宜賓芽菜源耐高鹽植物乳桿菌LPYC-4凍干發(fā)酵劑的優(yōu)化

陳俊宏，周雨濃，羅素琴，楊強，王洋，葉陽*

(1.四川輕化工大學(xué) 生物工程學(xué)院，四川 宜賓 644000；2.四川宜賓碎米芽菜有限公司，四川 宜賓 644011)

宜賓芽菜是川南地區(qū)的著名特產(chǎn)，以其“鮮、香、嫩、 脆”的獨特風(fēng)味深受大家喜愛，是川菜中的重要原料，暢銷國內(nèi)外。宜賓芽菜傳統(tǒng)工藝[1]采用的是自然發(fā)酵，微生物在高鹽條件下受到抑制，使得產(chǎn)品發(fā)酵風(fēng)味不足；其發(fā)酵周期長、產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定[2]，這些都嚴(yán)重制約著宜賓芽菜產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。近年來，眾多專家學(xué)者[3-4]提出選育優(yōu)良的乳酸菌菌株代替自然發(fā)酵，既能有效縮短芽菜發(fā)酵周期，同時使發(fā)酵風(fēng)味更加濃郁，使芽菜的產(chǎn)品質(zhì)量更突出。純種發(fā)酵[5-6]相比于傳統(tǒng)發(fā)酵工藝，標(biāo)準(zhǔn)化程度更高，能更大程度上滿足工業(yè)化的生產(chǎn)需求。

植物乳桿菌是宜賓芽菜發(fā)酵過程中的優(yōu)勢菌株，在賦予芽菜發(fā)酵風(fēng)味和獨特口感方面起著關(guān)鍵作用。乳酸菌菌株在實際保藏過程中會出現(xiàn)菌體失活[7]、發(fā)酵能力下降等問題，難以適應(yīng)工業(yè)化的生產(chǎn)需要。直投式乳酸菌發(fā)酵劑穩(wěn)定性強、容易保存，并且具有發(fā)酵菌粉活力高、直接投放使用、成本低、生產(chǎn)方法簡單等優(yōu)點，被廣泛應(yīng)用到生產(chǎn)生活中。但目前關(guān)于發(fā)酵劑的工業(yè)化應(yīng)用研究還主要集中在泡菜生產(chǎn)[8]、乳制品加工[9]等行業(yè)，在宜賓芽菜等傳統(tǒng)行業(yè)中的應(yīng)用還未見報道。研究表明,真空冷凍干燥技術(shù)可維持乳酸菌的活力和儲藏過程中的長期穩(wěn)定性[10]，而糖類[11]、蛋白質(zhì)、氨基酸和醇類等冷凍保護(hù)劑[12]可有效提高乳酸菌的凍干抗逆性，降低菌體損傷?？祴傻萚13]將泡菜中分離得到的發(fā)酵乳桿菌FYa1在海藻糖8.5 g/dL、蔗糖 8.5 g/dL和谷氨酸鈉2.5 g/mL的最佳配比下制備的凍干菌粉存活率可達(dá)(68.53±0.09)%，并具有良好的發(fā)酵性能。發(fā)酵劑的保護(hù)配方由于乳酸菌的生理特性不同而有所差異[14]，呈現(xiàn)出不同的保護(hù)效果。趙爽等[15]利用植物乳桿菌P158在海藻糖7%、蔗糖7%、谷氨酸鈉5%的條件下，制備泡菜用發(fā)酵劑的凍干存活率達(dá)到75.6%。保護(hù)劑能減少低溫干燥過程中對菌體細(xì)胞物理、化學(xué)損傷或復(fù)水時對細(xì)胞的損害[16]，保持細(xì)胞中多種生物活性和理化特性，從而保證發(fā)酵劑中菌體活力。眾多研究表明[17-18]，發(fā)酵劑在實際的生產(chǎn)應(yīng)用中能很大程度上改善傳統(tǒng)自然發(fā)酵產(chǎn)品的質(zhì)量[19]，增強產(chǎn)品的風(fēng)味[20]，在工業(yè)化生產(chǎn)中具有巨大的應(yīng)用前景。

