超微粉碎對(duì)牛蒡根粉多酚及抗氧化活性的影響

陳元震， 胡昕迪， 方旭波， 黃午陽， 李 瑩， 陳小娥

(1.浙江海洋大學(xué)食品與藥學(xué)專業(yè)，浙江舟山 316022； 2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，江蘇南京 210014)

自然界植物中含有豐富的酚類物質(zhì)，天然酚酸通常以游離態(tài)和結(jié)合態(tài)存在于植物的皮、根、木、葉和果實(shí)中[1]。大量試驗(yàn)數(shù)據(jù)證明，植物中的酚類物質(zhì)具有多種生物活性，在抗氧化、抗菌、抗蟲、抗病毒等方面發(fā)揮著重要作用。這類化合物包括黃酮類化合物和羥基肉桂酸等，牛蒡是這2種化合物的重要天然來源。牛蒡(ArctiumlappaL.)別稱牛蒡子(burdock)，是桔梗目菊科二年生草本植物，在亞洲已有3 000多年種植歷史。因具有保肝、抗炎和抗氧化的潛在治療特性而被作為一種營養(yǎng)和功能食品廣泛推廣[2]。與市面上使用的靈芝、人參等名貴藥材相比，牛蒡不僅具有多種食用和治療價(jià)值，且價(jià)格低廉易于栽培[3]。目前，在我國牛蒡根主要以菜品的形式在餐桌上呈現(xiàn)。為加大牛蒡的開發(fā)利用度，我們可將牛蒡根深加工制成粉末，添加到各種食品中作為功能性食品補(bǔ)充劑。物料利用程度和粉體理化性質(zhì)密切相關(guān)，不同的生產(chǎn)工藝對(duì)原料的理化性質(zhì)和生物活性有重要影響，粉碎工藝對(duì)粉體的特性和粒度起到關(guān)鍵作用。

超微粉碎技術(shù)是近年來一種新興的加工技術(shù)，通常被應(yīng)用于生物技術(shù)、制藥工業(yè)和食品加工等領(lǐng)域。與傳統(tǒng)制備技術(shù)相比，超微粉碎技術(shù)具有更大的潛力和發(fā)展空間[4]。在加工特性方面，由于物料在短時(shí)間內(nèi)被強(qiáng)烈粉碎，超微粉的表面發(fā)生變化，導(dǎo)致微粉顯現(xiàn)出一些粗顆粒所不具有的特性，這種特性主要表現(xiàn)為高溶解性、高分散性、高吸附性和高流動(dòng)性[5]。在化學(xué)組成方面，超微粉碎技術(shù)提高了植物細(xì)胞壁的破碎程度，有利于存在于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核的有效活性成分溶出，增加了活性物質(zhì)提取效率、抗氧化性能和生物利用度[6]。此外，超微粉碎對(duì)物料物理特性，如熱力學(xué)性質(zhì)、結(jié)晶度、官能團(tuán)變化等也有一定影響[7]。由此可見，超微粉碎適合于方便食品和速食食品的生產(chǎn)。

超微粉碎技術(shù)對(duì)牛蒡根粉的影響尚未見報(bào)道。因此，本研究旨在比較超細(xì)研磨和普通粉碎后，6種不同粒徑牛蒡根粉在顆粒特征、多酚含量、抗氧化活性及生物利用度方面的區(qū)別，以期為牛蒡根粉在速食食品和有效藥物成分的應(yīng)用中提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛蒡根，購自江蘇省豐縣。氫氧化鈉、氯化鉀、磷酸鉀、碳酸氫鈉、沒食子酸、福林酚等為分析純?cè)噭?，購自百靈威化學(xué)試劑有限公司。濃硫酸、鹽酸、乙酸乙酯、甲醇等為分析純?cè)噭徸試幖瘓F(tuán)化學(xué)試劑有限公司。1，1-二苯基-2-苦基肼基(1，1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl，DPPH)、2，2′-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸[2，2′-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS]、2，4，6-三(2-吡啶基)1，3，5-三嗪[2，4，6-tri(2-pyridyl)1，3，5-triazine，TPTZ]，均購自默克生物科技有限公司。6-羥基-2，5，7，8-四甲基色烷-2-羧酸(6-hydroxy-2，5，7，8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid，Trolox)，購自美國Across Organics公司。胃蛋白酶、黏膜蛋白、豬膽鹽、胰蛋白酶，均購自上海麥克林生化科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

