岳明，阿迪拉·阿布都熱西提，尼格爾熱依·亞迪卡爾，*，李明璇，麗娜·托蘭

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830000；2.新疆特色藥食用植物資源化學(xué)實(shí)驗(yàn)室，喀什大學(xué)，新疆 喀什 844000）

菊科植物是我國(guó)著名的中草藥，有著悠久的藥用歷史及較高的藥用價(jià)值，同時(shí)又被廣泛應(yīng)用于茶飲。有較多學(xué)者已發(fā)現(xiàn)菊科植物提取物具有較強(qiáng)的抑菌作用[1]，其中洋甘菊頭狀花序中精油及黃酮類化合物的抗菌消炎活性較強(qiáng)。德國(guó)洋甘菊，母菊屬，為一年生草本植物，學(xué)名為Matricaria chamomilla L.，植物名為Matricaria recutita[2]，原產(chǎn)于歐亞大陸北部和西部，在我國(guó)新疆地區(qū)種植較多。

抗生素耐藥性是當(dāng)代醫(yī)學(xué)面臨的一個(gè)的問(wèn)題，己成為21世紀(jì)新型全球性公共健康議題之一，在許多國(guó)家抗生素耐藥性己存在危害人類健康的隱患[3]。因此迫切需要尋找開(kāi)發(fā)新型抑菌治療劑以補(bǔ)充我們的抗感染藥物群體。天然產(chǎn)物具有多種生物活性，為細(xì)菌性感染疾病的治療提供了新的方向與思路，植物抗菌藥應(yīng)用于臨床己越來(lái)越普遍[4]。林碧芬[5]對(duì)蟛蜞菊的揮發(fā)油、95%乙醇提取物和水提物的石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取部位分別進(jìn)行抑菌活性研究，結(jié)果表明95%的乙醇提物的石油醚和乙酸乙酯萃取部位抑菌作用較強(qiáng)。王秋紅等[6]對(duì)線葉菊采用了微量稀釋法，探究線葉菊的非揮發(fā)性部位對(duì)臨床常見(jiàn)的12種病原菌的最低抑菌濃度（minimal inhibitory concentration，MIC）和最低殺菌濃度（minimum bactericidal concentration，MBC），結(jié)果表明線葉菊的非揮發(fā)性部位對(duì)耐藥金黃色葡萄球菌的抑菌作用較強(qiáng)；陳紅兵等[7]研究發(fā)現(xiàn)萬(wàn)壽菊乙酸乙酯提取液對(duì)青霉、大腸桿菌和枯草芽孢桿菌具有較強(qiáng)的抑菌作用。蟛蜞菊、線葉菊、萬(wàn)壽菊都屬菊科植物，其非揮發(fā)性成分中極性物質(zhì)均具有抗菌活性。

本試驗(yàn)對(duì)洋甘菊殘?jiān)M(jìn)行成分分析，以顯色法進(jìn)行成分鑒定并測(cè)定相應(yīng)含量；通過(guò)洋甘菊殘?jiān)鳂O性部位對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、綠膿桿菌的抑制作用，完善對(duì)洋甘菊各極性部位抑菌活性的研究；并測(cè)定乙酸乙酯萃取物處理后的金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)曲線、電導(dǎo)率、細(xì)胞完整性、胞外蛋白、胞外多糖，探究洋甘菊殘?jiān)囊志鷻C(jī)制，以明確新疆產(chǎn)洋甘菊殘?jiān)鳛樘烊灰志鷦⒎栏瘎┑臐撛趹?yīng)用價(jià)值，促進(jìn)新疆地區(qū)菊資源的深度開(kāi)發(fā)與高值化利用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

洋甘菊：新疆和田地區(qū)于田縣，經(jīng)水蒸氣蒸餾法提取精油后得到洋甘菊殘?jiān)唤瘘S色葡萄球菌ATCC 25923（Staphylococcus aureus）、大腸桿菌 ATCC 25922（Escherichia coli）、枯草芽孢桿菌ATCC 9327（Bacillus subtilis）、銅綠假單胞菌ATCC 9027（Pseudomonas aeruginosa）：新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室。

