于80℃皂化1.5 h，酸化后用正己烷萃取不皂化物，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑并對(duì)其進(jìn)行薄層色譜分離，分別得到甾醇酯上的甾醇及脂肪酸色譜帶。

采用氣質(zhì)聯(lián)用色譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）對(duì)甾醇酯上的甾醇組成進(jìn)行分析，條件為色譜柱 HP-5（30 m×250 μm×0.25 μm）；進(jìn)樣口溫度290℃；FID檢測(cè)器溫度360℃；分流比20∶1；載氣為氮?dú)?，流?.0 mL/min；進(jìn)樣量1 μL。離子源溫度230℃；四極桿溫度150℃；電離電壓70 eV；掃描范圍33 m/z～650 m/z。采用氣相色譜檢測(cè)甾醇酯上的脂肪酸組成，條件：色譜柱 SGEBPX-70（30 m×250 μm×0.25μm）；進(jìn)樣口溫度250℃；分流比20∶1；FID檢測(cè)器溫度250℃；氫氣流量40 mL/min；空氣流量400 mL/min；柱箱初始溫度170℃，以2℃/min升至210℃，保持20 min；載氣為氮?dú)?，流?1.0 mL/min；進(jìn)樣量 1.0 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 大豆胚芽粗提取的制備

不同提取溶劑對(duì)大豆胚芽粗提物得率及甾醇酯含量的影響結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 不同溶劑對(duì)大豆胚芽粗提物得率及甾醇酯含量的影響Fig.1 Effect of different solvents on crude extract yield and sterol ester content

由圖1可見(jiàn)，石油醚為提取溶劑時(shí)，大豆胚芽粗提物中甾醇酯含量最高，達(dá)到（4.15±0.02）g/100 g，說(shuō)明石油醚對(duì)甾醇酯的溶解性和選擇性較好，其次為丙酮，甾醇酯含量為（3.92±0.37）g/100 g。除此之外，乙醇為提取溶劑時(shí)，大豆胚芽提取物得率最高，為（11.30±0.04）%，這可能因?yàn)榇蠖古哐恐写既苄晕镔|(zhì)較多，如大豆異黃酮、低聚糖、醇溶蛋白等[17]，但乙醇極性較大，對(duì)甾醇酯溶解性較差，因此其中甾醇酯含量較低[（0.99±0.19）g/100g]；綜合考慮溶劑的毒性、價(jià)格、沸點(diǎn)等因素[18]，本試驗(yàn)選擇石油醚作為大豆胚芽粗提物的提取溶劑。

2.2 大豆胚芽粗提物的主要理化指標(biāo)分析

大豆胚芽粗提物的主要理化指標(biāo)結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 大豆胚芽粗提物理化指標(biāo)Table 3 Physical and chemical indicators of soybean germ crude extract

由表3可知，大豆胚芽粗提物中植物甾醇含量（4.69 g/100 g粗提物）高于小麥胚芽油（0.86 g/100 g油）、玉米胚芽油（1.10 g/100 g油）、米糠油（1.00 g/100 g油）[19-20]。

2.3 柱層析分離純化大豆胚芽甾醇酯的單因素試驗(yàn)

2.3.1 吸附劑種類對(duì)大豆胚芽甾醇酯純度和得率的影響

4種吸附劑對(duì)柱層析分離純化甾醇酯的影響結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 吸附劑種類對(duì)甾醇酯純度和得率的影響Fig.2 Effect of adsorbent type on the purity and yield of sterol esters

由圖2可知，隨著2種吸附劑目數(shù)的增大，甾醇酯的得率及純度均有所提高。這是由于200目～300目的吸附劑相較于100目～200目，顆粒較小，洗脫劑流經(jīng)柱子時(shí)阻力較大，流速較慢，沖柱時(shí)間較長(zhǎng)，更利于甾醇酯的吸附與解吸[21-22]，使得甾醇酯與其他極性相似組分分離（如甘三酯）。當(dāng)吸附劑目數(shù)相同時(shí)，硅膠粉的得率及純度均高于氧化鋁。如吸附劑為100目～200目氧化鋁時(shí)，甾醇酯純度為（86.51±1.34）%，得率為（75.09±0.16）%，而吸附劑為相同目數(shù)的硅膠粉時(shí)，甾醇酯的純度和得率分別為（90.73±0.46）%、（85.81±2.44）%。這是由于氧化鋁極性大于硅膠粉，使得提取物中極性較小的組分被較快洗脫出來(lái)，但因洗脫時(shí)間較短，分離效果較差。因此選擇200目～300目硅膠粉為柱層析的吸附劑。

