體外模擬消化對紫薯桑葚復合口服液抗氧化成分及其活性影響

劉靜，牛秀梅，王美美，胡雨晴，張瑞，高惠穎，呂長鑫*

（1.渤海大學食品科學與工程學院，遼寧省食品安全重點實驗室，生鮮農產品貯藏加工及安全控制技術國家地方聯(lián)合工程研究中心，遼寧 錦州 121013；2.錦州市檢驗檢測認證中心，遼寧 錦州 121013）

紫薯（purple sweet potato）又名黑薯、紫紅薯[1]，富含花青素、多糖和礦物質等多種營養(yǎng)成分[2-3]。桑葚（mulberry）又名桑果，富含黃酮醇、花青素等活性物質，適合用于開發(fā)具有保健功能的產品[4-5]。隨著大眾對養(yǎng)生的關注度越來越高，保健類口服液逐漸成為熱銷產品，市場上出現(xiàn)的保健口服液多以美白、抗衰老、抗疲勞等功效迎合消費者需求。目前，尚未見有紫薯桑葚復合口服液的研究，因此以紫薯和桑葚為原料進行紫薯桑葚口服液的研究，具有很大的開發(fā)前景[6]。

目前針對復合口服液在消化過程中活性成分變化及抗氧化活性變化規(guī)律的研究較少，體外模擬消化具有成本低、易于操控等優(yōu)點[7-8]。故本試驗以紫薯為原料進行提取濃縮制得紫薯提取液，用桑葚汁進行復合調配，制備一款具有較高生物活性成分的復合口服液，并采用體外模擬胃腸消化法，以總酚、黃酮、花色苷含量為指標評價此款復合口服液在消化過程中的活性物質變化規(guī)律以及抗氧化能力的變化，為綜合評價紫薯桑葚復合口服液的營養(yǎng)價值提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紫薯：遼寧省錦州市春利農業(yè)發(fā)展科技有限公司；桑葚：遼寧省葫蘆島市南票區(qū)虹螺峴鎮(zhèn)虹南村小南溝屯；白砂糖、檸檬酸（食品級）：市售；豬膽鹽、胃蛋白酶（250 000 U/g）、胰蛋白酶（10 000 U/g）、2，2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽[2，2'-azinobis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate），ABTS]、1，1- 二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）（均為分析純）：北京索萊寶科技有限公司；α-淀粉酶（50 000 U/g）、糖化酶（50 000 U/g）（均為食品級）：江蘇銳康萊科技有限公司。

1.2 儀器與設備

紫外可見分光光度計（UV-2700）：日本島津儀器有限公司；冷凍離心機（5804R）：德國艾本德公司；冷凍水浴恒溫振蕩器（SHA-2）：金壇市瑞華儀器有限公司。

1.3 工藝流程

1.4 方法

1.4.1 操作要點

紫薯提取液制備：將紫薯切片烘干粉碎后過60目篩備用。稱取10 g紫薯粉加入0.1%α-淀粉酶、0.15%糖化酶、300 mL 70%（體積分數(shù)）乙醇溶液，振蕩混合均勻。200 W超聲波輔助提取40 min、85℃滅酶5 min、50℃真空濃縮、定容至100 mL，即得紫薯提取液。

桑葚汁制備：桑葚解凍、打漿（6 000 r/min，2 min）、酶解（果膠酶0.06%、纖維素酶0.09%，48℃攪拌酶解120 min），粗濾兩次后離心得桑葚原汁。

紫薯桑葚復合口服液制備：將紫薯提取液和桑葚汁按照一定的質量比混合，加入白砂糖和檸檬酸進行調配，灌裝殺菌即得紫薯桑葚復合口服液。

1.4.2 紫薯桑葚復合口服液配方優(yōu)化試驗

1.4.2.1 單因素試驗

以紫薯提取液與桑葚汁質量比3∶4、檸檬酸0.02%、白砂糖4%為固定參數(shù)，考察紫薯提取液與桑葚汁質量比（2∶5、3∶4、4∶3、5∶2、6∶1）、檸檬酸添加量（0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%）、白砂糖添加量（2%、3%、4%、5%、6%）對紫薯桑葚復合口服液感官評分的影響。