瓊脂粉、酵母浸粉、蛋白胨：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；堿式磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP）試劑盒：南京建成生物工程研究所；氯化鈉、石油醚、氫氧化鈉、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、無(wú)水乙醇、濃鹽酸、鎂粉、三氯化鐵、三氯化鋁、硝酸鋁、硝酸鈉、溴水、碳酸鈉：天津致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-IFD型超凈工作臺(tái)、YXQ-LS-50SII型立式壓力蒸汽滅菌器：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；RE-52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；SHB-III型循環(huán)水式多用真空泵：鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；ZWY-200D型恒溫培養(yǎng)振蕩器：上海智城分析儀器制造有限公司；DNP-9052A型電熱恒溫培養(yǎng)器：上海冠戈實(shí)業(yè)有限公司；UV-1200型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海美普達(dá)儀器有限公司；DZTW型電子調(diào)溫電熱套：北京市永光明醫(yī)療器械廠；DDS-307型微機(jī)型電導(dǎo)率儀：上海雷磁儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

樣品制備參考李晨等[8]方法并略作修改。將提取過(guò)精油的洋甘菊殘?jiān)胖藐帥鎏幜栏桑Q取適量用滲漉法浸泡，按照料液比為1∶20（g/mL）的比例加入75%乙醇溶液浸沒(méi)，浸泡48 h后滲漉提取，將提取液濃縮烘干，得到總提物浸膏，重復(fù)提取3次～5次。將總提物浸膏用蒸餾水進(jìn)行超聲分散，依次用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取，每種溶劑萃取3次～5次，濃縮后回收萃取溶劑，分別得到石油醚提取物、二氯甲烷提取物、乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物，將每種提取物蒸干后，備用。

1.3.2 培養(yǎng)基的配制

LB液體和固體培養(yǎng)基配制參考綦國(guó)紅等[9]的方法。

1.3.3 菌種的活化與菌懸液制備

分別挑取4種供試菌株的單個(gè)菌落于LB液體培養(yǎng)基中進(jìn)行活化，置于37℃恒溫振蕩培養(yǎng)18 h～24 h，用滅菌生理鹽水將活化好的供試菌株稀釋成濃度為106CFU/mL～107CFU/mL的菌懸液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 洋甘菊殘?jiān)谢衔锏蔫b定

采用三氯化鐵試驗(yàn)和溴試驗(yàn)，鑒定洋甘菊殘?jiān)煌瑯O性部位中的酚酸類化合物。取樣品1 mL加入三氯化鐵試液1滴～2滴，若顏色變?yōu)樗{(lán)紫色，說(shuō)明其中有酚酸類化合物；取溴水溶液1 mL加入1滴～2滴樣品的水溶液，若有白色沉淀生成，說(shuō)明樣品中含有酚酸。

采用Molisch試驗(yàn)，鑒定洋甘菊殘?jiān)煌瑯O性部位中的多糖。取待測(cè)液1 mL，加入2滴α-萘酚試劑充分混合，將試管傾斜沿管壁慢慢加入1 mL濃硫酸，把試管緩慢立起，不搖動(dòng)，若在兩相交界處有紫紅色環(huán)出現(xiàn)，則說(shuō)明樣品中含多糖。

采用鹽酸鎂粉試驗(yàn)和三氯化鋁試驗(yàn)，鑒定洋甘菊殘?jiān)煌瑯O性部位中的黃酮類化合物。在樣品的乙醇溶液中加入少許鎂粉后滴入1滴～2滴濃鹽酸，等待1 min～2 min，形成有顏色的絡(luò)合物；將1%三氯化鋁滴入1 mL樣品中，觀察溶液若生成物為黃色且有熒光，則證明樣品中含有黃酮類化合物。

