呼吸道標(biāo)本分離出罕見的腿傷凱斯特菌3例分析

盧雅敏，毛文杰

廣東省韶關(guān)市粵北人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東韶關(guān) 512026

腿傷凱斯特菌是一種2003年才被發(fā)現(xiàn)的新的革蘭陰性桿菌[1]。在分類學(xué)上，該菌隸屬于產(chǎn)堿桿菌科，其菌名源于比利時(shí)微生物學(xué)家凱斯特的名字。因該菌多分離自腿部傷口，故命名為腿傷凱斯特菌或肢體凱斯特菌。截至目前，在PubMed上以“Kerstersia gyiorum”為關(guān)鍵詞檢索與人類疾病相關(guān)的文獻(xiàn)僅能檢出15篇，在萬方醫(yī)學(xué)和中國(guó)知網(wǎng)上有關(guān)該菌與人類疾病相關(guān)的中文報(bào)道僅1篇[2]，因此臨床對(duì)該菌的認(rèn)識(shí)和了解還極其有限。2021年11月至2022年2月，本院共從來自臨床的呼吸道標(biāo)本檢出3例腿傷凱斯特菌，本研究對(duì)所有檢出該菌的患者進(jìn)行回顧性分析，現(xiàn)報(bào)道如下 。

1 資料與方法

1.1一般資料 患者1，男，56歲，2021年從高處摔下致顱腦外傷，行硬膜外血腫清除術(shù)+器官切開術(shù)，術(shù)后持續(xù)神志不清，插導(dǎo)尿管，持續(xù)臥床狀態(tài)，有咳嗽、咳痰，2021年1月30日入住本院神經(jīng)外科2區(qū)?；颊?，男，63歲，于2007年車禍致顱腦損傷，開顱術(shù)后持續(xù)昏迷不醒，植物人狀態(tài)，2021年1月13日入住本院神經(jīng)外科2區(qū)?；颊?，男，78歲，2020年11月因腦出血行開顱手術(shù)，術(shù)后間斷神志障礙及四肢運(yùn)動(dòng)減退，于入院前5 d因出現(xiàn)氧飽和度低，抽搐，2022年1月20日入住本院重癥監(jiān)護(hù)病房(ICU)。

1.2方法

1.2.1痰培養(yǎng) 將痰液標(biāo)本分別接種于血平板、麥康凱平板和沙保羅平板(鄭州安圖生物公司產(chǎn)品)，血平板和麥康凱平板置于35 ℃含有5%CO2孵育箱過夜，沙保羅平板置于28 ℃孵育箱過夜，24 h后觀察菌落生長(zhǎng)情況。

1.2.2菌種鑒定及藥敏試驗(yàn) 采用革蘭染色法進(jìn)行細(xì)菌形態(tài)學(xué)觀察，分別應(yīng)用德國(guó)布魯克公司基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜系統(tǒng)(MALDI-TOF-MS)和法國(guó)梅里埃公司VITEK2 Compact全自動(dòng)細(xì)菌鑒定及藥敏分析系統(tǒng)進(jìn)行細(xì)菌鑒定和藥敏試驗(yàn)，應(yīng)用布魯克質(zhì)譜儀配套軟件(MALDI Flex Control Analysis 和 MALDI Biotyper 3.0)進(jìn)行蛋白質(zhì)指紋圖采集和分析鑒定。標(biāo)本制備、檢測(cè)和結(jié)果分析參照MALDI-TOF-MS和VITEK2 Compact鑒定操作流程和標(biāo)準(zhǔn)化操作專家共識(shí)。

1.2.3同源性分析 應(yīng)用布魯克質(zhì)譜儀配套軟件Bruker MALDI-Biotyper3.0根據(jù)菌株的蛋白指紋圖譜進(jìn)行核心圖譜(MSP)聚類分析并構(gòu)建發(fā)育樹。

2 結(jié) 果

2.13例患者的基本資料及實(shí)驗(yàn)室檢查指標(biāo) 3例患者留取痰液標(biāo)本當(dāng)天的基本資料和相關(guān)炎癥指標(biāo)見表1、2。3例患者白細(xì)胞計(jì)數(shù)分別為正常(患者1)、略高(患者2)和降低(患者3)，粒細(xì)胞百分比僅患者2和患者3升高，3例患者的降鈣素原水平均有升高，C反應(yīng)蛋白在進(jìn)行過該項(xiàng)檢測(cè)的患者2和患者3中均顯示增高。

表1 3例患者的基本資料

表2 3例檢出腿傷凱斯特菌的患者留取標(biāo)本當(dāng)天實(shí)驗(yàn)室檢查指標(biāo)