XDW-6A振動(dòng)式細(xì)胞級(jí)超微粉碎機(jī)，購自濟(jì)南達(dá)微機(jī)械有限公司；L3-5K臺(tái)式低速離心機(jī)，購自湖南可成儀器設(shè)備有限公司；RE-52AA型真空減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、SHZ-Ⅲ型循環(huán)水真空泵，購自上海亞榮生化儀器廠；KQ-400DE數(shù)控超聲波清洗機(jī)，購自昆山市超聲儀器有限公司；FDU-1200真空冷凍干燥機(jī)，購自東京理化器械株式會(huì)社；AL104電子分析天平，購自梅特勒托利多科技(中國)有限公司；PHS-2C pH計(jì)，購自上海智光儀器儀表有限公司；UV-6100紫外分光光度計(jì)，購自上海美普達(dá)儀器有限公司；EUROSTAR 40 Digital高速攪拌器，購自德國IKA公司；Avanti J-26S XP落地式高速冷凍離心機(jī)，購自美國Beckman Coulter公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 原料預(yù)處理 選擇大小均勻、無機(jī)械損傷和病蟲害的牛蒡根(采自江蘇省徐州市沛縣，34°43′N、116°56′E)。將新鮮牛蒡洗凈，切成 1～2 cm厚薄片，60 ℃熱風(fēng)干燥成牛蒡干。將牛蒡干分為2個(gè)部分，一部分使用超微粉碎機(jī)進(jìn)行超細(xì)研磨，另一部分使用實(shí)驗(yàn)室常用的普通研磨機(jī)研磨，具體方法見表1，兩種研磨方式得到6種牛蒡根粉。由于牛蒡根粉在空氣中易吸水結(jié)塊、褐變，需遠(yuǎn)離潮濕和光線，存放在密封袋，存于4 ℃冰箱。

表1 牛蒡干制備方法

1.3.2 粒徑分布 粒徑分布采用干式激光衍射儀在室溫下進(jìn)行測量。將1 g牛蒡根粉加入盛有 50 mL 水的燒杯中，攪拌均勻后，放入粒徑儀中進(jìn)行粒徑分布測定。其中，D10、D50、D90分別代表小于粉末粒徑的10%、50%、90%的粒徑累積百分位數(shù)，D(3，2)、D(4，3)、D(2，1)和D(1，0)分別表示面積平均徑、體積平均徑、長度平均徑和數(shù)量平均徑。Span表示牛蒡根粉末粒徑的分布寬度，Φ表示細(xì)胞壁破裂率(當(dāng)D50<10 μm 時(shí)，Φ=1)，以此來表征顆粒大小分布[8]，計(jì)算公式如下所示：

(1)

(2)

1.3.3 游離態(tài)、結(jié)合態(tài)酚類物質(zhì)的提取 參考Juániz等的提取方法[9]，從不同粒徑的牛蒡根粉中提取游離態(tài)多酚。先采用80%甲醇提取3次，后采用6 mol/L鹽酸將上清樣品的pH值調(diào)至2.0，經(jīng)乙酸乙酯重復(fù)萃取后，將萃取相在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)真空下濃縮干燥，甲醇復(fù)溶即得游離態(tài)多酚。保存剩下的殘?jiān)M(jìn)行后續(xù)分析。