1.3.5 洋甘菊殘?jiān)瘜W(xué)成分含量測(cè)定

酚酸成分含量、多糖成分含量、黃酮成分含量測(cè)定均參考成宏斌等[10]的方法。

1.3.6 洋甘菊殘?jiān)鳂O性部位抑菌活性的測(cè)定

1.3.6.1 最小抑菌濃度測(cè)定

采用二倍稀釋法測(cè)定洋甘菊分極萃取的各相提取物的最小抑菌濃度。根據(jù)張赟彬等[11]方法并略做改動(dòng)。分別向每個(gè)試管中加入100 mL菌懸液，將洋甘菊殘?jiān)?種溶劑萃取物分別用濃度為0.2%的二甲基亞砜配制成 500、250、125、62.5、31.25、15.625 mg/mL，分別取2 mL洋甘菊殘?jiān)?種溶劑萃取物加入菌懸液的試管中。在37℃、200 r/min的生物搖床中培養(yǎng)24 h。觀察各個(gè)試管的顏色變化，結(jié)果以肉眼可見(jiàn)菌落生長(zhǎng)的最小質(zhì)量濃度為其萃取物的MIC[12]。

1.3.6.2 抑菌圈測(cè)定

采用打孔法測(cè)定洋甘菊分極萃取的各相提取物的抑菌圈大小。根據(jù)曾蘭君等[12]方法并略做改動(dòng)。分別取適量4種菌懸液于滅菌的培養(yǎng)皿中，倒入50℃左右滅菌過(guò)的LB固體培養(yǎng)基，厚度約為4 mm，輕輕搖晃混勻，待其冷卻凝固成型后，用滅菌后直徑為6 mm的金屬打孔器在平板表面打4個(gè)孔，將孔內(nèi)固體培養(yǎng)基挑出，向每個(gè)孔中加入適量的4種萃取物的樣品，對(duì)照品為二甲基亞砜。將各培養(yǎng)基置于37℃的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)18 h～24 h。采用十字交叉法測(cè)量抑菌圈直徑大小，抑菌圈直徑取3個(gè)平行樣的平均值為測(cè)定結(jié)果。

1.3.7 洋甘菊殘?jiān)志行Р课粚?duì)金黃色葡萄菌抑制的測(cè)定

1.3.7.1 生長(zhǎng)曲線測(cè)定

參考朱艷蕾[13]的方法，稍作改動(dòng)。以滅菌液體培養(yǎng)基加濃度為1/2 MIC和MIC的乙酸乙酯相提取物作為試驗(yàn)組，滅菌液體培養(yǎng)基加金黃色葡萄球菌作為對(duì)照組。接入適量的金黃色葡萄球菌菌懸液，37℃、120r/min條件下，連續(xù)培養(yǎng)24 h，每隔2 h取一次樣，測(cè)定不同時(shí)間下菌液的吸光值。為避免待測(cè)溶液自身顏色的干擾，以同濃度下的待測(cè)溶液作為調(diào)零對(duì)照。每組試驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。最后一同比濁測(cè)定其600 nm波長(zhǎng)處的吸光值。

1.3.7.2 電導(dǎo)率測(cè)定

參考Sun等[14]的方法，稍作改動(dòng)。試驗(yàn)組和對(duì)照組同上1.3.7.1。接入適量的金黃色葡萄球菌菌懸液，37℃、120 r/min條件下，連續(xù)培養(yǎng)24 h，每隔2 h取一次樣。取適量菌懸液，4 000 r/min離心10 min，取上清液，測(cè)定其電導(dǎo)率。為避免待測(cè)溶液自身顏色的干擾，一同濃度下的待測(cè)溶液作為調(diào)零對(duì)照。每組試驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.3.7.3 細(xì)胞壁完整性測(cè)定

參考薛夢(mèng)瑩[15]的方法，稍作改動(dòng)。試驗(yàn)組和對(duì)照組同上1.3.7.1。接入適量的金黃色葡萄球菌菌懸液，37℃、120 r/min 條件下，連續(xù)培養(yǎng) 24 h，于培養(yǎng) 0、6、12、18、24 h分別取樣，取適量菌懸液，4 000 r/min離心10 min，取上清液，參照試劑盒上說(shuō)明書(shū)測(cè)定各個(gè)時(shí)間上清液中堿性磷酸酶含量。每組試驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.3.7.4 胞外多糖含量測(cè)定

1）多糖標(biāo)曲的繪制

參考張彥麗等[16]的方法，稍作改動(dòng)。稱取干燥至恒重的葡萄糖約20 mg，置于100 mL棕色容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，得質(zhì)量濃度為200 μg/mL的對(duì)照品溶液。用移液槍準(zhǔn)確量取葡萄糖對(duì)照品溶液0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40、0.45、0.50 mL 分別置于15 mL干燥試管中，加水至10 mL，再分別加0.50 mL 6%苯酚溶液，在冷水浴中迅速加硫酸2.5 mL，搖勻即可。同時(shí)做一空白，按紫外分光光度法于490 nm處測(cè)定吸光值。