從宜賓芽菜中分離得到的植物乳桿菌耐鹽性可達(dá)到12%，亞硝酸鹽降解能力可達(dá)到97.54%以上，具有優(yōu)良的產(chǎn)酸性能，本研究以LPYC-4菌株為研究對象，利用真空冷凍干燥方法從6種不同的保護(hù)劑中篩選出合適的凍干保護(hù)劑，并對其配方進(jìn)行優(yōu)化，制備高活力的植物乳桿菌發(fā)酵劑。本文旨在開發(fā)一種發(fā)酵活力高、亞硝酸鹽降解能力強、穩(wěn)定性高的芽菜發(fā)酵劑，對提高宜賓芽菜產(chǎn)品發(fā)酵質(zhì)量、宜賓芽菜的工業(yè)化生產(chǎn)起到促進(jìn)作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗菌株

耐高鹽乳酸菌LPYC-4菌株：分離自宜賓傳統(tǒng)芽菜，四川輕化工大學(xué)生物工程學(xué)院食品實驗室保存。

1.1.2 試劑

甘油：成都市科隆化學(xué)品有限公司；山梨糖醇、谷氨酸鈉、甘氨酸：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；脫脂乳粉：上海源葉生物科技有限公司；海藻糖：博美生物科技有限公司；MRS肉湯、MRS固體培養(yǎng)基：青海海博生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

NanoDrop One型超微量分光光度計 賽默飛世爾科技公司；Scientz-10N型冷凍干燥機 寧波新芝生物科技股份有限公司；TG16G型離心機 鹽城市凱特實驗儀器有限公司；HWS-250B型恒溫培養(yǎng)箱 天津市宏諾儀器有限公司；ZDJ-4A型自動電位滴定儀 上海精科有限公司；QYC-2102C型雙層小容量全溫恒溫培養(yǎng)搖床 上海福瑪實驗設(shè)備有限公司；UV-1900i型紫外可見分光光度計 島津儀器(蘇州)有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 生長曲線測定

將活化后的耐高鹽植物乳酸菌LPYC-4菌株按2%的比例接種到MRS培養(yǎng)液中30 ℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)，測定其在48 h內(nèi)的OD600 nm值，每隔2 h測定一次，繪制生長曲線。

1.3.2 pH值測定

將活化后的耐高鹽植物乳酸菌LPYC-4菌株按2%的比例接種到MRS培養(yǎng)液中30 ℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)，測定其在48 h內(nèi)的pH值，每隔2 h測定一次，繪制pH變化曲線，pH值采用精密pH計測定。

1.3.3 乳酸菌凍干試驗流程及操作要點

菌株活化→擴(kuò)大培養(yǎng)→離心收集菌體→菌體懸液(加入凍干保護(hù)劑溶液)→分裝→預(yù)凍→真空冷凍干燥→凍干菌粉→復(fù)水→活菌計數(shù)→計算存活率。

保護(hù)劑溶液的配制：采用控制變量法將保護(hù)劑中的一種或幾種按照各自的質(zhì)量濃度用蒸餾水溶解，攪拌均勻，于110 ℃滅菌15 min，通過孔徑為0.22 μm的濾膜除菌，置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

將活化2次后的乳酸菌，按照體積分?jǐn)?shù)為2%的接種量接種到MRS肉湯培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，置于37 ℃、150 r/min搖床中恒溫培養(yǎng)24 h。將發(fā)酵液分裝后，在轉(zhuǎn)速為6 000 r/min離心條件下離心15 min，倒掉上清液，再用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9%的生理鹽水沖洗2次后，離心得到菌泥。加入原發(fā)酵液體積1/10的保護(hù)劑溶液，混勻得到菌懸液，按照稀釋涂布平板法接種到MRS固體培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，計算凍干前的活菌數(shù)(記為n1)，每組做3個平行。將制備好的菌懸液放入-20 ℃冷凍室12 h，進(jìn)行預(yù)冷凍，使其凍結(jié)均勻；預(yù)凍結(jié)束后轉(zhuǎn)移至真空冷凍干燥機中，在冷阱溫度為-50 ℃、真空度<15 Pa的條件下，真空冷凍干燥24 h，得到凍干菌粉。