2.2微生物學(xué)檢查 孵育箱培養(yǎng)24 h后，血平板上出現(xiàn)扁平、淺灰色、呈磨砂質(zhì)感的邊緣擴(kuò)散狀菌落形態(tài)，麥康凱平板上的菌落也呈擴(kuò)散狀，菌落中間部分產(chǎn)薰衣草樣色素。將純的菌落革蘭染色后觀察，鏡下為革蘭陰性桿菌。手工生化反應(yīng)顯示：氧化酶實(shí)驗(yàn)陰性，過氧化氫酶強(qiáng)陽性。挑取純菌落用MALDI-TOF MS進(jìn)行菌種鑒定，多次鑒定結(jié)果為腿傷凱斯特菌，且評(píng)分均為2.2～2.4分，鑒定結(jié)果可靠。進(jìn)一步采用16S rRNA進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，所測(cè)基因序列與Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列進(jìn)行同源性分析，鑒定為腿傷凱斯特菌。采用Vitek2 compact 全自動(dòng)細(xì)菌鑒定及藥敏分析系統(tǒng)進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，根據(jù)美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)其他非腸桿菌目細(xì)菌最小抑菌濃度(MIC)折點(diǎn)判斷標(biāo)準(zhǔn)，3株菌株藥敏結(jié)果見表3。

表3 3株腿傷凱斯特菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果

續(xù)表3 3株腿傷凱斯特菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果

2.3同源性分析 通過質(zhì)譜儀的分析軟件Flexanalysis獲得了菌株的蛋白質(zhì)指紋峰信息，見圖1。再將蛋白質(zhì)指紋峰譜圖導(dǎo)人MALDI-Biotyper 3 軟件進(jìn)行聚類分析。從聚類分析圖中可發(fā)現(xiàn)：3株菌可分為2個(gè)大類，例1和例2親緣關(guān)系非常接近，例3與例1和例2親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，見圖2。

圖1 K1菌株蛋白指紋圖譜

圖2 3例患者核心圖譜聚類分析樹形圖

3 討 論

從2003年腿傷凱斯特菌被首次報(bào)道至2022年，在PubMed上能檢索到的關(guān)于該菌與人類疾病相關(guān)的英文報(bào)道共15篇，涉及19個(gè)病例。包括了與下肢傷口感染相關(guān)的6例[3-6]，跟耳道感染相關(guān)的9例[3,7-10]，血流感染相關(guān)的1例[4]，其余有呼吸道感染2例[11-12]，尿路感染1例[13]。根據(jù)培養(yǎng)結(jié)果調(diào)整抗菌藥物使用后，多數(shù)患者癥狀緩解或治愈，部分患者在分離出該菌的同時(shí)也分離出其他不同種類的菌株，因此并不能完全確認(rèn)該菌在患處的致病意義。國(guó)內(nèi)發(fā)現(xiàn)并報(bào)道的僅四川省2例[2,12]。本研究3例患者留取痰液標(biāo)本當(dāng)天患者1和患者3均無發(fā)熱表現(xiàn)，僅呼吸道有痰液，肺部X線片提示有少許炎癥，患者1的痰液標(biāo)本在分離出腿傷凱斯特菌的同時(shí)也分離出銅綠假單胞菌，患者2的痰液標(biāo)本同時(shí)檢出鮑曼不動(dòng)桿菌。與先前多篇報(bào)道相似，腿傷凱斯特菌與其他細(xì)菌有伴隨生長(zhǎng)的情況[3,11]，因沒有足夠的證據(jù)支持腿傷凱斯特菌為病原菌，后續(xù)臨床沒有針對(duì)該菌采取相應(yīng)的抗感染治療方案。由此推測(cè)腿傷凱斯特菌在這3例患者身上，可能是上呼吸道的定植菌。筆者認(rèn)為如果需要確定該菌是否是病原菌，則需要臨床醫(yī)生和實(shí)驗(yàn)室加強(qiáng)交流合作，查找出更多感染相關(guān)的證據(jù)，同時(shí)，需對(duì)其毒力因子和致病機(jī)制進(jìn)行更深入的研究。