2）菌液胞外多糖的測(cè)定

參考Zhang等[17]的方法，稍作改動(dòng)。試驗(yàn)組和對(duì)照組同上1.3.7.1。接入適量的金黃色葡萄球菌菌懸液，37℃、120 r/min條件下，連續(xù)培養(yǎng)24 h，每隔2 h取一次樣，取適量菌懸液，4 000 r/min離心10 min，取上清液，測(cè)定其吸光值。為避免待測(cè)溶液自身顏色的干擾，以同濃度下的待測(cè)溶液作為調(diào)零對(duì)照。每組試驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.3.7.5 胞外蛋白含量測(cè)定

1）蛋白標(biāo)曲的繪制

參考Vaara[18]的方法，略做改動(dòng)。以0.15 mol/mL的氯化鈉水溶液為溶劑，精密配制1 mg/mL的牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液，備用。從中分別精密吸取0.00、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mL置于6支具塞刻度試管中，添加0.15mol/mL的氯化鈉水溶液至終體積為0.10mL，后加入考馬斯亮藍(lán)G-250染液5mL，室溫靜置15min，利用紫外-可見(jiàn)光分光光度計(jì)測(cè)定不同濃度標(biāo)準(zhǔn)液吸光值，檢測(cè)波長(zhǎng)為595nm。每組試驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

2）菌液胞外蛋白的測(cè)定

參考Vaara[18]的方法，略做改動(dòng)。試驗(yàn)組和對(duì)照組同上1.3.7.1。接入適量的金黃色葡萄球菌菌懸液，37℃、120 r/min條件下，連續(xù)培養(yǎng)24h，每隔2h取一次樣，取適量菌懸液，4000r/min離心10min，取上清液，測(cè)定其吸光度。為避免待測(cè)溶液自身顏色的干擾，以同濃度下的待測(cè)溶液作為調(diào)零對(duì)照。每組試驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010進(jìn)行基礎(chǔ)數(shù)據(jù)整理，采用SPSS 22.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，作圖采用Origin 8.5繪圖軟件。

2 結(jié)果與討論

2.1 洋甘菊殘?jiān)鳂O性部位中化合物的鑒定及含量測(cè)定

洋甘菊殘?jiān)鳂O性部位中化合物的鑒定結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 洋甘菊殘?jiān)鳂O性部位中化合物的鑒定結(jié)果Table 1 Identification of compounds in polar parts of chamomile residue

由表1可知，水相中含有酚酸類化合物、多糖、黃酮類化合物，洋甘菊殘?jiān)鳂O性部位都含有黃酮類化合物。

洋甘菊殘?jiān)煌瑯O性部位中酚酸、多糖、黃酮類化合物的含量結(jié)果如表2所示。

表2 不同極性部位中酚酸、多糖、黃酮類化合物的含量Table 2 Content of phenolic acids，polysaccharides，and flavonoids in different polar parts

由表2可知，不同極性部位中酚酸類化合物和多糖存在水相中；各相萃取物中均含有黃酮類化合物，其含量由大到?。阂宜嵋阴ポ腿∥铮径燃淄檩腿∥铮菊〈驾腿∥铮臼兔演腿∥铮舅?。

2.2 抑菌活性檢測(cè)結(jié)果

2.2.1 最小抑菌濃度測(cè)定結(jié)果

最小抑菌濃度可作為評(píng)價(jià)體外抑菌物質(zhì)抑菌活性強(qiáng)弱的指標(biāo)，其值越小，說(shuō)明樣品對(duì)菌的抑制效果越好。洋甘菊殘?jiān)謽O萃取后對(duì)于各菌種的最小抑菌濃度如表3所示。

表3 殘?jiān)謽O萃取后對(duì)于各菌種的最小抑菌濃度Table 3 MIC of the residue for each bacterial species after separate extraction of the residue

