干酪乳桿菌高密度發(fā)酵工藝優(yōu)化

馬精陽(yáng)，姜海龍，袁月明，李錦生，蘇佳興，周麗娜

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)工程技術(shù)學(xué)院，吉林長(zhǎng)春 130118）

乳酸菌是大量應(yīng)用到我們生產(chǎn)生活中的一類益生菌，安全性已經(jīng)得到了多方的檢驗(yàn)與認(rèn)可（鄒孟琳等，2021；吳軍林等，2018）。干酪乳桿菌作為乳酸菌之一，能承受動(dòng)物機(jī)體防御，進(jìn)入體內(nèi)后可以保持活性并促進(jìn)其所在宿主的各項(xiàng)生理指標(biāo)良性發(fā)展，提高免疫力及健康度進(jìn)而提升生長(zhǎng)性能（Deng Ziteng等，2021；陸文偉等，2019；王譽(yù)穎等，2019）。圍繞著干酪乳桿菌進(jìn)行的試驗(yàn)越來(lái)越多，它的各種功用也慢慢被發(fā)現(xiàn)，導(dǎo)致其需求量也隨之增加（呂佳璐等，2021；Hernandez-Mendoza等，2009）。因此，在工業(yè)生產(chǎn)中如何通過提高其活菌數(shù)來(lái)獲得更高的收益成為研究者倍受關(guān)注的問題。楊瑞冬等（2019）研究表明，在生產(chǎn)過程中菌種所需要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)主要來(lái)源于發(fā)酵液，可以通過確定發(fā)酵液成分并輔以環(huán)境條件控制來(lái)達(dá)到最優(yōu)發(fā)酵工藝，從而提升菌種產(chǎn)量（張翠綿等，2019；王丹婷等，2018；于平等，2016）。本研究通過單因素及正交試驗(yàn)對(duì)發(fā)酵液成分以及發(fā)酵過程進(jìn)行優(yōu)化，并以活菌數(shù)作為測(cè)量指標(biāo)，探究一種高密度發(fā)酵工藝，為工廠生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌種 干酪乳桿菌，保存于吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 試劑 葡萄糖、果糖、乳糖、蔗糖、蛋白胨、酵母膏、胰蛋白胨、牛肉膏、硫酸鎂、硫酸錳、硫酸鐵、硫酸鋅、碳酸鈉均購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。紅薯淀粉、蘋果、橙子、山楂、西瓜均采購(gòu)于當(dāng)?shù)厥袌?chǎng)，將蘋果、橙子、山楂、西瓜榨汁后經(jīng)紗布過濾，并將得到的濾液進(jìn)行高溫高壓滅菌用于試驗(yàn)。

1.1.3 基礎(chǔ)培養(yǎng)基 使用MRS培養(yǎng)基進(jìn)行活菌數(shù)量測(cè)量，去除MRS培養(yǎng)基中的瓊脂后作為基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基使用。

1.2 儀器設(shè)備 GR85DR型高壓蒸汽滅菌鍋：深圳市萬(wàn)千科技有限公司;電子天平：上海浦春計(jì)量?jī)x器有限公司；超凈工作臺(tái)：上海錦屏儀器儀表有限公司通州分公司；LRH-150型恒溫生化培養(yǎng)箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 干酪乳桿菌菌種的活化 將實(shí)驗(yàn)室保存的菌種凍干粉取出，室溫靜置5 min后在無(wú)菌操作臺(tái)以2%的接種量接種到裝有無(wú)菌液體MRS培養(yǎng)基的試管中，充分搖勻后在37℃恒溫箱中培養(yǎng)48 h得到一代菌，將得到的一代菌再次培養(yǎng)48 h得到二代菌進(jìn)行試驗(yàn)。

1.3.2 菌種發(fā)酵液成分單因素試驗(yàn) 通過單因素試驗(yàn)，分別研究碳源（葡萄糖、乳糖、果糖、蔗糖）、氮源（牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、胰蛋白胨）、碳氮比（1:1、1:2、1:3、2:1、3:1）、微量元素（硫酸鎂、硫酸鐵、硫酸錳、硫酸鋅）對(duì)菌種發(fā)酵的影響，選取試驗(yàn)結(jié)果排名的前三種，作為后續(xù)正交試驗(yàn)的備選成分。