1.4.2.2 正交試驗設計

根據(jù)單因素試驗結果，設計L9（34）正交試驗優(yōu)化紫薯桑葚復合口服液配方。正交試驗因素水平見表1。

表1 正交試驗因素水平Table 1 Factors and levels of the orthogonal test

1.4.2.3 感官評價

參考GB 7101—2015《食品安全國家標準飲料》感官要求規(guī)定，以100為滿分，各項占比為色澤∶氣味∶口感∶組織狀態(tài)=2∶3∶3∶2，依據(jù)紫薯桑葚復合口服液的特點制定出產品感官評價標準，如表2所示。

表2 紫薯桑葚復合口服液評價標準Table 2 Standard for evaluation of purple sweet potato and mulberry compound oral liquid

1.4.3 體外模擬胃腸消化

體外模擬胃腸消化參考Estévez-Santiago等[9]的方法，略作修改。

模擬胃消化：取1mL樣品加入19mL生理鹽水，用1 mol/L的HCl溶液調節(jié)pH值至2.0，將樣品分為3組。

式中：N樣品稀釋倍數(shù)；M為矢車菊素-3-O-葡萄糖苷摩爾質量，449.38 g/mol；ε為消光系數(shù)，26 900 L/（mol·cm）；L 為光程，1 cm。

1.4.4.2 總酚含量測定

參考王儲炎等[11]的方法，配制0.1 mg/mL沒食子酸溶液，分別取 0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL，加 0.5 mL 福林酚試劑，1 min后加1.5 mL 15%Na2CO3溶液，蒸餾水定容，室溫避光1 h，于765 nm處測定吸光度，繪制沒食子酸標準曲線，方程為y=67.086x+0.015，R2=0.999。準確量取0.1mL口服液代替沒食子酸溶液，按上述步驟測定，根據(jù)沒食子酸標準曲線方程計算總酚含量，結果以每毫升口服液所含沒食子酸當量（mg GAE/mL）表示。模擬胃液消化組：加4mL胃液（0.2g胃蛋白酶溶于10mL 0.01 mol/L HCl溶液）；胃酸對照組：加4 mL 0.01 mol/L的鹽酸；空白組：加4 mL生理鹽水。

模擬腸消化：模擬胃消化之后，將樣品用1 mol/L的NaHCO3溶液調節(jié)pH值至7.0，將樣品分為2組。腸液消化組：加入4 mL胰蛋白酶-膽汁混合液（1.9 g豬膽鹽和0.3 g胰蛋白酶溶于60 mL 0.1 mol/L NaHCO3緩沖溶液）；空白組以等量的0.1 mol/L的NaHCO3緩沖液代替。

將上述各組待測溶液于37℃恒溫水浴振蕩2 h，分別消化 0、0.5、1.0、1.5、2.0 h，取出部分樣品經8 000 r/min離心10 min，取上清液用于指標測定。

1.4.4 體外模擬消化過程中活性成分測定

1.4.4.1 花色苷含量測定

采用pH示差法[10]，取1 mL口服液樣品，各加9 mL pH1.0和pH4.5的緩沖液，室溫避光靜置1 h，以1 mL蒸餾水代替口服液樣品，為空白對照，分別于510 nm和700 nm 處測吸光度（A510nm、A700nm），紫薯桑葚復合口服液中花色苷含量按式（2）進行計算。

1.4.4.3 黃酮含量測定

參考Somboonpanyakul等[12]的方法，配制0.2 mg/mL蘆丁溶液，分別取 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL，每隔5 min依次加1.0mL5%NaNO2、1.0 mL 10%Al（NO3）3和10 mL 4%NaOH，60%乙醇定容，靜置15 min，于510 nm處測吸光度，繪制蘆丁標準曲線方程為y=7.148 6x+0.005，R2=0.999 9。準確量取1 mL口服液代替蘆丁溶液，按上述步驟測定，根據(jù)蘆丁標準曲線方程計算黃酮含量，結果以每毫升口服液所含蘆丁當量（mg RE/mL）表示。

1.4.5 體外模擬消化過程中抗氧化活性測定

1.4.5.1 DPPH自由基清除率測定

根據(jù)Pezeshk等[13]的方法，取0.1 mL口服液樣品與3.9 mL 0.1 mg/mL DPPH溶液混合，室溫避光靜置30 min，于517 nm處測吸光度記為A1；以無水乙醇代替口服液樣品測吸光度記為A0；以無水乙醇代替DPPH溶液測吸光度記為A2，DPPH自由基清除率計算公式如下。