1.3.4 凍干后的菌種存活率

向凍干后的乳酸菌粉中加入與凍干前等體積的生理鹽水(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.85%)進(jìn)行復(fù)水，并稀釋到合適的濃度，按照稀釋涂布平板法接種到MRS固體培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫厭氧培養(yǎng)48 h，用平板計數(shù)法計數(shù)，每組做3個平行。凍干存活率計算公式如下：

式中：K為凍干存活率；n1為凍干前活菌數(shù)；n2為凍干后活菌數(shù)。

1.3.5 指標(biāo)測定方法

1.3.5.1 乳酸菌活菌數(shù)測定

菌落計數(shù)參照GB 4789.35—2016中的方法，采用稀釋梯度法。

1.3.5.2 菌懸液濃度測定

采用超微量分光光度計測定菌懸液在600 nm處的OD值。

1.3.6 單因素試驗

采用單因素試驗對甘油、山梨糖醇、脫脂乳粉、海藻糖、谷氨酸鈉、甘氨酸6種保護(hù)劑進(jìn)行篩選，按照1.3.3中所述方法進(jìn)行凍干試驗，以凍干存活率為依據(jù)，研究各種單一保護(hù)劑對植物乳酸菌LPYC-4存活率的影響。

1.3.7 發(fā)酵劑正交優(yōu)化

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選擇脫脂乳粉、谷氨酸鈉、海藻糖、甘氨酸4個因素中保護(hù)效果較好的3個水平，以乳酸菌的凍干存活率(K)為指標(biāo)，設(shè)計了四因素三水平L9(34)正交試驗，試驗設(shè)計見表1。

表1 正交試驗設(shè)計因素水平Table 1 Factors and levels of orthogonal test design

1.4 發(fā)酵劑穩(wěn)定性試驗

將真空冷凍干燥后的乳酸菌凍干粉于4 ℃下冷藏保存，從第0天起，每隔10 d測定其活菌數(shù)，并計算菌體存活率。

1.5 數(shù)據(jù)處理分析

采用Excel、IBM SPSS Statistics 25.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析，采用Origin 9.0進(jìn)行圖片處理制作。

2 結(jié)果與分析

2.1 耐高鹽植物乳桿菌LPYC-4菌株生長曲線及pH測定

植物乳桿菌LPYC-4菌株生長曲線及pH見圖1。

圖1 植物乳桿菌LPYC-4菌株生長曲線及pH測定Fig.1 Strain growth curve and pH determination of Lactobacillus plantarum LPYC-4

由圖1可知，植物乳桿菌LPYC-4在0～4 h生長緩慢，菌株處于延滯期，在此期間內(nèi)組間OD600 nm值無顯著性差異(P>0.05)，培養(yǎng)基pH由5.86降低到5.6；4 h后進(jìn)入對數(shù)生長期，在此期間菌體細(xì)胞迅速生長，OD600 nm值差異性顯著(P<0.05)；24 h時發(fā)酵液中菌體濃度達(dá)到3.59×108CFU/mL，培養(yǎng)基pH迅速下降到3.96，菌株開始進(jìn)入穩(wěn)定期，在此期間LPYC-4菌株繁殖極少，曲線基本保持穩(wěn)定狀態(tài)，菌株產(chǎn)酸能力也開始減弱；培養(yǎng)46 h后培養(yǎng)基pH穩(wěn)定在3.71左右，與忻曉庭等[21]的研究結(jié)果相一致。由于菌種在對數(shù)生長末期生理結(jié)構(gòu)和代謝功能處于穩(wěn)定期，此時的菌體抗逆性更強[22]，因此選擇擴(kuò)大培養(yǎng)22～24 h內(nèi)的LPYC-4菌株作為凍干發(fā)酵劑的研究對象更為有利。

2.2 不同保護(hù)劑對菌株存活率的影響

2.2.1 不同谷氨酸鈉濃度對菌株存活率的影響

真空冷凍干燥法制備乳酸菌發(fā)酵劑的過程中，由于環(huán)境溫度驟降會導(dǎo)致微生物生理代謝異常，通過向菌懸液中添加合適的凍干保護(hù)劑可以有效降低菌株抵抗外界環(huán)境改變對菌種產(chǎn)生的不可逆損傷[23]，提高菌株的存活率。

