豬糞及其生物堆肥對小麥幼苗生長和土壤細菌群落結(jié)構(gòu)的影響

鄒文萱，羅慧，趙境怡，岳中輝，劉四義，梁愛珍，王新軍，束長龍，韓麗麗，沈菊培

（1.中國科學院生態(tài)環(huán)境研究中心，北京 100085；2.中國科學院大學，北京 100049；3.哈爾濱師范大學生命科學與技術(shù)學院，哈爾濱 150525；4.中國科學院黑土區(qū)農(nóng)業(yè)生態(tài)重點實驗室，中國科學院東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，長春 130102；5.交通運輸部科學研究院，北京 100029；6.植物病蟲害生物學國家重點實驗室，中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所，北京 100193；7.福建師范大學地理科學學院，福州 350007）

隨著我國畜牧業(yè)規(guī)?；图s化的迅速發(fā)展，畜禽養(yǎng)殖帶來的環(huán)境污染問題日益突出。據(jù)我國畜牧總站的調(diào)查顯示，全國每年畜禽糞污的排放量約38億t[1]。畜禽糞肥中含有豐富的有機質(zhì)及植物生長所需的氮、磷、鉀等營養(yǎng)元素[2]。將畜禽糞肥合理還田進行資源化利用不僅可以大大降低化肥施用量、增加土壤有機碳積累、提高土壤肥力，而且有助于消除畜禽養(yǎng)殖帶來的污染問題[3]。然而，禽畜糞肥如果施用不當則可能通過徑流或淋溶造成地表水體富營養(yǎng)化和地下水污染，進而影響環(huán)境和人體健康[4]。因此，開展畜禽糞肥的資源化利用研究對指導(dǎo)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、降低環(huán)境污染、實現(xiàn)資源循環(huán)利用具有重要意義。

自20 世紀80 年代以來，我國采用的畜禽糞便資源化利用方式包括肥料化、能源化和飼料化[5-7]，其中前兩者是主要利用方向。肥料化是利用畜禽糞便制作有機肥的過程，包括物理、化學和生物等方式。生物堆肥具有能耗小、二次污染物少等優(yōu)點，是實現(xiàn)畜禽糞便肥料化、降低環(huán)境污染的有效生物降解技術(shù)[7]。例如，利用蚯蚓吞食過腹消化和微生物的分解作用對畜禽廢棄物進行降解是一種應(yīng)用較廣、符合可持續(xù)發(fā)展的生物處理法[8-9]。黑水虻由于繁殖迅速，飼養(yǎng)操作簡單，在生產(chǎn)中易于管理，其作為一種資源性昆蟲具有一定的養(yǎng)殖前景與應(yīng)用價值[10]。白星花金龜（Protaetia brevitarsis）幼蟲可取食秸稈、畜禽廢棄物，并將其轉(zhuǎn)化為腐植酸含量較高的有機肥[11]，在畜禽糞便資源化利用方面具有較好的應(yīng)用前景。金龜幼蟲腸道是一個多變的系統(tǒng)，隨著取食、消化和排泄等活動而不斷變化，在脂肪和碳水化合物吸收利用過程中起著重要作用，被稱為有機廢棄物資源加工的“生物反應(yīng)器”[12]。