2015年美國(guó)的BOSTWLCK等[4]報(bào)道了1例腿傷凱斯特菌引起的敗血癥，這引起了人們對(duì)該菌更多的關(guān)注。2019年研究者對(duì)來自中國(guó)的1例呼吸道分離的菌株進(jìn)行了全基因組測(cè)序[12]，發(fā)現(xiàn)該菌攜帶有耐藥基因和多種藥物外排泵，巴西的1例慢性傷口感染的病例顯示他們分離的1株腿傷凱斯特菌為環(huán)丙沙星耐藥株[14]，筆者認(rèn)為外排泵可能是該菌株對(duì)環(huán)丙沙星耐藥的主要機(jī)制。本報(bào)道患者1和患者2檢出腿傷凱斯特菌的時(shí)間為2021年11月，均住在本院神經(jīng)內(nèi)科2區(qū)，盡管已經(jīng)咨詢過臨床科室這2例患者的診療過程是否有共同醫(yī)護(hù)人員或診療器械物品，均被否認(rèn)，但是因?yàn)槎咦≡簳r(shí)間存在交集，因此也不能完全排除腿傷凱斯特菌在這2例患者之間有傳播的可能?；颊?于2021年12月5日后續(xù)治療轉(zhuǎn)移ICU二區(qū)病房，患者3是在ICU一區(qū)住院期間痰液中分離出的腿傷凱斯特菌，對(duì)檢出的3株菌進(jìn)行聚類分析時(shí)，患者1 和患者2顯示有高度同源性，而與患者3親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，推斷患者2的菌株來源于同病區(qū)的患者1。因此該菌的存在應(yīng)引起臨床和醫(yī)院感染部門重視，防止耐藥基因以腿傷凱斯特菌為載體在院內(nèi)進(jìn)行傳播。綜合本報(bào)道的3例患者和之前報(bào)道的呼吸道分離出腿傷凱斯特菌的報(bào)道，這些患者均有氣管切開或長(zhǎng)期機(jī)械通氣的情況，因此無論腿傷凱斯特菌是否屬于上呼吸道定植菌，都有導(dǎo)致下呼吸道感染的風(fēng)險(xiǎn)。本研究3例患者均為開顱術(shù)后長(zhǎng)期臥床且昏迷的狀態(tài)，既往也有報(bào)道稱腿傷凱斯特菌多發(fā)生于患有慢性炎癥、免疫力低下的患者[6,11]，這與本報(bào)道的3例患者情況是符合的。

腿傷凱斯特菌的鑒定自首次發(fā)現(xiàn)以來，主要通過MALDI-TOF-MS進(jìn)行鑒定或通過測(cè)序16S rRNA進(jìn)行識(shí)別。前期有研究通過VITEK2 Compact儀器法進(jìn)行鑒定時(shí)，得出鑒定為不動(dòng)桿菌屬的概率為34%，為熒光假單胞菌的概率為33%[8]。一方面因?yàn)槟壳岸鄶?shù)商業(yè)性菌種庫(kù)還未包含腿傷凱斯特菌，另外一方面腿傷凱斯特菌生化特征與糞產(chǎn)堿桿菌相似，利用生化反應(yīng)檢測(cè)原理進(jìn)行菌種鑒定時(shí)極易混淆。但腿傷凱斯特菌氧化酶陰性、脲酶陰性、過氧化氫酶強(qiáng)陽性且具有特殊的氣味，結(jié)合其扁平、邊緣呈擴(kuò)散狀的菌落形態(tài)，臨床微生物室在見到上述特征的菌株時(shí)要考慮為腿傷凱斯特菌的可能。當(dāng)前該菌檢出和報(bào)道不多見，一方面可能源于傳統(tǒng)鑒定方法功能的有限性，另外一方面可能源于實(shí)驗(yàn)室對(duì)該菌的認(rèn)知不足，在呼吸道標(biāo)本中檢出時(shí)往往被其他菌群掩蓋或作為正常菌群處理。隨著MALDI-TOF MS和16S rRNA測(cè)序技術(shù)的普及，在當(dāng)今分子診斷時(shí)代，未來可能會(huì)有更多新的少見細(xì)菌被發(fā)現(xiàn)，而它們與人類疾病的關(guān)系也需要被一一定義。

綜上所述，盡管腿傷凱斯特菌當(dāng)前仍屬罕見，作為一種對(duì)當(dāng)前多數(shù)抗菌藥物都敏感但攜帶耐藥基因的新的菌種，臨床微生物室很容易將標(biāo)本中分離出的腿傷凱斯特菌判定為污染，對(duì)于長(zhǎng)期臥床需要機(jī)械通氣的患者應(yīng)予以關(guān)注，積極改善患者基礎(chǔ)疾病，提高免疫功能，防止這類罕見菌種對(duì)免疫力低下患者造成感染，引起嚴(yán)重后果。同時(shí)，該菌在院內(nèi)進(jìn)行傳播所帶來的危害性不容小覷，臨床應(yīng)合理使用抗菌藥物，強(qiáng)化醫(yī)護(hù)人員、陪護(hù)人員手衛(wèi)生，切實(shí)做好醫(yī)院內(nèi)感染控制工作。