發(fā)酵液各物質(zhì)用量以MRS培養(yǎng)基作為參考，保持濃度不變的的情況下相應(yīng)替換成試驗(yàn)所用物質(zhì)。將活化后得到的二代菌液以2%的接種量接種到試驗(yàn)發(fā)酵液中，恒溫培養(yǎng)24 h后，使用平板涂布法檢測(cè)活菌數(shù)。

1.3.3 菌種發(fā)酵液成分正交試驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行三水平四因素的正交試驗(yàn)，確定最佳發(fā)酵液成分組合。

表1 發(fā)酵液成分優(yōu)化正交試驗(yàn)因素水平

1.3.4 發(fā)酵液中添加促生長(zhǎng)因子 在最優(yōu)發(fā)酵液成分基礎(chǔ)上，分別添加紅薯淀粉、蘋果汁、橙汁、山楂汁、西瓜汁，測(cè)試添加后對(duì)菌種發(fā)酵的影響。

1.3.5 菌種發(fā)酵過程優(yōu)化 （1）在發(fā)酵過程中補(bǔ)充添加最適碳氮源；（2）發(fā)酵過程中分別添加碳酸鈉和氨水，對(duì)發(fā)酵液pH進(jìn)行調(diào)節(jié)并對(duì)比發(fā)酵后菌種數(shù)量。

1.3.6 發(fā)酵后活菌數(shù)的測(cè)定 取1 mL菌液，稀釋10-8后用涂布法使其均勻分布在平板培養(yǎng)基中，將培養(yǎng)基置于37℃恒溫箱中，24 h后取出讀數(shù)，數(shù)值擴(kuò)大108即為原菌液中每毫升含有的活菌數(shù)值。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵液成分單因素試驗(yàn)

2.1.1 碳源種類對(duì)菌種發(fā)酵的影響 在碳源組試驗(yàn)中，分別使用了葡萄糖、乳糖、果糖和蔗糖進(jìn)行菌種發(fā)酵測(cè)試，通過圖1可以看出，發(fā)酵效果依次為葡萄糖＞乳糖＞果糖＞蔗糖。其中葡萄糖的發(fā)酵效果最佳，發(fā)酵后活菌數(shù)達(dá)到8×108CFU/mL。在分類上，葡萄糖和果糖都屬于單糖，在結(jié)構(gòu)式上屬于同分異構(gòu)體，都可以直接參與細(xì)胞的生長(zhǎng)代謝，但是由于其化學(xué)鍵不同，所產(chǎn)生的能量大小也有著些許差異，導(dǎo)致發(fā)酵效果出現(xiàn)差異。而乳糖、蔗糖屬于多糖，相比前兩種碳源其利用速度更慢，需要先經(jīng)過細(xì)胞產(chǎn)生的分解酶進(jìn)行分解后再參與細(xì)胞的生長(zhǎng)代謝。由于在這一段培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)葡萄糖提供了更多的能量，導(dǎo)致該組活菌數(shù)數(shù)值最高。

圖1 碳源種類對(duì)菌種發(fā)酵的影響

2.1.2 氮源種類對(duì)菌種發(fā)酵的影響 在氮源組試驗(yàn)中，分別使用了牛肉膏、胰蛋白胨、蛋白胨、酵母膏進(jìn)行菌種發(fā)酵測(cè)試，通過圖2可以看出，發(fā)酵效果排序依次為牛肉膏＞胰蛋白胨＞蛋白胨＞酵母膏。其中牛肉膏的發(fā)酵效果最佳，達(dá)到7.4×109CFU/mL。在成分上，牛肉膏當(dāng)中含有多種物質(zhì)，例如氨基酸、多肽類、肌酸、肌酸酐核苷酸、甘氨酸、有機(jī)酸、礦物質(zhì)及維生素類，在發(fā)酵中提供氮源的同時(shí)還可以提供一些菌種所需要的其他微量物質(zhì)，對(duì)菌種發(fā)酵起到了很大的促進(jìn)作用。胰蛋白胨含有豐富的氮源、氨基酸等，但是其成分種類與牛肉膏相比較少，所以活菌數(shù)略低于牛肉膏。蛋白胨富含有機(jī)氮化合物，也含有一些維生素和糖類，酵母膏可以提供氨基酸、多肽及有機(jī)酸等物質(zhì)。綜合對(duì)比結(jié)果分析，牛肉膏在發(fā)酵中提供的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)最為全面，符合菌種快速生長(zhǎng)的物質(zhì)需求，所以其活菌數(shù)最高。