畜禽糞便生物堆肥處理在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中已展現(xiàn)較大的潛力，對土壤生態(tài)系統(tǒng)也產(chǎn)生了顯著影響。如王先哲[13]在農(nóng)田土壤中施用了經(jīng)黑水虻堆肥的虻糞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)土壤中細菌群落多樣性和酸桿菌門的相對豐度降低，而細菌群落的均勻度增加。Vivas 等[14]通過新鮮橄欖廢渣及羊糞的混合物進行蚯蚓堆肥，結(jié)果表明相比原糞肥，蚓糞顯著增加了細菌的數(shù)量及多樣性。目前關(guān)于畜禽糞肥施用對土壤-植物-微生物體系的影響研究已有較多，但白星花金龜幼蟲生物堆肥對土壤環(huán)境和作物生長的影響及其微生物作用機制鮮有報道。因此，本研究通過小麥盆栽試驗，探究豬糞及其生物堆肥得到的蟲糞處理后小麥栽培60 d 的生理特性、氮肥利用率及土壤細菌群落結(jié)構(gòu)的變化，并分析小麥生長的主要影響因子，探討土壤理化性質(zhì)、小麥幼苗的生長狀況與土壤細菌群落的相關(guān)性，以期為畜禽糞便資源化的農(nóng)業(yè)效應(yīng)評估提供參考，同時為探究畜禽糞肥還田的施用量及微生物作用機制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試土壤采自北京市延慶區(qū)（40°29′N，115°56′E）吳莊村旱柳地表層土壤（0～20 cm），土壤類型為潮土，容重為1.31 g·cm-3，過2 mm 篩后風干、混勻備用。供試的小麥種子為北京研禾玉科技發(fā)展有限公司的“輪選987”品種，生育期258 d。供試有機肥包括豬糞和蟲糞。

供試有機肥：在湖南農(nóng)業(yè)大學動物科學技術(shù)學院養(yǎng)殖基地選取1 頭公豬，飼喂玉米籽粒（來自中國科學院東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所）和其他配料制成的粉狀飼料7 d，收集4～7 d的糞便，混勻風干后過篩，將其作為供試豬糞，其總碳和總氮含量分別為361.2 g·kg-1和36.9 g·kg-1。從中國農(nóng)業(yè)科學院獲取3 齡的白星花金龜（Protaetia brevitarsis）幼蟲，飼喂上述豬糞，7 d 后收集新鮮的顆粒狀蟲糞，風干后過2 mm 篩，將其作為供試蟲糞，其總碳和總氮含量分別為376.9 g·kg-1和31.3 g·kg-1。

1.2 試驗設(shè)計

采用盆栽法進行試驗。選取12 個內(nèi)徑為18.5 cm、高為7.5 cm 的花盆，每盆裝入土壤1 400 g。試驗共設(shè)置3 個處理，分別為未施肥處理（CK）、蟲糞處理（LF）以及豬糞處理（SM），每個處理4 次重復(fù)。CK 處理中無氮肥輸入，添加的磷肥和鉀肥為過磷酸鈣和氯化鉀，施入量分別為247.2 mg·kg-1和158.5 mg·kg-1。LF和SM 處理按照含氮量200 mg·kg-1等氮量添加，添加的蟲糞和豬糞量分別為639.1 mg·kg-1和542.1 mg·kg-1，混勻后將土壤含水量調(diào)節(jié)至田間持水量的50%。

選擇籽粒飽滿、大小均勻的小麥種子，經(jīng)30%H2O2消毒10 min后用蒸餾水反復(fù)沖洗，濾紙吸干后備用。每盆播種上述小麥種子25 粒后用100 g 土覆蓋，出苗后保留20 株，在25 ℃、12 h·d-1光照條件下種植60 d 后進行植株和根際土壤樣品采集。采集時先將小麥幼苗地上部分剪切，然后測定鮮質(zhì)量，放入烘箱內(nèi)105 ℃殺青60 min，在75 ℃下烘至恒質(zhì)量，研磨過0.15 mm 篩后備用。土壤挑去根系后分為三部分：第一部分存放于-80 ℃冰箱用于DNA的提取，第二部分于4 ℃保存用于土壤有效態(tài)氮含量的測定，第三部分風干過篩后進行土壤總碳（TC）、總氮（TN）的測定。

1.3 測定方法

1.3.1 土壤性質(zhì)的測定

土壤TC 和TN 含量采用元素分析儀（Vario ELⅢ-Elenemtar，德國）測定；土壤銨態(tài)氮（-N）和硝態(tài)氮（-N）經(jīng)1 mol·L-1的KCl 溶液浸提后用連續(xù)流動分析儀（AA3，SEAL，德國）測定；土壤可溶性有機碳（DOC）和可溶性有機氮（DON）用0.5 mol·L-1的K2SO4浸提，并用總有機碳分析儀（TOC-VCPH，Shimadzu，日本）測定。