2.3.2 洗脫劑體積比對(duì)大豆胚芽甾醇酯純度和得率的影響

洗脫劑體積比對(duì)大豆胚芽甾醇酯純度和得率的影響見(jiàn)圖3。

圖3 洗脫劑體積比對(duì)甾醇酯純度和得率的影響Fig.3 Effect of eluent ratio on the purity and yield of sterol esters

由圖3可見(jiàn)，甾醇酯得率隨著總極性的增加先增大后減小，這可能由于洗脫劑總極性較小時(shí)，對(duì)甾醇酯洗脫能力較強(qiáng)，較易將其從層析柱中洗脫，當(dāng)洗脫劑（正己烷∶乙醚∶乙酸）體積比為 90∶10∶1 時(shí)，甾醇酯的得率達(dá)到最高。隨著洗脫劑總極性的增大，對(duì)甾醇酯的分離效果差，致使得率降低。當(dāng)洗脫劑體積比在 95∶5∶1～85∶15∶1 時(shí)，甾醇酯純度隨洗脫劑總極性變化較小，無(wú)顯著性差異，隨著洗脫劑總極性增大，甾醇酯純度明顯降低。這可能由于甾醇酯與其他組分在不同極性的洗脫劑下分離效果不同。當(dāng)洗脫劑（正己烷∶乙醚∶乙酸）體積比為90∶10∶1時(shí)，甾醇酯的得率[（94.36±1.77）%]及純度[（96.80±0.16）%]均達(dá)到最高，因此，選擇正己烷∶乙醚∶乙酸=90∶10∶1（體積比）為最佳洗脫劑比例。

2.3.3 上樣量對(duì)大豆胚芽甾醇酯純度和得率的影響

上樣量對(duì)柱層析純化甾醇酯得率和純度的影響結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 上樣量對(duì)甾醇酯純度和得率的影響Fig.4 Effect of loading volume on the purity and yield of sterol esters

由圖4可見(jiàn)，甾醇酯得率及純度隨著上樣量的增加逐漸下降，在上樣量為2.0 g時(shí)，甾醇酯的純度及得率達(dá)到最高，純度和得率分別為（95.70±0.16）%與（94.30±1.45）%。繼續(xù)加大上樣量至3.0 g時(shí)，通過(guò)SPSS進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，發(fā)現(xiàn)與2.0 g相比，兩者純度無(wú)顯著差異，（P＞0.05），但甾醇酯的得率顯著下降。這是因?yàn)閷游鲋鶎?duì)樣品的負(fù)載能力是一定的[17]，應(yīng)在層析柱的負(fù)載范圍內(nèi)選擇最大的上樣量，因此柱層析最佳上樣量選擇2.0 g。

2.3.4 填柱高度與直徑比（H/D）對(duì)大豆胚芽甾醇酯純度和得率的影響

填柱高度與直徑比（H/D）對(duì)柱層析純化甾醇酯得率與純度的影響結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 填柱高度與直徑比（H/D）對(duì)甾醇酯純度和得率的影響Fig.5 Effect of height to diameter ratio（H/D）of column on the purity and yield of sterol esters

如圖5所示，H/D對(duì)甾醇酯純度影響較小，隨著H/D的增加，甾醇酯純度基本不變。而甾醇酯的得率隨著H/D的升高先增大后基本保持不變，當(dāng)柱層析H/D為12∶1時(shí)，甾醇酯的純度及得率均較高，分別為（96.65±0.12）%、（94.56±1.01）%。繼續(xù)增加 H/D 至 16∶1時(shí)，甾醇酯的得率達(dá)到最佳（94.76±0.04）%，這是由于填充劑的高度決定樣品在層析柱中的遷移長(zhǎng)度，遷移長(zhǎng)度越長(zhǎng)，越有利于甾醇酯的分離純化。但通過(guò)SPSS分析發(fā)現(xiàn)，H/D 為 12∶1、14∶1、16∶1 時(shí)，甾醇酯的得率及純度均無(wú)顯著性差異，考慮到耗材節(jié)約，選擇12∶1作為最佳H/D。

2.4 柱層析純化甾醇酯的正交試驗(yàn)