參考羅舜菁等的方法[10]，收集提取過游離酚后的剩余殘?jiān)?，采? mol/L NaOH溶液充分溶解，同時(shí)充入N2，室溫避光振蕩4 h后，采用6 mol/L HCl溶液將pH值調(diào)至2.0，離心取上清，加入等量乙酸乙酯萃取分離，重復(fù)操作5次，合并上清液在45 ℃條件下旋蒸，最后采用甲醇定容至10 mL，得到結(jié)合態(tài)多酚，-18 ℃保存。

1.3.4 酚類物質(zhì)含量的測定 參考Apea-Bah等建立的Folin-Ciocalteu法[11]，稍加修改后測定總酚含量。將40 μL福林酚試劑(25%)與20 μL不同濃度梯度的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液(r=0.999)、空白溶液及多酚提取物溶液混合均勻，隨后加入140 μL(700 mmol/L)碳酸鈉溶液，得到200 μL混合物。并在恒溫?fù)u床上以200 r/min的速度振蕩3 min使其混合均勻，室溫孵育30 min，在765 nm處測定吸光度。結(jié)果以1 g干物質(zhì)中所含沒食子酸當(dāng)量(mg GAE/g)表示。

1.3.5 體外抗氧化能力的測定 DPPH 自由基清除能力測定根據(jù)Cheng等的報(bào)道[12]，略有改變。將10 μL標(biāo)準(zhǔn)品溶液、酚類物質(zhì)提取液和空白溶液分別與190 μL濃度為 65 μmol/L 的DPPH自由基溶液混合在96孔板中，在搖床上以100 r/min混勻 1 min，避光孵育 30 min 后，在517 nm處測定吸光度。DPPH自由基清除能力按1 g干物質(zhì)中所含Trolox當(dāng)量(mg TE/g)表示。

ABTS自由基清除能力的測定基于楊靈光報(bào)導(dǎo)的方法[13]，略有變化，準(zhǔn)備1個(gè)自由基備用溶液(7 mmol/L ABTS和2.45 mmol/L K2S2O8)，并在室溫下保持12～16 h，使用前用甲醇溶液在734 nm處調(diào)整備用溶液的吸光度范圍為0.70±0.02，將5 μL樣品和195 μL ABTS溶液混合孵育6 min，在 734 nm 處讀值。ABTS自由基清除能力按1 g干物質(zhì)中所含Trolox當(dāng)量(mg TE/g)表示。

鐵離子還原能力測定。對(duì)鐵離子還原能力的分析參考Benzie等的方法[14]，將濃度為0.3 mol/L的醋酸鈉緩沖液(pH值3.6)、10 mmol/L的TPTZ溶液(由40 mmol/L HCl溶解)和20 mmol/L的氯化鐵溶液按1 ∶1 ∶10的體積比充分混勻，水浴加熱至 37 ℃，得到FRAP溶液。將1 mL樣品加入至5 mL新鮮的FRAP溶液中，然后將混合物避光置于37 ℃的恒溫水域，20 min后取出，在593 nm處讀值。鐵離子還原能力以1 g干物質(zhì)中所含F(xiàn)RAP當(dāng)量(mg FEAC/g)表示。

1.3.6 體外模擬口腔、胃、腸消化 體外消化模擬是由Dong等的方法[15]進(jìn)行修改而成。粉末的體外消化一般經(jīng)過三步，開始于口腔，接著是胃，最后是腸道階段。模擬的唾液、胃液和腸液是由相應(yīng)的消化酶、水、電解液等配制而成。在口服階段，將1 g牛蒡根粉末按照1 g ∶5 mL比例與水、氯化鈉、氯化鉀、檸檬酸鉀、尿素和黏膜蛋白等混合，用1 mol/L HCl將混合物酸化至6.8，并在37 ℃水浴中攪拌 10 min，離心取上清液，-20 ℃儲(chǔ)存；在胃步驟中，將口腔食糜與水、CaCl2和豬胃蛋白酶混合，用 3 mol/L HCl將混合物的pH值降至3.0，然后孵育攪拌2 h，離心取上清液，-20 ℃儲(chǔ)存；在腸道步驟中，將胃食糜與水、CaCl2、膽汁液和胰蛋白酶混合，加入1 mol/L NaOH，將混合物的pH值提高至7.0，攪拌2 h。相同的消化條件下，加入空白組(不含牛蒡根粉)，以糾正消化液、酶和液體的干擾。