1.3.2 小麥幼苗生理指標的測定

采用尺量法測定小麥五葉期、六葉期的株高和近根葉組的第5 片葉的葉面積；小麥植株的TC 和TN含量采用元素分析儀測定；五葉期和六葉期的小麥葉片葉綠素SPAD值用葉綠素儀（SPAD-502 Plus，Konica Minolta，日本）測定。作物氮肥利用率采用差減法計算。

1.3.3 細菌16S rRNA高通量測序

利用土壤DNA 試劑盒（DNeasy?Power Soil?Kit，QIAGEN，德國）提取0.35 g 冷凍土壤，用NanoDrop ND-1000 分光光度計（NanoDrop，Thermo ScientificTM，美國）測定提取DNA 的濃度和質(zhì)量。使用細菌16S rRNA基因V4～V5區(qū)域的通用引物338F（ACTCCTACGGGAGGCAGCA）和806R（GGACTACHVGGGTWTCTAAT）進行PCR擴增，PCR反應(yīng)體系（20 μL）：5×Fast-Pfu 緩沖液4 μL，2.5 mmol·L-1dNTPs 2 μL，濃度5 μmol·L-1的前后引物各0.8 μL，F(xiàn)astPfu 聚合酶0.4 μL和DNA模板10 ng。在ABI GeneAmp?9700 PCR擴增儀上進行擴增，用凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物。PCR產(chǎn)物用AxyPrep DNA 凝膠回收試劑盒（Axygen Biosciences公司）進行純化，隨后送上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司利用Illumina MiSeq 平臺進行末端配對（2×250 bp）測序分析。

通過Quantitative Insight into Microbial Ecology（QIIME.V1.9.1）平臺[15]對所測序列進行分析。在USEARCH[16]中將雙端序列拼接成單條序列，并對該序列進行質(zhì)控（最大期望錯誤率0.5）及去冗余分析。在USEARCH 中使用UNOISE2[17]挑選正確的生物序列（Zero-radius Operational Taxonomic Units，ZOTUs）。在QIIME 中使用BLAST 算法將這些代表性序列與SILVA 數(shù)據(jù)庫進行比對，共獲得638 981 條高質(zhì)量序列，按100%相似性挑選得到6 030 個代表ZOTUs。最后通過QIIME計算細菌α多樣性和β多樣性。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用Excel 2013 對數(shù)據(jù)進行整理、匯總，利用SPSS 軟件（SPSS Statistics 24）進行單因素方差分析（ANOVA）、顯著性檢驗（Duncan，P＜0.05）和多元回歸分析，采用R（Version 3.4.3）軟件[18]進行冗余分析、主成分分析和差異分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤性質(zhì)和小麥生長狀況

不同施肥處理下小麥栽培60 d 后土壤性質(zhì)如表1 所示。與CK 相比，施肥處理LF 和SM 顯著提升了土壤pH值（P＜0.05）。LF和SM處理的TC、TN、-N、-N、DON 含量均顯著高于CK 處理（P＜0.05），而LF和SM 處理之間差異不顯著（P＞0.05）。LF和SM 處理的DOC 含量顯著高于CK（P＜0.05），且LF 處理顯著高于SM處理（P＜0.05）。

表1 不同施肥處理的土壤性質(zhì)Table 1 Soil properties in different treatments

不同施肥處理下小麥生理指標變化如圖1 所示。LF 和SM 處理苗干質(zhì)量、葉綠素SPAD 值均顯著高于CK 處理（P＜0.05），而小麥苗碳氮比顯著低于CK 處理（P＜0.05），且LF 和SM 處理間差異不顯著。SM 處理氮肥利用率顯著高于LF處理。另外，僅SM 處理的株高顯著高于CK 處理（P＜0.05），LF 和SM 處理的葉面積在五葉和六葉期與CK 處理均無顯著差異（P＞0.05）。