如表3所示，綜合比較，洋甘菊殘?jiān)宜嵋阴?、正丁醇萃取物?duì)4種供試菌的抑菌效果更好，其中乙酸乙酯萃取物對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用最強(qiáng)，MIC為15.63mg/mL；其次為枯草芽孢桿菌，MIC為31.25mg/mL；而二氯甲烷和乙酸乙酯萃取物對(duì)銅綠假單胞菌抑菌效果較好，MIC均為62.50 mg/mL；正丁醇和乙酸乙酯萃取物對(duì)大腸桿菌具有較好的抑菌效果，MIC為250.00 mg/mL；石油醚相和二氯甲烷相并不能很好地抑制大腸桿菌的生長(zhǎng)。

2.2.2 抑菌圈測(cè)定結(jié)果

在相同濃度下，洋甘菊殘?jiān)?種溶劑萃取物對(duì)4種供試菌種均有一定的抑制作用，不同極性萃取物對(duì)4種供試菌的抑菌效果存在明顯差異。洋甘菊殘?jiān)謽O萃取后對(duì)于各菌種的抑菌圈大小如表4所示。

表4 殘?jiān)謽O萃取后對(duì)于各菌種的抑菌圈大小Table 4 Size of the inhibition zone for each strain after separate extraction of the residue

由表4可知，乙酸乙酯萃取物對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌的抑菌活性均為最佳。體外抑菌試驗(yàn)結(jié)果表明，洋甘菊殘?jiān)?種溶劑萃取物對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌的抑菌效果強(qiáng)于革蘭氏陰性菌，由于革蘭氏陰性菌的細(xì)胞壁由外膜和周質(zhì)間隙組成，外膜由脂多糖、磷脂、蛋白質(zhì)和脂蛋白等復(fù)合構(gòu)成，周質(zhì)間隙是一層薄的肽聚糖。外膜的存在構(gòu)成了不對(duì)稱的膜結(jié)構(gòu)，因此形成對(duì)親水性及疏水性物質(zhì)的滲透屏[19]，影響了抑菌效果。綜合MIC和抑菌圈的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)乙酸乙酯萃取物對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用最佳，其最小抑菌濃度為15.63 mg/mL，同時(shí)抑菌圈直徑也顯示出比較高的抑菌活性。

2.3 洋甘菊殘?jiān)志行Р课粚?duì)金黃色葡萄球菌抑制的測(cè)定結(jié)果

2.3.1 生長(zhǎng)曲線測(cè)定結(jié)果

乙酸乙酯萃取物對(duì)金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)曲線的影響如圖1所示。

圖1 乙酸乙酯萃取物對(duì)金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)曲線的影響Fig.1 Effect of ethyl acetate extract on the growth curve of Staphylococcus aureus

由圖1可知，前6 h內(nèi)，對(duì)照組金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)緩慢，屬于菌落生長(zhǎng)遲緩期，在6 h～16 h期間，細(xì)菌生長(zhǎng)較快，屬于菌落生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期；在16 h后，金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)速度較緩慢，菌落進(jìn)入穩(wěn)定區(qū)；對(duì)照組菌落生長(zhǎng)長(zhǎng)勢(shì)較好，不同時(shí)期菌落特征明顯，與試驗(yàn)組形成明顯對(duì)比。1/2MIC和MIC乙酸乙酯萃取物處理的菌落生長(zhǎng)趨勢(shì)緩慢，從16 h開(kāi)始，菌落生長(zhǎng)速度增快。以上研究表明，洋甘菊殘?jiān)宜嵋阴ハ噍腿∥飳?duì)金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)有抑制作用。

2.3.2 電導(dǎo)率測(cè)定結(jié)果

細(xì)菌菌體的電導(dǎo)率變化可直觀地反映細(xì)胞膜通透性的變化規(guī)律，根據(jù)培養(yǎng)基電導(dǎo)率的變化狀況，可以推測(cè)培養(yǎng)基中的微生物種類和數(shù)量[20]。乙酸乙酯萃取物對(duì)金黃色葡萄球菌作用后的電導(dǎo)率如圖2所示。

圖2 乙酸乙酯萃取物對(duì)金黃色葡萄球菌作用后的電導(dǎo)率Fig.2 Conductivity of ethyl acetate extract against Staphylococcus aureus