1.3.7 多酚化合物的體外釋放度 參考李夢(mèng)杰等的方法計(jì)算牛蒡根多酚(BRPP)的生物可及性，消化后酚類物質(zhì)的生物可及性按公式(3)計(jì)算：

(3)

式中：ADS為消化后的樣品量；UNS為BRF未消化的樣品量。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

本研究中每個(gè)試驗(yàn)均重復(fù)進(jìn)行3 次，采用Microsoft Excel 2019統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)、SPSS 25.0分析數(shù)據(jù)差異的顯著性，P<0.05表示差異顯著；用Origin 2019 軟件作圖，結(jié)果表示為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”。

2 結(jié)果與分析

2.1 粒度分析

大小在0.000 001～100 mm間的微小固體顆粒被劃分為超細(xì)粉，顆粒工藝學(xué)認(rèn)為從顆粒系統(tǒng)的角度描述食品粉末的基本特性是進(jìn)行其他研究的基礎(chǔ)[16]。本研究先從粒徑分布方面對(duì)牛蒡根粉進(jìn)行初步探討，粒度分布通常是指粉末樣品中不同粒徑顆粒在顆粒總量中的占比，采用激光粒徑分析儀得到不同研磨時(shí)間的牛蒡根粉粒徑。由圖1可知，粒徑分布隨著研磨時(shí)間增長更為集中，為進(jìn)一步了解粒徑分布，我們總結(jié)了6個(gè)樣品的D10、D50、D90。由表2可知，經(jīng)超微粉碎的牛蒡根粉的粒徑遠(yuǎn)小于經(jīng)普通研磨的牛蒡根粉，且超微粉碎后粉末的粒徑隨著研磨時(shí)間的增加而減小，BP-1、BP-2、BP-3、BP-4、BP-5和BP-6的D90粒徑分別為14.16、48.60、98.18、133.70、168.00、360.10 μm，同時(shí)粉末的D10、D50、D(3，2)、D(4，3)、D(2，1)、D(1，0)均有與之相同的變化趨勢。

表2 牛蒡根粉的粒徑參數(shù)

跨度值(Span)、Φ和比表面積亦可以反映粉末的基本特性，由表3可知，Span表示粒徑分布的寬度，是描述粒徑分布的另一個(gè)重要參數(shù)，Span越小，表示粒徑分布均勻[17]。與其他粉末相比，BP-1的Span為2.42，數(shù)值最小，說明顆粒更加均勻，且 BP-1 的粒徑分布范圍比其他粉末更接近于高斯分布，但從總體上看，6種樣品的跨度值無明顯規(guī)律，說明超微粉碎雖可以減小粉末粒度值，但在未達(dá)到一定的粉碎時(shí)間時(shí)，部分顆粒粉碎不夠均勻，Span與粒徑無關(guān)，只能反映顆粒的均一性[18]；另一方面Φ隨粒徑減小而增加最高可達(dá)1.9，說明超微粉碎可破壞牛蒡根的細(xì)胞壁，增加活性物質(zhì)的溶出；此外，比表面積是超細(xì)粉體的重要表征指標(biāo)之一，隨著粒徑的減小，牛蒡根粉的比表面積從 79.54 m2/kg 迅速增加至593.7 m2/kg，BP-1的比表面積是BP-6的7.46倍，說明超微粉碎對(duì)食品粉末的表面性能有顯著影響，此結(jié)果對(duì)粉末的吸附能力、水合作用、溶解度、抗氧化活性、生物利用度等其他性能的研究奠定了基礎(chǔ)[7]。