圖2 氮源種類對(duì)菌種發(fā)酵的影響

2.1.3 不同碳氮比對(duì)菌種發(fā)酵的影響 在不同碳氮比試驗(yàn)中，使用相同碳氮源以不同的比例進(jìn)行發(fā)酵。由圖3可以看出，發(fā)酵效果排序依次為1:2＞1:3＞2:1＞1:1＞3:1。在發(fā)酵過程中，添加的碳源最后都要轉(zhuǎn)化為葡萄糖參與菌種的生長(zhǎng)代謝，過多的碳源會(huì)導(dǎo)致葡萄糖含量增加，引發(fā)“克勒勃屈利效應(yīng)”，即葡萄糖濃度過高反而會(huì)抑制菌種的生長(zhǎng)，所以在發(fā)酵中使氮源含量增加成倍數(shù)關(guān)系，可有效降低該效應(yīng)的發(fā)生。同時(shí)也能提供充足的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)使菌種密度增加。

圖3 不同碳氮比對(duì)菌種發(fā)酵的影響

2.1.4 微量元素種類對(duì)菌種發(fā)酵的影響 在微量元素試驗(yàn)中，由圖4可以看出，發(fā)酵效果排序?yàn)殄i＞鎂＞鐵＞鋅。不同的微量元素可以產(chǎn)生不同的作用，錳可以作為超氧化物歧化酶、氨肽酶和L-阿拉伯糖異構(gòu)酶等的輔因子；鎂可以作為固氮酶等的輔因子；鐵可以合成菌體組分、維持酶的活性、調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透壓等；鋅可以作為堿性磷酸酶以及多種脫氫酶、肽酶等的輔因子。微量元素與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不同，不能直接用于菌種的生長(zhǎng)代謝，試驗(yàn)中錳元素組的活菌數(shù)更高，說明在該種試驗(yàn)環(huán)境下人為添加錳更符合菌種發(fā)酵的需求。

圖4 微量元素種類對(duì)菌種發(fā)酵的影響

2.2 發(fā)酵液成分正交試驗(yàn)優(yōu)化 由表2可以看出，在當(dāng)前試驗(yàn)環(huán)境條件下，對(duì)發(fā)酵效果產(chǎn)生影響的因素排序?yàn)樘荚矗镜矗疚⒘吭兀咎嫉?，作為菌種生命活動(dòng)的主要能量及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)來(lái)源，在發(fā)酵液中合理使用碳源、氮源將對(duì)菌種最終的發(fā)酵密度產(chǎn)生主要影響。通過正交試驗(yàn)確定最優(yōu)條件為A2B1D2C1，發(fā)酵液基礎(chǔ)成分為乳糖5 g/L、牛肉膏10 g/L、硫酸鎂0.2 g/L，在此條件下發(fā)酵后菌種濃度為6.2×109CFU/mL。

表2 發(fā)酵液成分優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果

2.3 促生長(zhǎng)因子對(duì)發(fā)酵的影響 在菌種生長(zhǎng)過程中，有一些物質(zhì)難以依靠本體提供，需要通過外部獲取，這一類物質(zhì)包括維生素、生物素、煙酸等等。由圖5可以看出，對(duì)發(fā)酵效果影響排序?yàn)樘O果汁＞橙汁＞山楂汁＞紅薯淀粉＞西瓜汁，作為菌種生長(zhǎng)因子來(lái)源，不同材料所含有的物質(zhì)也不盡相同，例如蘋果中含有糖類、維生素類及微量元素類等等，可以在發(fā)酵過程中對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行補(bǔ)充。使用排序前三位的材料，在發(fā)酵液基礎(chǔ)成分上添加10 mL/L的混合生長(zhǎng)因子溶液（蘋果汁：橙汁：山楂汁=3:2:1）。