圖2 不同谷氨酸鈉濃度對于LPYC-4菌株凍干存活率的影響Fig.2 Effect of different sodium glutamate concentrations on lyophilized survival rate of LPYC-4 strain

由圖2可知，當(dāng)以谷氨酸鈉為凍干保護(hù)劑時，對植物乳桿菌LPYC-4的保護(hù)效果比較明顯。當(dāng)谷氨酸鈉的濃度為10%時，植物乳桿菌LPYC-4的存活率最高，可達(dá)到55.75%；當(dāng)濃度在6%～10%時，隨著濃度的增加，菌體的存活率不斷上升，菌種受凍干的影響在不斷減小；當(dāng)濃度大于10%時，谷氨酸鈉濃度的增加對菌體的保護(hù)效果不再增大，植物乳桿菌LPYC-4的存活率基本保持不變(P>0.05)，其影響規(guī)律與郝倩男等[24]的研究結(jié)果相一致。類似的研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)最優(yōu)配方中谷氨酸鈉的質(zhì)量濃度為15.0 g/dL時，對乳酸菌株686的保護(hù)作用最好，菌體存活率最高，可達(dá)76.78%。由此可見，谷氨酸鈉是用于制備乳酸菌發(fā)酵劑的較好基質(zhì)，谷氨酸鈉在進(jìn)入細(xì)胞后，會通過自身攜帶的氨基與細(xì)菌蛋白質(zhì)的羧基發(fā)生縮合反應(yīng)，提高蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，從而提高了菌體適應(yīng)外界極端環(huán)境的能力[23]。綜合考量，選擇10%谷氨酸鈉作為乳酸菌發(fā)酵劑的凍干保護(hù)劑，進(jìn)行發(fā)酵劑配方的優(yōu)化。

2.2.2 不同脫脂乳粉濃度對菌種存活率的影響

脫脂乳粉是制備益生菌微生態(tài)制劑時廣泛使用的保護(hù)壁材，其中的乳清蛋白可以使菌體微膠囊化[25]，避免其暴露于外界環(huán)境中，從而可以降低冷凍干燥過程中對細(xì)胞造成損傷。其中含有的乳清蛋白可以為細(xì)胞提供保護(hù)性外膜，保護(hù)細(xì)胞免受外界干擾而造成損傷。

圖3 不同脫脂乳粉濃度對LPYC-4菌株凍干存活率的影響Fig.3 Effect of different skimmed milk powder concentrations on lyophilized survival rate of LPYC-4 strain

由圖3可知，當(dāng)脫脂乳粉濃度在10%～14%時對乳酸菌的存活率影響不大，當(dāng)脫脂乳粉濃度為16%時出現(xiàn)峰值，最高存活率為56.52%；當(dāng)濃度高于16%之后，乳酸菌的凍干存活率呈現(xiàn)急劇下降的趨勢，高濃度的保護(hù)劑會抑制菌體的生長，原因可能是高濃度的脫脂乳粉降低了細(xì)胞膜的流動性，阻礙了菌體與外界的物質(zhì)交流[26]。研究發(fā)現(xiàn)脫脂乳粉15.98 g/dL的條件下植物乳桿菌L12菌體的存活率為83.66%[27]，由此可見，脫脂乳粉在保證植物乳桿菌的存活率方面具有較好的作用。其次，脫脂乳粉作為保護(hù)劑，可提供多孔無定形結(jié)構(gòu)，冷凍干燥后易于成形，對菌劑顆粒的分散性較好，組織形態(tài)較完整，復(fù)水更容易，更利于應(yīng)用于生產(chǎn)中作為乳酸菌發(fā)酵劑的良好賦形劑[28]。

2.2.3 不同甘油濃度對菌種存活率的影響

不同甘油濃度下植物乳桿菌LPYC-4經(jīng)冷凍干燥后的存活率見圖4。

圖4 不同甘油濃度對LPYC-4菌株凍干存活率的影響Fig.4 Effect of different glycerol concentrations on lyophilized survival rate of LPYC-4 strain