表3 牛蒡根粉末的基本特征

2.2 超微粉碎對(duì)BRPP含量的影響

酚類化合物主要以結(jié)合態(tài)和游離態(tài)2種形式存在于牛蒡根中，結(jié)合酚常規(guī)提取不易溶解，且咀嚼、酸性環(huán)境和消化酶都不會(huì)使其從食物基質(zhì)中顯著釋放出來[19]，因此多數(shù)學(xué)者忽略了結(jié)合酚部分。Kroon等已證明結(jié)合酚受到結(jié)腸微生物菌群的廣泛轉(zhuǎn)化，會(huì)表現(xiàn)出抗氧化和抗增殖等活性[20]。本研究主要探索經(jīng)超微粉碎后游離酚、結(jié)合酚和總酚的含量變化。由表4可知，超微粉碎后6種粉末的游離酚、結(jié)合酚和總酚的含量均隨著粒徑的減小而顯著增大(P<0.05)，與BP-6相比，BP-1中游離酚、結(jié)合酚和總酚的含量增加最為明顯，分別增加了23.47%、30.26%、24.87%。超微粉碎加工技術(shù)明顯增加了牛蒡根中不同狀態(tài)BRPP的溶出率和釋放量，趙萌萌等報(bào)道的超微粉碎對(duì)青稞麩皮粉末中酚類物質(zhì)含量的影響中也得到相似結(jié)論[21]。一方面隨著粒徑的減小，Φ增加，牛蒡根的細(xì)胞壁遭到破壞，降低對(duì)傳質(zhì)的阻力，提高溶劑輸注效率，同時(shí)改變纖維結(jié)構(gòu)，釋放或暴露基質(zhì)中結(jié)合態(tài)多酚[17，22]；另一方面，粉末的比表面積增大，這增大了提取溶劑和粉末的接觸面積，使提取速率增高，提取量增大。但衛(wèi)子顏等的研究表明，隨著粒徑的減小，米糠結(jié)合酚的含量出現(xiàn)先增加后減小的趨勢，這可能隨著超微粉碎時(shí)間的增加，劇烈的機(jī)械化作用和熱效應(yīng)致使細(xì)胞壁間的共價(jià)鍵和非共價(jià)鍵斷裂，從而導(dǎo)致結(jié)合酚含量損失[23]。而本研究超微粉碎過程采用循環(huán)冷水降溫模式，且控制超微粉碎時(shí)間低于30 min，所以并未出現(xiàn)結(jié)合酚含量降低的情況。

表4 超微粉碎處理后的牛蒡根中酚類物質(zhì)含量

2.3 超微粉碎處理對(duì)BRPP抗氧化活性的影響

考慮到研磨過程中酚類各組分化合物的變化，深入評(píng)價(jià)超微粉碎后BRPP的生物活性尤為重要。對(duì)一種物質(zhì)抗氧化活性的綜合評(píng)價(jià)需要2種或2種以上的分析方法[24]。本研究采用DPPH、ABTS和FRAP清除試驗(yàn)來分析牛蒡根酚類提取物的活性，由圖2可知，在3種抗氧化評(píng)價(jià)體系中，6種不同粒徑BRPP均有明顯抗氧化活性，且與粒徑的大小有顯著關(guān)系(P<0.05)。結(jié)合態(tài)和游離態(tài)多酚的抗氧化性均隨牛蒡根粉粒度的減小而逐漸增大，其中，BP-1的粒徑最小，清除自由基的能力也最高，相較于BP-6，BP-1中游離酚和結(jié)合酚的DPPH自由基清除力分別提高28.07%、22.15%；ABTS自由基清除力分別提高了36.78%、32.42%；鐵離子還原能力也分別提高34.31%、27.13%。葉秋瑩等在分析超微粉碎對(duì)紅茶粉抗氧化性能的影響時(shí)也得到相似趨勢[25]；究其原因，一方面天然植物的抗氧化能力在很大程度上取決于植物化合物的有效性[17]，超微粉碎使得多酚釋放增強(qiáng)，提取率增加，從而增強(qiáng)了超細(xì)粉的抗氧化能力；另一方面，高比表面積微觀結(jié)構(gòu)導(dǎo)致水溶性增加，提高了粉末的溶解能力，致使水溶性化合物的溶出率增加，如易溶于水的多糖類物質(zhì)，這間接促進(jìn)了超細(xì)粉抗氧化活性的增強(qiáng)。這與Zhang等的研究結(jié)論[17]相符合。由此可見，超微粉碎可應(yīng)用于大規(guī)模加工與牛蒡根相關(guān)的功能性食品。