由圖2可知，金黃色葡萄球菌培養(yǎng)2 h后，試驗(yàn)組菌體培養(yǎng)液的電導(dǎo)率明顯升高，且試驗(yàn)組電導(dǎo)率高于對(duì)照組，MIC組高于1/2MIC組。說(shuō)明洋甘菊殘?jiān)宜嵋阴ポ腿∥飳?duì)金黃色葡萄球菌細(xì)胞膜的通透性有一定的改變，試驗(yàn)組的電導(dǎo)率高于對(duì)照組，可能是由于試驗(yàn)組釋放到胞外的離子較多，導(dǎo)致溶液中離子含量增多。

2.3.3 細(xì)胞壁完整性測(cè)定結(jié)果

堿性磷酸酶（AKP）大多存在于細(xì)胞壁與細(xì)胞膜間。當(dāng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)受到破壞，AKP由胞內(nèi)滲出。因此，可通過(guò)檢測(cè)AKP的活力來(lái)判斷其對(duì)菌體細(xì)胞壁的破壞情況[21]。乙酸乙酯萃取物對(duì)金黃色葡萄球菌作用后的胞外AKP變化如圖3所示。

圖3 乙酸乙酯萃取物對(duì)金黃色葡萄球菌堿性磷酸酶的影響Fig.3 Effect of ethyl acetate extract on the alkaline phosphatase of Staphylococcus aureus

由圖3可知，對(duì)照組和1/2MIC組的胞外AKP含量隨著時(shí)間的推移增長(zhǎng)緩慢。而MIC組，其胞外AKP的含量隨時(shí)間的增長(zhǎng)呈明顯上升趨勢(shì)，且在各時(shí)間點(diǎn)遠(yuǎn)大于對(duì)照組的AKP含量。在6 h～12 h時(shí)，胞外AKP含量迅速增加，說(shuō)明此時(shí)細(xì)胞壁已經(jīng)受到了損傷。對(duì)照組在試驗(yàn)的期間內(nèi)，AKP含量基本不變；從12 h開(kāi)始，添加了乙酸乙酯萃取物的1/2MIC組，其胞外AKP含量開(kāi)始升高。洋甘菊殘?jiān)?jīng)乙酸乙酯提取后，試驗(yàn)組細(xì)菌胞外堿性磷酸酶活力較對(duì)照組明顯增大，且MIC組高于1/2MIC組，說(shuō)明洋甘菊乙酸乙酯萃取物對(duì)金黃色葡萄球菌的細(xì)胞壁有一定的破壞作用，從而導(dǎo)致胞外堿性磷酸酶活力增加。

2.3.4 胞外多糖測(cè)定結(jié)果

多糖的擬合方程為y=4.994 3x+0.003 3，R2=0.999 0。乙酸乙酯萃取物對(duì)金黃色葡萄球菌作用后的胞外多糖含量的變化如圖4所示。

圖4 乙酸乙酯相對(duì)金黃色葡萄球菌作用后胞外多糖的含量變化Fig.4 Changes in the content of extracellular polysaccharides after the action of ethyl acetate on Staphylococcus aureus

由圖4看出，對(duì)照組在16 h后，胞外多糖含量基本不變，維持在0.185 mg/mL；MIC組4 h～16 h胞內(nèi)多糖含量持續(xù)上升，16 h后緩慢上升，24 h達(dá)到最大值，為0.582 mg/mL，試驗(yàn)組的胞外多糖含量明顯上升。可見(jiàn)洋甘菊殘?jiān)宜嵋阴ハ嗵崛∥飳?duì)金黃色葡萄球菌的細(xì)胞膜有一定的破壞性，并且隨著樣品濃度增大，胞外多糖含量變多，說(shuō)明對(duì)細(xì)胞膜的破壞性越強(qiáng)。

2.3.5 胞外蛋白測(cè)定結(jié)果

胞外蛋白的擬合方程為y=2.510 3x+0.048 2，R2=0.997 2。乙酸乙酯相對(duì)金黃色葡萄球菌作用后的胞外蛋白含量的變化如圖5所示。

圖5 乙酸乙酯相對(duì)金黃色葡萄球菌作用后胞外蛋白的含量變化Fig.5 Changes in the content of extracellular protein after the action of ethyl acetate on Staphylococcus aureus