正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表4，方差分析見(jiàn)表5，其中綜合分?jǐn)?shù)為0.5×純度+0.5×得率。

表4 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 4 Orthogonal experimental design and results

表5 方差分析Table 5 Analysis of variance

由表4可知，各因素對(duì)甾醇酯分離純化效果的主次順序?yàn)椋篊＞B＞A，最佳工藝組合為 A2B2C2，即填充柱高度與直徑比 12∶1，上樣量 2.0 g，洗脫劑（正己烷∶乙醚∶乙酸）體積比90∶10∶1，在最佳條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，甾醇酯純度為（96.11±0.41）%，得率為（94.99±0.19）%。

2.5 大豆胚芽甾醇酯的表征

2.5.1 甾醇酯純化產(chǎn)品的高效液相色譜分析

以膽固醇硬脂酸酯為標(biāo)準(zhǔn)品，通過(guò)高效液相色譜對(duì)純化產(chǎn)品進(jìn)行定性分析，結(jié)果見(jiàn)圖6。

圖6 膽固醇硬脂酸酯與大豆胚芽甾醇酯的高效液相色譜圖Fig.6 High-performance liquid chromatograms of cholesteryl stearate and soybean germ sterol esters

由圖6可知，大豆胚芽甾醇酯的出峰時(shí)間為4 min左右，與膽固醇硬脂酸酯標(biāo)準(zhǔn)品出峰時(shí)間相近，說(shuō)明純化產(chǎn)物為甾醇酯。

2.5.2 甾醇酯純化產(chǎn)品的紅外光譜分析

采用紅外光譜對(duì)純化后的大豆胚芽甾醇酯進(jìn)行表征，結(jié)果如圖7所示。

圖7 大豆胚芽甾醇酯的紅外光譜Fig.7 Infrared spectrum of soybean germ sterol esters

由圖7可知，大豆胚芽甾醇酯在1 744.20 cm-1處有明顯的吸收峰，是典型的CO紅外吸收峰；在1 173.10 cm-1有吸收峰，為酯鍵O—C—O吸收峰。說(shuō)明分離純化出的產(chǎn)物為甾醇酯。

2.5.3 甾醇酯純化產(chǎn)品的氣質(zhì)聯(lián)用色譜分析

對(duì)純化產(chǎn)品上的甾醇及脂肪酸進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)圖8、表6和表7。

圖8 純化產(chǎn)品的甾醇及脂肪酸氣相色譜圖Fig.8 Gas chromatograms of sterol composition and fatty acids of purified product

表6 氣相質(zhì)譜分析甾醇的特征離子碎片Table 6 Characteristic ion fragments of sterols analyzed byGC-MS

表7 甾醇酯上甾醇及脂肪酸組成Table 7 Sterol and fatty acid compositions in sterol esters

通過(guò)圖8、表6和表7可見(jiàn)，大豆胚芽甾醇酯中甾醇主要組成為菜油甾醇、豆甾醇、β-谷甾醇、羊毛甾醇等，相對(duì)含量分別為（9.12±0.05）%、（3.33±0.02）%、（75.17±0.14）%、（12.37±0.11）%；其脂肪酸組成主要為棕櫚酸、亞油酸、亞麻酸等，相對(duì)含量分別為（7.31±0.74）%、（69.34±0.08）%、（15.72±0.15）%。

3 結(jié)論

通過(guò)石油醚提取粗提物中甾醇酯含量最高[（4.15±0.02）g/100 g粗提物]，得率為（10.48±0.10）%。柱層析分離純化大豆胚芽甾醇酯的最佳工藝條件為吸附劑200目～300目硅膠粉、洗脫劑（正己烷∶乙醚∶乙酸）體積比90:10∶1、上樣量2.0 g、層析柱高度與直徑比（H/D）12∶1。在最佳分離純化條件下，大豆胚芽甾醇酯的純度為（96.11±0.41）%，得率為（94.99±0.19）%（以大豆胚芽粗提物計(jì)）。通過(guò)液相色譜及紅外光譜表征證明產(chǎn)物為甾醇酯，使用氣相質(zhì)譜及氣相色譜分析出大豆胚芽甾醇酯的主要甾醇組成為β-谷甾醇、羊毛甾醇、菜油甾醇、豆甾醇等；甾醇酯的主要脂肪酸組成為亞油酸、亞麻酸、棕櫚酸等。