圖1 不同施肥處理下小麥生理指標特征Figure 1 Wheat growth characteristics in different treatments

2.2 土壤細菌多樣性

香農(nóng)指數(shù)（Shannon index）可以指示土壤細菌的多樣性?；趯ν寥兰毦鷾y序ZOTU 數(shù)據(jù)的分析發(fā)現(xiàn)，不同處理間土壤細菌香農(nóng)多樣性指數(shù)無顯著差異（P＞0.05，圖2A）。細菌群落組成結(jié)果表明，豐度前10位的土壤細菌類群主要有放線菌門（Actinobacteria）、變形菌門（Proteobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）、Patescibacteria 菌門、厚壁菌門（Firmicutes）、棒狀桿菌門（Rokubacteria）、疣微菌門（Verrucomicrobia）等。其中，土壤中豐度最高的類群為放線菌門（Actinobacteria）、變形菌門（Proteobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria）和綠彎菌門（Chloroflexi），分別占土壤細菌的32%～34%、24%～26%、14%～17%和12%～14%（圖2B）。

細菌類群相對豐度差異性分析的結(jié)果表明，不同糞肥施用對細菌類群產(chǎn)生了顯著影響。例如，LF 和SM 處理中放線菌門的相對豐度比CK 處理分別提高了2.85、1.11 個百分點，而酸桿菌門的相對豐度在LF處理中最低（平均14%），在CK 處理中最高（平均17%）。LF 和SM 處理中綠彎菌門的相對豐度比CK處理分別降低了1.63、1.58個百分點。基于Bray-Curtis 距離算法對細菌ZOTU 數(shù)據(jù)進行PCoA 主成分分析（圖2C），其中第一、二排序軸分別解釋總變異的12.2%和11.4%，SM 處理與其他處理相距較遠，具有較低的細菌群落相似性，CK 和LF 處理細菌群落結(jié)構(gòu)分布部分重合，說明具有較高的細菌群落相似性。

圖2 不同處理土壤細菌多樣性和群落結(jié)構(gòu)特征Figure 2 Soil bacterial diversity and community structure in different treatments

研究采用隨機森林模型平均基尼指數(shù)減少值（Mean Decrease Gini）評估不同微生物類群的重要性，即平均基尼指數(shù)減少值越大，代表該微生物類群越重要。如圖2D 所示，在門水平上檢測到3 種顯著差異的土壤細菌門類，包括擬桿菌門（Bacteroidetes）、厚壁菌門（Firmicutes）和硝化螺菌門（Nitrospirae）。其中，SM 處理擬桿菌門的相對豐度為5.8%，顯著高于CK（2.9%）和LF（3.7%）處理（P＜0.05）。SM 處理厚壁菌門和硝化螺菌門相對豐度分別為1.0%和0.2%，LF 處理厚壁菌門和硝化螺菌門相對豐度分別為1.2%和0.3%，均顯著高于CK處理（0.6%和0.2%）。

2.3 土壤性質(zhì)、細菌群落與小麥生理指標的相關(guān)性

將土壤性質(zhì)和基于ZOTU 信息的細菌群落結(jié)構(gòu)進行冗余分析（圖3），結(jié)果表明其中7 個土壤因子共解釋了細菌群落總變異的34.5%，RDA 前兩個排序軸分別解釋了18.5%和16.0%的群落變異。由圖3 可知，影響土壤細菌群落的環(huán)境因子主要為-N、DOC、DON、TC、-N 和TN。皮爾森相關(guān)性分析表明，小麥幼苗的生長指標與土壤養(yǎng)分含量顯著相關(guān)（表2），其中-N、NO-3-N、DOC 和DON 與苗干質(zhì)量、SPAD值和氮肥利用率均呈顯著正相關(guān)，而與苗碳氮比呈顯著負相關(guān)（P＜0.01）。TC、-N、DON 與株高呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）。

圖3 土壤細菌群落結(jié)構(gòu)與土壤性質(zhì)的冗余分析Figure 3 Redundancy analysis（RDA）of soil bacterial community structure and soil properties