由圖4可知，當(dāng)甘油濃度較低時，植物乳桿菌的存活率隨著甘油濃度的增加而小幅度提高，當(dāng)甘油濃度超過9%時，植物乳桿菌的凍干存活率開始下降。甘油對植物乳桿菌LPYC-4的凍干存活率在8.45%～28.78%范圍內(nèi)，其最高峰值出現(xiàn)在甘油濃度為9%時，植物乳桿菌的凍干存活率達(dá)到28.78%。此外，研究發(fā)現(xiàn)甘油作為單一保護(hù)劑時對嗜熱鏈球菌M5-5的凍干存活率為47.51%。由此可見，甘油在凍干條件下對植物乳桿菌LPYC-4的保護(hù)作用有限。甘油等滲透性化合物的保護(hù)機制是透過細(xì)胞膜取代部分水分子與菌體蛋白質(zhì)極性基團(tuán)形成氫鍵，使菌體中的大分子物質(zhì)在缺水狀態(tài)下仍能保持原有的功能結(jié)構(gòu)，維持菌體活力[29]，但當(dāng)細(xì)胞環(huán)境中水分損失完全時，甘油與水分子結(jié)合的程度降低，對細(xì)胞的保護(hù)作用減弱。綜合分析，甘油不適合作為凍干保護(hù)劑制作植物乳桿菌LPYC-4發(fā)酵菌粉。

2.2.4 不同海藻糖濃度對菌種存活率的影響

圖5 不同海藻糖濃度對LPYC-4菌株凍干存活率的影響Fig.5 Effect of different trehalose concentrations on lyophilized survival rate of LPYC-4 strain

由圖5可知，隨著海藻糖濃度的增加，乳酸菌的存活率呈現(xiàn)不斷增加的趨勢，當(dāng)海藻糖濃度為4%時，乳酸菌存活率最高，為64.0%；之后乳酸菌的存活率開始遞減，當(dāng)海藻糖濃度為6%時，存活率降為41.38%。對比可以發(fā)現(xiàn)，海藻糖對乳酸菌的保護(hù)效果較好。研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)海藻糖質(zhì)量濃度為6.0 g/mL時，乳酸菌存活率最高，可達(dá)到74.69%。研究發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌菌株 P158凍干保護(hù)劑為海藻糖7%、蔗糖7%、谷氨酸鈉 5%時，菌株凍干存活率可達(dá)75.60%，且活菌數(shù)能達(dá)到7.32×1011CFU/g。眾多研究發(fā)現(xiàn)[30-32]，海藻糖對乳酸菌具有良好的保護(hù)效果，可提高乳酸菌的存活率，適合作為微生物的凍干保護(hù)劑使用。同時海藻糖比蔗糖具有更高的玻璃化溫度[33]，在細(xì)胞內(nèi)形成玻璃態(tài)而不形成冰核，具有極強穩(wěn)定性的非還原性雙糖，極端條件下在細(xì)胞表面能形成獨特的保護(hù)膜，可有效維持生物膜、蛋白質(zhì)、淀粉等各種生物組織和生物大分子的穩(wěn)定性[34]。試驗過程中發(fā)現(xiàn)，若添加糖類保護(hù)劑的濃度過高，凍干后的樣品質(zhì)地較硬且不易粉碎成粉劑，因此綜合考慮實際應(yīng)用及成本費用等因素，最終選擇4%的海藻糖進(jìn)行發(fā)酵劑配方優(yōu)化。

2.2.5 不同甘氨酸濃度對菌種存活率的影響

當(dāng)甘氨酸作為凍干保護(hù)劑時，植物乳桿菌LPYC-4的凍干存活率隨甘氨酸濃度的變化見圖6。

圖6 不同甘氨酸濃度對LPYC-4菌株凍干存活率的影響Fig.6 Effect of different glycine concentrations on lyophilized survival rate of LPYC-4 strain