1.4.5.2 ABTS+自由基清除率測定

參考Kiselova等[14]的方法，制備ABTS工作液。取50 μL口服液樣品與3.5mLABTS工作液混勻，在734nm處測定吸光度記為A1；無水乙醇代替口服液樣品測吸光度記為A0；用緩沖液代替ABTS溶液測定吸光度記為A2，ABTS+自由基清除率計算公式如下。

1.4.5.3 羥自由基清除率測定

根據(jù)Li等[15]的方法并進行改進，取0.1 mL口服液樣品，依次加 2 mL 6 mmol/L FeSO4、6 mmol/L H2O2和6 mmol/L水楊酸，37℃水浴30 min，于510 nm測吸光值記為A1；用蒸餾水代替口服液樣品測定吸光度記為A0；蒸餾水代替H2O2溶液測定吸光度記為A2，羥自由基清除率計算公式如下。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 23.0軟件進行顯著性分析，p＜0.05表示差異顯著，應用Origin 9.0及Excel繪制圖形。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 紫薯提取液與桑葚汁質量比對感官評分的影響

當紫薯提取液和桑葚汁質量比為4∶3時感官評分最高，且風味協(xié)調，顏色呈亮紫黑色；當質量比小于4∶3時，口服液桑葚味突出，呈現(xiàn)暗紫色且沉淀較明顯；當質量比大于4∶3時，味道偏清淡且具有明顯的熟后“番薯味”，不易被大眾接受。因此紫薯提取液與桑葚汁質量比選擇4∶3，此時風味更協(xié)調。

2.1.2 白砂糖添加量對感官評分的影響

當白砂糖添加量為2%～4%時，感官評分隨白砂糖添加量的增加而升高，此時紫薯提取液的苦澀味逐漸減弱；當白砂糖添加量高于4%時，感官評分下降，過量添加白砂糖使得紫薯桑葚復合口服液口感偏甜，不易被大眾接受，同時也掩蓋了紫薯和桑葚特有風味。綜合考慮，選擇白砂糖添加量4%，此時制得口服液甜度適宜。

2.1.3 檸檬酸添加量對感官評分的影響

當檸檬酸添加量高于0.03%時，感官評分迅速下降，這是因為過大的酸味使得紫薯桑葚復合口服液原有風味遭到破壞，因此選擇檸檬酸添加量0.03%，此時酸度最適宜。

2.2 正交試驗結果

在單因素試驗基礎上進行L9（34）正交試驗，試驗結果見表3，方差分析結果見表4。

表3 正交試驗結果Table 3 Results of the orthogonal experiment

表4 正交試驗方差分析結果Table 4 Results of variance analysis of orthogonal experiment

由表3試驗結果可知最佳配方為A2B2C1，由表4可知，紫薯提取液與桑葚汁質量比、白砂糖添加量對口服液感官品質影響較為顯著（p＜0.05）。對正交試驗優(yōu)化的最佳配方進行驗證試驗，感官評分為83.42。因此，可確定該產品最佳配方：紫薯提取液與桑葚汁以質量比4∶3復合、添加量95.98%，白砂糖添加量4%，檸檬酸添加量0.02%，制得的紫薯桑葚復合口服液口感適宜、風味協(xié)調。

2.3 體外模擬消化過程中活性物質變化

2.3.1 總酚含量的變化

模擬消化過程中總酚含量變化見圖1。

圖1 模擬消化過程中總酚含量變化Fig.1 Changes in total phenol content during simulated digestion

如圖1所示，紫薯桑葚復合口服液在模擬胃液消化 0.5 h時，總酚含量顯著上升（p＜0.05），0.5 h～1.0 h顯著下降（p＜0.05）后趨于穩(wěn)定，相反，胃酸和胃空白對照組的總酚含量在0.5 h時顯著下降（p＜0.05）。并且在模擬胃消化2.0 h內胃液消化組＞胃酸對照組＞胃空白對照組，這說明胃蛋白酶和酸性條件對紫薯桑葚復合口服液中多酚的釋放有促進作用，這可能是胃蛋白酶能夠分解大分子蛋白質，使得某些與蛋白質結合的酚類物質得以釋放，此外酸性條件下酚類物質易發(fā)生水解，使得酚含量增加[16-17]。在模擬腸消化過程中，0 h時總酚含量與模擬胃消化相比顯著下降，可能是某些酸性酚類化合物在中性環(huán)境下發(fā)生降解生成了其他物質[18]；0～1.0 h 顯著上升（p＜0.05），可能是由于與多糖以酯鍵形式結合形成糖苷的多酚分子在酶的作用下水解釋放，導致整體酚羥基含量有所上升[19]。