表2 小麥苗期生長指標和土壤性質(zhì)的相關(guān)性分析Table 2 Pearson correlation analysis of wheat seedling growth characteristics and soil properties

基于隨機森林模型篩選出3 種具有顯著差異的土壤細菌門類群，將其與土壤因子進行皮爾森相關(guān)性分析（表3）。結(jié)果表明土壤TC、TN、-N 和DON 含量與擬桿菌門（Bacteroidetes）、厚壁菌門（Firmicutes）和硝化螺菌門（Nitrospirae）均呈顯著正相關(guān)。多元回歸結(jié)果（表4）顯示，pH、TC、-N、-N、細菌群落及多樣性等能夠共同解釋小麥苗干質(zhì)量變異的88.9%（r=0.943，P=0.027），顯著性檢驗結(jié)果表明-N含量對苗干質(zhì)量的影響具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

表3 顯著差異細菌門類群相對豐度和土壤性質(zhì)的相關(guān)性分析Table 3 Pearson correlation analysis among the relative abundance of most significant bacterial phyla and soil properties

表4 小麥幼苗干質(zhì)量與土壤性質(zhì)及細菌群落結(jié)構(gòu)之間的多元回歸分析Table 4 Multiple regression analysis of soil properties，bacterial community structure and wheat seedling dry mass

3 討論

3.1 不同有機肥處理對小麥生長和氮肥利用率的影響

本研究發(fā)現(xiàn)施用豬糞和生物轉(zhuǎn)化后蟲糞對土壤養(yǎng)分和小麥幼苗的生長均具有一定的促進作用。土壤的養(yǎng)分含量（總碳、總氮、銨態(tài)氮、硝態(tài)氮及可溶性有機碳氮）和小麥生長指標（株高、葉面積、苗干質(zhì)量及SPAD 值）均增加，且施用等氮量豬糞與蟲糞的效果一致，表明畜禽糞肥經(jīng)生物轉(zhuǎn)化后對土壤和作物的生長同樣具有重要作用，可作為有效轉(zhuǎn)化畜禽廢棄物資源的可能途徑。這與田小燕等[19]的研究結(jié)果一致，經(jīng)過生物堆肥后的蟲糞對土壤肥力和植物生長具有促進作用。作物的株高、葉面積和苗干質(zhì)量等生長指標能夠反映作物的生長狀況和養(yǎng)分吸收情況，SPAD值表征了作物葉片中葉綠素的相對含量，反映作物的光合能力和長勢[20]。等氮量蟲糞和豬糞處理增加了土壤碳氮養(yǎng)分，滿足了小麥生長的養(yǎng)分需求，進而同等程度地增加了小麥地上部生物量的積累以及葉綠素含量，說明畜禽糞肥經(jīng)生物堆肥處理后能夠促進小麥生長[21-22]。

氮肥利用率能夠表征施用的氮肥被作物吸收、在土壤中殘留及環(huán)境損失的實際情況，是用于評價氮肥施用效果的重要指標[23]。本研究發(fā)現(xiàn)施用豬糞處理土壤中小麥氮肥利用率高于生物堆肥后蟲糞處理的氮肥利用率。這可能是由于后者經(jīng)白星花金龜幼蟲處理后更多的氮源成為腐植酸的主要成分[24]，在保證植物生長的同時，又為后續(xù)生長提供了穩(wěn)定有效的養(yǎng)分資源庫[25]。Li 等[24]研究發(fā)現(xiàn)以玉米秸稈和木屑飼喂白星花金龜幼蟲，提取的蟲糞無植物毒性，且腐植酸含量達到24.37%和14.46%。因此，今后還需通過觀測整個小麥生長周期進一步認識生物堆肥氮素的有效性。