由圖6可知，植物乳桿菌LPYC-4的凍干存活率隨著甘氨酸濃度的增加而不斷提高，當(dāng)甘氨酸濃度為5%時存活率最高，為68.24%，隨后甘氨酸濃度繼續(xù)增加，菌體的凍干存活率開始下降。研究表明，氨基酸可通過維持冰點下水的表面張力平衡細(xì)胞內(nèi)外的水交換速率，降低冰晶對細(xì)胞的機械損傷。甘氨酸通過與細(xì)胞膜上的特異性受體結(jié)合[35]，改變了細(xì)胞膜的流動性，從而提高了細(xì)胞在冷凍干燥條件下的抗逆性，保證乳酸細(xì)胞的存活率。由此可見，甘氨酸濃度在5%左右能使植物乳桿菌LPYC-4細(xì)胞活性維持在較高水平。

2.2.6 不同山梨糖醇濃度對菌種存活率的影響

山梨糖醇多被用作凍干保護(hù)劑[36]，山梨糖醇具有多個羥基，能與菌體細(xì)胞膜的自由基通過水合作用降低游離水含量，減少低溫下晶核的形成，穩(wěn)定磷脂雙分子層和膜蛋白結(jié)構(gòu)，增加細(xì)胞的穩(wěn)定性，從而起到保護(hù)作用。

圖7 不同山梨糖醇濃度對LPYC-4菌株凍干存活率的影響Fig.7 Effect of different sorbitol concentrations on lyophilized survival rate of LPYC-4 strain

由圖7可知，當(dāng)山梨糖醇濃度在9%～12%范圍內(nèi)時LPYC-4菌株經(jīng)過冷凍干燥后的存活率隨著濃度的增加而升高，當(dāng)濃度為12%時，菌體的存活率出現(xiàn)峰值，為52.74%；當(dāng)山梨糖醇濃度超過12%時，對菌體的保護(hù)作用開始減弱。其他研究也發(fā)現(xiàn)山梨糖醇對LP-7501S乳酸菌菌株具有較好的保護(hù)作用。蔣文鑫等[37]研究發(fā)現(xiàn)山梨糖醇在棉子糖與膠原蛋白等組成的凍干保護(hù)劑下，對短雙歧桿菌的保護(hù)作用接近80%，由此可推斷山梨糖醇對乳酸菌的保護(hù)作用較好。

2.3 植物乳桿菌LPYC-4凍干發(fā)酵劑配方優(yōu)化

研究表明，多種保護(hù)劑混合使用對菌體的保護(hù)效果優(yōu)于單一的保護(hù)劑。根據(jù)單因素試驗篩選結(jié)果，以植物乳桿菌LPYC-4的凍干存活率(K)為指標(biāo)，采用正交試驗優(yōu)化凍干發(fā)酵劑配方，正交試驗設(shè)計及結(jié)果見表2。

表2 植物乳桿菌LPYC-4凍干發(fā)酵劑正交試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Orthogonal test design and results of Lactobacillus plantarum LPYC-4 lyophilized starter

由表2可知，4種保護(hù)劑對植物乳桿菌LPYC-4的極差R分別為7.36，2.56，8.45，26.80，其大小順序為RD>RC>RA>RB，極差越大表明該因素對菌體存活率的影響越顯著。因此，4種保護(hù)劑對植物乳桿菌LPYC-4凍干存活率的影響主次順序為甘氨酸>海藻糖>脫脂乳粉>谷氨酸鈉。

表3 植物乳桿菌LPYC-4發(fā)酵劑配方正交試驗方差分析結(jié)果Table 3 Results of variance analysis of orthogonal test forLactobacillus plantarum LPYC-4 starter formula

由表3方差分析結(jié)果可知，甘氨酸、海藻糖、脫脂乳粉3種保護(hù)劑對植物乳桿菌LPYC-4凍干存活率的影響極顯著(P<0.01),谷氨酸鈉對植物乳桿菌LPYC-4凍干存活率的影響不顯著(P>0.05)。因此，由k值可知，植物乳桿菌LPYC-4發(fā)酵劑的最佳組合為A2B2C3D3，即脫脂乳粉16%，谷氨酸鈉10%，海藻糖5%，甘氨酸6%。