2.3.2 黃酮含量的變化

模擬消化過程中黃酮含量變化見圖2。

圖2 模擬消化過程中黃酮含量變化Fig.2 Changes in flavonoid content during simulated digestion

如圖2所示，模擬胃液消化0～0.5 h黃酮含量顯著上升（p＜0.05），0.5 h～2.0 h趨于穩(wěn)定；胃酸對照組在 1.5 h達到最大值7.74 mg RE/mL，是初始值的1.06倍；胃空白對照組無顯著變化。這表明胃蛋白酶和胃酸對紫薯桑葚復合口服液黃酮釋放量均起促進作用。模擬腸消化過程中，腸液消化組與腸空白對照組的黃酮變化規(guī)律基本一致。0～0.5 h內黃酮含量降低，可能是因為黃酮類物質在環(huán)境變化情況下不穩(wěn)定所致；0.5 h～1.0 h黃酮含量顯著提高（p＜0.05），推測可能是某些復合的黃酮類大分子受環(huán)境、胰蛋白酶等影響，分解為黃酮小分子[20]；1.0 h～2.0 h 整體上顯著下降（p＜0.05）可能是損失量大于降解釋放量。

2.3.3 花色苷含量的變化

模擬消化過程中花色苷含量變化見圖3。

圖3 模擬消化過程中花色苷含量變化Fig.3 Changes in anthocyanin content during simulated digestion

如圖3所示，胃液消化組的花色苷含量在1.5 h時顯著上升（p＜0.05），1.5 h～2.0 h 有所下降，即花色苷含量隨著胃液消化的進行先上升后下降，這與Huang等[21]和Tagliazucchi等[22]的研究結果相似；胃酸對照組和胃空白對照組變化不顯著（p＞0.05），可能由于酸性環(huán)境下胃蛋白酶水解蛋白質，促進花色苷釋放，這與劉翼翔等[23]研究藍莓花色苷體外模擬消化實驗結果基本一致。在模擬腸消化過程中，模擬腸消化2.0 h時腸液消化組花色苷含量下降程度比腸空白對照組更顯著（p＜0.05），這表明腸消化環(huán)境對花色苷含量有顯著影響，因為中性條件下花色苷不穩(wěn)定易發(fā)生降解。

2.4 模擬胃腸消化過程中抗氧化活性變化

2.4.1 DPPH自由基清除率

模擬消化過程中DPPH自由基清除率變化見圖4。

圖4 模擬消化過程中DPPH自由基清除率變化Fig.4 Changes in DPPH radical scavenging capacity during simulated digestion

如圖4所示，模擬胃消化2 h時，胃液消化組、胃酸對照組和胃空白對照組DPPH自由基清除率均顯著上升（p＜0.05），且時胃液消化組＞胃酸對照組＞胃空白對照組，這表明胃蛋白酶以及酸性條件協(xié)同促進了DPPH自由基清除能力的提升。結合圖2～圖4可知，紫薯桑葚復合口服液在模擬消化過程中黃酮和花色苷含量與DPPH自由基清除能力變化規(guī)律相似，表明模擬胃消化過程中黃酮和花色苷對DPPH自由基清除能力起重要作用。腸液消化組中DPPH自由基清除率在模擬腸消化2 h時顯著上升（p＜0.05），腸空白對照組顯著下降（p＜0.05），這說明胰酶對DPPH自由基清除能力有一定的影響。

2.4.2 ABTS+自由基清除率

模擬消化過程中ABTS+自由基清除率變化見圖5。

圖5 模擬消化過程中ABTS+自由基清除率變化Fig.5 Changes in ABTS+radical scavenging capacity during simulated digestion