圖5 不同生長(zhǎng)因子對(duì)菌種發(fā)酵的影響

2.4 干酪乳桿菌發(fā)酵過程優(yōu)化

2.4.1 發(fā)酵期間添加乳糖與牛肉膏 菌種發(fā)酵過程中，隨著時(shí)間推移，發(fā)酵液中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量隨之減少，此時(shí)補(bǔ)充適量的碳氮源可以維持菌種繼續(xù)生長(zhǎng)，以提高發(fā)酵結(jié)束時(shí)的菌種密度。

通過圖6可以看出，在分別補(bǔ)充不同濃度的乳糖之后，發(fā)酵效果排序?yàn)?.3%＞0.4%＞0.5%＞0.2%＞0.1%。添加量超過0.3%后，菌種密度反而出現(xiàn)下降趨勢(shì)，可能是碳源過多導(dǎo)致菌種不能完全消耗其分解的產(chǎn)物，出現(xiàn)葡萄糖堆積，抑制了菌種發(fā)酵效率。因此選擇在培養(yǎng)24 h后向發(fā)酵液中添加0.3%的乳糖來(lái)達(dá)到補(bǔ)充碳源的目的。

圖6 發(fā)酵期間乳糖補(bǔ)充量對(duì)發(fā)酵的影響

通過圖7可以看出，在補(bǔ)充不同濃度的牛肉膏之后，發(fā)酵效果最好的是0.8%這一組，添加量大于0.8%時(shí)各組數(shù)據(jù)出現(xiàn)不穩(wěn)定狀態(tài)，可能是隨著氮源含量的增加導(dǎo)致碳氮比相應(yīng)出現(xiàn)變化，使得原本發(fā)酵液的發(fā)酵環(huán)境被改變，菌種的生長(zhǎng)性能隨之波動(dòng)并呈現(xiàn)出下降趨勢(shì)。因此選擇在培養(yǎng)24 h后向發(fā)酵液中添加0.8%的牛肉膏來(lái)補(bǔ)充氮源。

圖7 發(fā)酵期間牛肉膏補(bǔ)充量對(duì)發(fā)酵的影響

2.4.2 發(fā)酵期間添加碳酸鈉與氨水 干酪乳桿菌在發(fā)酵過程中，菌體會(huì)產(chǎn)生L型旋光性乳酸，導(dǎo)致發(fā)酵環(huán)境的pH逐漸降低，最終嚴(yán)重影響活菌密度，因此需要在發(fā)酵時(shí)對(duì)發(fā)酵液pH進(jìn)行調(diào)節(jié)。通過圖8可以看出，添加不同濃度的碳酸鈉之后，菌種濃度出現(xiàn)差別，其中添加濃度為2.5%時(shí)密度最高，達(dá)到2.9×109CFU/mL。

圖8 發(fā)酵期間碳酸鈉添加量對(duì)發(fā)酵的影響

通過圖9可以看出，添加氨水濃度為4%時(shí)菌種密度最高，達(dá)到3.6×109CFU/mL。綜合對(duì)比兩組試驗(yàn)，添加氨水后發(fā)酵環(huán)境更適宜菌種發(fā)酵，因此選擇在培養(yǎng)24 h后向發(fā)酵液中添加4%的氨水來(lái)調(diào)節(jié)酸堿度，保證菌種生長(zhǎng)環(huán)境。

圖9 發(fā)酵期間氨水添加量對(duì)發(fā)酵的影響

3 結(jié)論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，干酪乳桿菌最優(yōu)發(fā)酵工藝為：對(duì)所用材料全部進(jìn)行滅菌操作后，在無(wú)氧密閉的環(huán)境內(nèi)以溫度為37℃、pH為6.5、接種量為2%的初始條件進(jìn)行發(fā)酵，在此條件下使用乳糖5 g/L、牛肉膏10 g/L、硫酸鎂0.2 g/L、混合生長(zhǎng)因子溶液（蘋果汁：橙汁：山楂汁=3:2:1）10 mL/L的發(fā)酵液進(jìn)行恒溫?zé)o氧發(fā)酵；24 h后向發(fā)酵液中添加濃度0.3%的乳糖、0.8%的牛肉膏與4%的氨水，繼續(xù)發(fā)酵24 h后收獲菌種。在此發(fā)酵工藝條件下，收獲的菌種密度可達(dá)到2.8×1010CFU/mL。