2.4 發(fā)酵劑優(yōu)化驗證結(jié)果

植物乳桿菌LPYC-4保護(hù)劑的最優(yōu)的配方水平是A2B2C3D3。因此，以脫脂乳粉16%、谷氨酸鈉10%、海藻糖5%、甘氨酸6%為發(fā)酵劑配方，在真空冷凍干燥下凍干后，經(jīng)過3次重復(fù)試驗測得植物乳桿菌LPYC-4菌株的凍干存活率為(77.78±2.90)%，高于所有正交試驗組的存活率，且凍干發(fā)酵劑的活菌數(shù)約為2.01×1010CFU/g。

2.5 貯藏穩(wěn)定性

發(fā)酵劑在長期貯藏過程中的生物濃度和穩(wěn)定性對發(fā)酵劑的實際生產(chǎn)應(yīng)用具有重要意義。按照正交優(yōu)化后的發(fā)酵劑配方制備植物乳桿菌LPYC-4發(fā)酵劑，經(jīng)過真空冷凍干燥機凍干后在4 ℃條件下保存。

圖8 植物乳桿菌LPYC-4發(fā)酵劑的貯藏穩(wěn)定性Fig.8 Storage stability of Lactobacillus plantarum LPYC-4 starter

由圖8可知，隨著保存時間的增加，發(fā)酵劑活菌數(shù)呈現(xiàn)不斷下降的趨勢。在保藏2個月后，發(fā)酵劑中菌體細(xì)胞的存活率為(61.37±2.5)%，含有的活菌數(shù)為3.20×109CFU/g，保持較高的活菌數(shù)。Lee等[38]發(fā)現(xiàn)LactobacillusplantarumJH287在含10%山梨糖醇和10%脫脂乳粉的保護(hù)劑中4 ℃保藏2個月后，菌體存活率可達(dá)77.71%。Gul等[39]研究發(fā)現(xiàn)L.curvatusN19在保護(hù)劑配方為脫脂乳粉20 g/dL、乳糖3.57 g/dL、蔗糖10 g/100 g條件下，4 ℃下貯存6個月仍能保持菌體活性在8.85 log CFU/g，具有良好的穩(wěn)定性。通過對比發(fā)現(xiàn)，此配方下發(fā)酵劑的貯藏穩(wěn)定性較差，與Lee等的研究還存在一定的差異，其原因可能與所用菌種的生理特性有關(guān)。因此，還需要進(jìn)一步優(yōu)化發(fā)酵劑的配方以提高植物乳桿菌LPYC-4在實際保藏過程中菌株活力的穩(wěn)定性。

3 結(jié)論

研究表明，添加不同類型的保護(hù)劑可有效改善菌體凍干微環(huán)境，緩解菌株凍干損傷，提高抗凍性能。通過單因素試驗篩選出甘氨酸、海藻糖、脫脂乳粉、谷氨酸鈉4種對植物乳桿菌LPYC-4具有較好保護(hù)效果的凍干保護(hù)劑，并利用正交試驗優(yōu)化發(fā)酵劑配方。其最佳配方組合為脫脂乳粉16%、谷氨酸鈉10%、海藻糖5%、甘氨酸6%，在此條件下經(jīng)過冷凍干燥得到活性較高的發(fā)酵劑，植物乳桿菌LPYC-4凍干存活率為(77.78±2.90)%，活菌數(shù)約為2.01×1010CFU/g。在貯藏穩(wěn)定性試驗中，優(yōu)化發(fā)酵劑配方后的植物乳桿菌LPYC-4在4 ℃條下保藏2個月后，菌體細(xì)胞的存活率仍能達(dá)到(61.37±2.5)%，含有的活菌數(shù)為3.20×109CFU/g，保持較高的活菌數(shù)。以上研究為改進(jìn)傳統(tǒng)宜賓芽菜發(fā)酵工藝，提高宜賓芽菜產(chǎn)品發(fā)酵質(zhì)量，推進(jìn)芽菜強化發(fā)酵工藝的工業(yè)化應(yīng)用起到了積極的促進(jìn)作用。