如圖5所示，模擬胃液消化2 h時，ABTS+自由基清除率在胃液以及胃酸作用下均顯著上升（p＜0.05），胃空白對照組無顯著變化（p＜0.05），胃液消化組和胃酸對照組的ABTS+自由基清除率分別上升到86.87%和84.15%，這表明胃蛋白酶和酸性條件均能夠增強ABTS+自由基清除率。模擬腸消化階段，與0h相比，腸液消化組ABTS+自由基清除率在0.5h～2.0h顯著上升（p＜0.05）；腸空白對照組 2 h時無顯著差異（p＞0.05），這表明胰蛋白酶和膽汁可增強ABTS+自由基清除能力。

2.4.3 羥自由基清除率

模擬消化過程中羥自由基清除率變化見圖6。

圖6 模擬消化過程中羥自由基清除率變化Fig.6 Changes in hydroxyl radical scavenging capacity during simulated digestion

如圖6所示，胃液消化組在1.0 h時，羥自由基清除能力顯著上升（p＜0.05）后逐漸趨于穩(wěn)定，胃酸對照組和胃空白對照組在0.5 h內顯著下降（p＜0.05）。羥自由基清除能力依次為胃液消化組＞胃酸對照組＞胃空白對照組，說明胃蛋白酶和胃酸環(huán)境對羥自由基清除能力有一定的影響。模擬腸消化階段，腸液消化組0.5 h時，羥自由基清除能力顯著上升（p＜0.05），在1.5 h后有所下降；腸空白對照組0.5 h時，顯著下降（p＜0.05），最終腸液消化組的清除能力略高于腸空白對照組，這表明胰蛋白酶和膽汁前期可增強羥自由基清除率，后期受到環(huán)境等多方面影響導致羥自由基清除率下降。觀察圖1、圖4～圖6可知，紫薯桑葚復合口服液在模擬腸消化過程中總酚含量與DPPH、ABTS+和羥自由基清除能力變化規(guī)律相似，表明模擬腸消化過程中酚類化合物在抗氧化活性中作用效果明顯。

2.5 模擬胃腸消化過程中活性物質含量與抗氧化能力之間相關性分析

活性物質含量與抗氧化能力相關性分析見表5。

表5 活性物質含量與抗氧化能力相關性分析Table 5 Correlation analysis between active substance content and antioxidant activity

如表5所示，在模擬胃消化過程中黃酮含量與DPPH自由基清除率、羥自由基清除率相關性顯著（p＜0.05），相關系數(shù)分別為0.879和0.910，黃酮含量與ABTS+自由基清除率相關系數(shù)為0.336，說明兩者相關性不高；花色苷含量與DPPH自由基清除率之間相關系數(shù)為0.902，兩者相關性顯著（p＜0.05），花色苷含量與ABTS+、羥自由基清除率相關系數(shù)分別為0.542和0.821，相關性不顯著（p＜0.05）。在模擬腸消化階段總酚含量與DPPH、ABTS+及羥自由基清除率呈現(xiàn)良好正相關性（p＜0.05），相關系數(shù)分別為 0.919、0.921和0.924?？偟膩碚f模擬胃消化過程中，胃蛋白酶作用有利于抗氧化活性物質釋放，且黃酮與花色苷含量對抗氧化活性貢獻較高，模擬腸消化過程中多酚類化合物在抗氧化活性中起重要作用。

3 結論

本試驗以紫薯和桑葚為主要原料，通過正交試驗優(yōu)化了口服液最佳配方：紫薯提取液與桑葚汁以4∶3的質量比復合，按紫薯提取液與桑葚汁復合添加量95.98%、白砂糖添加量4%、檸檬酸添加量0.02%進行調配時，口感最佳。采用體外模擬胃腸消化法，檢測口服液活性物質釋放規(guī)律。在體外模擬胃消化階段活性物質含量總體呈上升趨勢，其中總酚含量上升了1.31%、黃酮含量上升了4.67%、花色苷釋放量提高了2.81%；在體外模擬腸消化階段，總酚含量顯著上升（p＜0.05）。此外經過體外模擬消化后，抗氧化能力均有所增強，這表明紫薯桑葚復合口服液具有較好的抗氧化活性，經相關性分析進一步驗證了不同消化階段活性物質含量與抗氧化能力呈良好的相關性。此研究對開發(fā)紫薯和桑葚保健類產品具有一定的技術指導與參考價值。