2.4 BRPP含量與抗氧化活性之間的相關(guān)性分析

BRPP含量和抗氧化性均隨著粒徑的減小而增大，為進(jìn)一步明確BRPP含量與抗氧化活性的關(guān)聯(lián)，分析了各變量間的相關(guān)性。由表5可知，BRPP的含量與3種抗氧化活性評(píng)價(jià)指標(biāo)呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)，游離酚的相關(guān)系數(shù)分別為0.994、0.996、0.994，結(jié)合酚的相關(guān)系數(shù)分別為0.975、0.960、0.985，即BRPP含量越高，其自由基清除能力越強(qiáng)。BRPP具有抗氧化活性，直接說明其含有豐富的抗氧化活性化合物。

表5 牛蒡根中酚類物質(zhì)含量與體外抗氧化活性的相關(guān)性分析

2.5 體外模擬胃腸消化過程中牛蒡總酚的含量及釋放度

酚類物質(zhì)的吸收利用率與多種因素有關(guān)，食品加工方式對(duì)食品結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾，這會(huì)對(duì)植物次生代謝物的釋放、吸收和轉(zhuǎn)化等產(chǎn)生影響[26]。由于結(jié)合酚不能在消化中溶出，本研究主要探索超微粉碎對(duì)經(jīng)消化后游離酚的含量和生物利用率的影響。由表6可知，牛蒡根中多酚含量在口腔、胃、腸中呈現(xiàn)出先增大后減小的趨勢，這與Herrera-Balandrano等研究的消化對(duì)牛蒡根酚類物質(zhì)的變化趨勢[27]相一致。胃消化階段酚類物質(zhì)明顯升高，說明較低的pH值環(huán)境容易使牛蒡根中酚類物質(zhì)與碳水化合物、蛋白和多糖形成的穩(wěn)定復(fù)合物分離[28]；腸消化階段酚類物質(zhì)含量發(fā)生下降，說明采用酶進(jìn)行的消化模型會(huì)對(duì)酚類物質(zhì)造成破壞；進(jìn)一步分析超微粉碎對(duì)BRPP生物可及性的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對(duì)比不同粒徑粉末的同一消化階段，BRPP的含量都隨著粒徑的減小而顯著增加(P<0.05)，BP-1～BP-5計(jì)算得到的BRPP生物可接受率較BP-6分別提高20.08%、17.75%、13.84%、9.81%和8.01%，說明超微粉碎可減弱細(xì)胞壁的物理阻隔、打破食物基質(zhì)的結(jié)合，有效提高BRPP的生物利用率。

表6 體外口腔胃腸消化后牛蒡根中酚類物質(zhì)的釋放

3 結(jié)論

本試驗(yàn)采用超微粉碎技術(shù)和普通粉碎技術(shù)制備牛蒡根粉，研究了不同粒徑對(duì)牛蒡根粉模擬消化前后多酚含量和其抗氧化活性的影響。結(jié)果表明，超微粉碎的粒徑隨時(shí)間增加顯著降低，當(dāng)時(shí)間為 30 min 時(shí)，粒徑最小，為14.16 μm，此時(shí)牛蒡根粉的酚類物質(zhì)含量最多、抗氧化活性最強(qiáng)，生物利用度最高，此外酚類含量和其抗氧化活性呈顯著正相關(guān)，表明超微粉碎后的粉末的化學(xué)性能更好，當(dāng)與其他粉末添加劑混合時(shí)，具有更高的潛力，發(fā)揮最大的作用。