由圖5看出，隨著金黃色葡萄球菌培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，洋甘菊殘?jiān)宜嵋阴ポ腿∥镌囼?yàn)組細(xì)菌胞外蛋白質(zhì)含量明顯升高，而對(duì)照組細(xì)菌胞外蛋白質(zhì)含量的變化較小。洋甘菊殘?jiān)宜嵋阴ハ噍腿∥锾幚?2 h后，MIC處理組的胞外蛋白質(zhì)含量明顯高于1/2MIC處理組和對(duì)照組；在反應(yīng)時(shí)長(zhǎng)為20 h，MIC處理組是1/2MIC處理組的0.64倍，處理效果極顯著；在反應(yīng)時(shí)長(zhǎng)為22 h，MIC處理組是對(duì)照組的6.87倍，處理效果極顯著；在反應(yīng)時(shí)長(zhǎng)為22 h，1/2MIC處理組是對(duì)照組的3.93倍，處理效果極顯著。這可能是由于洋甘菊殘?jiān)宜嵋阴ハ嗵崛∥锸沟媒瘘S色葡萄球菌的細(xì)胞膜受到嚴(yán)重破壞，從而導(dǎo)致胞內(nèi)蛋白質(zhì)外溢。

3 結(jié)論

通過(guò)探究抑菌作用及抑菌機(jī)理的研究，發(fā)現(xiàn)洋甘菊醇提物經(jīng)分極萃取后的各相的確有抑菌的作用。經(jīng)分級(jí)萃取后對(duì)本試驗(yàn)選取4種菌種均有一定的抑制作用，其中乙酸乙酯相抑菌效果最佳，對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC可達(dá)到15.63 mg/mL，抑菌圈直徑可達(dá)19.73 mm。通過(guò)對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌機(jī)理探究發(fā)現(xiàn)，德國(guó)洋甘菊醇提物乙酸乙酯相試驗(yàn)組對(duì)抑制金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)有所抑制；菌體的電導(dǎo)率隨時(shí)間的變化也有所改變；試驗(yàn)組的胞外多糖、蛋白含量增加；由各試驗(yàn)指標(biāo)結(jié)果可看出，MIC組對(duì)金黃色葡萄球菌的細(xì)胞壁完整性破壞較明顯，通過(guò)測(cè)定胞外物質(zhì)含量，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞膜受到損壞，有改變細(xì)胞膜的通透性作用，最終達(dá)到抑菌的效果。

經(jīng)鑒定多糖、酚酸由于極性較大，且含量較少僅在水相中被測(cè)出；在極性較小的萃取相中，多糖和酚酸存在可能性較低。黃酮類化合物的極性較小且易溶于醇，乙酸乙酯萃取相中含量最高，試驗(yàn)證明洋甘菊殘?jiān)懈缓S酮類化合物。經(jīng)測(cè)定得出洋甘菊殘?jiān)煌瑯O性部位中，乙酸乙酯萃取物對(duì)金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的抑制效果最好。通過(guò)對(duì)抑菌作用及抑菌機(jī)制的研究，發(fā)現(xiàn)洋甘菊殘?jiān)崛∥镉幸志^好的抑菌效果，通過(guò)分極萃取后的乙酸乙酯相抑菌效果最佳；通過(guò)對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌機(jī)制探究發(fā)現(xiàn)，洋甘菊殘?jiān)宜嵋阴ハ嗵崛∥镆种平瘘S色葡萄球菌的生長(zhǎng)，使細(xì)胞膜受到損壞，提高導(dǎo)電率，從而使胞外多糖、蛋白含量增加。

探究抑菌作用及抑菌機(jī)制，進(jìn)一步對(duì)其化學(xué)成分進(jìn)行分析鑒定，確定活性物質(zhì)基礎(chǔ)，以明確新疆產(chǎn)的德國(guó)洋甘菊殘?jiān)鳛樘烊灰志鷦?、防腐劑的潛在?yīng)用價(jià)值，有效擴(kuò)充了菊科植物化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)，為洋甘菊的質(zhì)量控制和合理應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)，促進(jìn)新疆地區(qū)菊科資源的深度開(kāi)發(fā)與高值化利用。