3.2 不同有機肥處理對土壤細菌群落的影響

土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性是衡量土壤質(zhì)量的重要指標[26]。細菌作為土壤中最為豐富的一類微生物，對維持土壤生態(tài)系統(tǒng)具有重要意義。本研究表明，與施用豬糞相比，施用蟲糞對土壤細菌α 多樣性和群落結(jié)構(gòu)均無顯著影響，說明蟲糞攜帶的微生物沒有改變土壤細菌群落，這與Wang 等[27]研究的家蠅幼蟲生物堆肥的結(jié)果一致。有學者通過溯源分析的方法，發(fā)現(xiàn)家蠅幼蟲生物堆肥第1 天僅有1.4%的細菌源于幼蟲腸道，而在處理的第6 天，有近20%的細菌來源于幼蟲腸道，說明堆肥處理過程中腸道微生物的組成顯著影響了畜禽糞便微生物組成[27]。本研究也推測，白星花金龜幼蟲生物降解過程中腸道微生物發(fā)揮了巨大作用。白星花金龜幼蟲的腸道主要分為三部分：前腸、中腸和后腸[11]。中腸是一個pH 高達11的堿性環(huán)境，能消解大部分糞源性微生物；而后腸含有大量消化有機化合物的蛋白酶[12]。經(jīng)腸道處理產(chǎn)生的蟲糞微生物結(jié)構(gòu)相對穩(wěn)定，且大部分畜禽攜帶的致病菌被去除[28]。Zhao 等[29]也發(fā)現(xiàn)，豬糞和雞糞經(jīng)白星花金龜幼蟲生物處理后，微生物之間的關(guān)系更加穩(wěn)定，土壤抗生素抗性基因的傳播風險降低?；谶@一結(jié)論，筆者認為白星花金龜幼蟲可以將畜禽有機廢棄物有效轉(zhuǎn)化，產(chǎn)生的蟲糞具有較低的生態(tài)風險。

盡管生物堆肥對土壤細菌α 多樣性和群落結(jié)構(gòu)的影響不顯著，但對部分細菌類群的相對豐度產(chǎn)生了顯著影響，如擬桿菌門、厚壁菌門和硝化螺菌門，這與Wolters 等[30]的研究結(jié)果類似。施加糞肥增加了厚壁菌門的相對豐度，這可能是由于厚壁菌門更能適應(yīng)富碳的環(huán)境[31]，可以參與有機碳等復(fù)雜有機物的降解，能夠為作物生長提供養(yǎng)分。硝化螺菌門是土壤中主要的硝化細菌，而小麥是喜硝作物[32]，因此施加糞肥可提高土壤中硝化螺菌門，有利于促進土壤中-N向-N 的轉(zhuǎn)化，進而為小麥提供有效養(yǎng)分。而施用蟲糞的土壤中擬桿菌門的相對豐度顯著低于施用豬糞處理。擬桿菌門主要來自畜禽腸道，往往攜帶一些致病菌等[29]，對土壤環(huán)境造成潛在的生態(tài)風險。本研究發(fā)現(xiàn)生物堆肥處理顯著降低擬桿菌門的相對豐度，這與Wang等[27]對家蠅幼蟲的研究結(jié)果相似，但與Ao 等[33]對黑水虻的研究結(jié)果相反，原因可能是不同腐食性動物腸道微生物組成及其與外源畜禽微生物作用方式不同有關(guān)。這一結(jié)果也再次證明白星花金龜幼蟲在畜禽有機廢棄物轉(zhuǎn)化中的潛在價值。

4 結(jié)論

（1）經(jīng)白星花金龜幼蟲轉(zhuǎn)化后的蟲糞和等氮量豬糞施用均顯著提高了土壤養(yǎng)分（TC、TN、-N、-N、DOC、DON）含量，促進了小麥幼苗的生長，而施用蟲糞處理的小麥氮肥利用率低于施用豬糞處理。

（3）與施用豬糞相比，施用其生物堆肥產(chǎn)物對土壤細菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性的影響不顯著，這對維持土壤生態(tài)功能具有重要的參考價值。

致謝：感謝湖南農(nóng)業(yè)大學沈維軍教授在樣品制備過程中的幫助，同時感謝中國科學院生態(tài)環(huán)境研究中心張麗梅研究員對論文工作的指導(dǎo)。