超聲-微波協(xié)同輔助優(yōu)化酸棗果肉多糖提取工藝及抗氧化活性研究

李毅翔,陳芋霏,王艷艷

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，哈爾濱 150040)

酸棗為鼠李科棗屬植物酸棗的果實(shí)。現(xiàn)代研究表明，酸棗的主要化學(xué)成分為黃酮、多糖、生物堿、氨基酸等[1]，其中，多糖具有明顯的降血糖、降血脂、抗炎等作用[2-3]，也是有較強(qiáng)作用的抗氧化成分[4-5]。當(dāng)前，酸棗多糖主要以蒸餾水作提取溶劑進(jìn)行提取，文獻(xiàn)報(bào)道的方法主要有熱水浸提法、酶解法、微波提取法、超聲提取法[6-8]等。然而，單一的提取方法常具有提取時(shí)間較長，耗費(fèi)資源較多的情況。超聲波提取法利用超聲波對(duì)溶劑的空化作用和次級(jí)效應(yīng)，促進(jìn)植物多糖浸出，但其熱效應(yīng)不強(qiáng)，需要較長時(shí)間才能達(dá)到足夠高的提取溫度;微波提取法利用微波能量可迅速達(dá)到較高反應(yīng)溫度，使細(xì)胞內(nèi)的活性成分更易釋放，但傳熱傳質(zhì)不均勻[9]，將上述2種方法相結(jié)合時(shí)，具有高效率低能耗、生物活性好的優(yōu)點(diǎn)。目前，已有將兩者聯(lián)合應(yīng)用于植物天然成分提取的報(bào)道[10-11]，但尚未涉及酸棗多糖，且不同提取溶劑對(duì)成分的提取也有較大影響。因此，本研究通過超聲-微波協(xié)同提取酸棗果肉多糖，優(yōu)化提取工藝，并考察該成分的抗氧化活性，為充分利用酸棗資源提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酸棗：采自山東省臨沂市，去核。果肉于50℃恒溫干燥箱中烘干，粉碎過50目篩，風(fēng)干后密封，置4℃冰箱中保存，備用。

試劑(均為分析純)：水楊酸、雙氧水、鉬酸銨、磷酸三鈉，天津永晟精細(xì)化工有限公司；硫酸亞鐵、無水葡萄糖、維生素 C，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；DPPH，梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

分析天平(MS105),梅特勒-托利多儀器有限公司；數(shù)控超聲波清洗器(KQ-500DB),昆山超聲儀器有限公司；常壓微波合成工作站(MAS-II),上海新儀微波化學(xué)科技有限公司；酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(Synergy MX),美國BIOTEK公司。

1.3 方法

1.3.1 不同提取方法對(duì)酸棗多糖提取率的影響 (1)超聲輔助提取酸棗多糖:在酸棗果肉粉末中按一定料液比加提取溶劑，置于超聲波提取器中，超聲溫度50℃、超聲波功率設(shè)為400 W、超聲25 min、提取液3 000 r/min離心10 min取上清液得酸棗多糖提取液。(2)微波輔助提取酸棗多糖:在酸棗果肉粉末中按一定料液比加提取溶劑，置于常壓微波合成儀中，微波功率200 W、微波時(shí)間3 min,取出后冷卻，3 000 r/min離心10 min取上清液。(3)超聲-微波協(xié)同提取酸棗多糖:采用超聲-微波協(xié)同提取的方式，考察二者協(xié)同順序?qū)?shí)驗(yàn)的影響。微波-超聲提取法具體工藝流程：去核酸棗粉末按料液比1 ∶30分別加入不同提取溶劑，200 W微波提取2 min再在50 ℃下400 W超聲提取25 min,3 000 r/min離心10 min取上清液得酸棗多糖提取液；超聲-微波提取法則先進(jìn)行超聲，而后進(jìn)行微波。

1.3.2 單因素試驗(yàn) 依據(jù)1.3.1 試驗(yàn)方法，考察不同提取溶劑、超聲溫度、料液比、超聲時(shí)間對(duì)微波-超聲聯(lián)合協(xié)同提取酸棗多糖得率的影響。在試驗(yàn)過程中，各因素的考察范圍：蒸餾水與pH值分別為4、5、6、7、8的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液；超聲溫度30、40、50、60、70 ℃；超聲功率300、350、400、450、500 W；料液比1 ∶10、1 ∶20、1 ∶30、1 ∶40、1 ∶50(g/mL)；超聲時(shí)間5、10、15、20、25 min?？疾靺f(xié)同提取順序，先微波提取再超聲輔助提取酸棗多糖得率較高，工藝優(yōu)化以低能耗、高得率為目的，所以在研究其中單因素變量的影響時(shí)，其他各因素固定的條件為pH=7的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液，超聲溫度50℃、料液比1 ∶30，先200 W微波2 min再400 W超聲提取25 min。

1.3.3 響應(yīng)面分析試驗(yàn)與酸棗多糖提取工藝的優(yōu)化 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，確定超聲-微波協(xié)同方式為先微波后超聲，固定提取溶劑pH=7的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液,依據(jù)Box-benhnken 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以超聲溫度、料液比和超聲時(shí)間3個(gè)因素為自變量，設(shè)計(jì)3因素3水平共計(jì)17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)面分析試驗(yàn)(表1)。

表1 響應(yīng)面分析因素的因素與水平

1.3.4 酸棗中多糖的測(cè)定 酸棗果肉中多糖含量的測(cè)定參照姜瓊等[12]優(yōu)化后的方法，并稍作修改。精密吸取酸棗多糖提取液60 μL置于微量離心管中，加入180 μL顯色液(5%苯酚溶液與98%濃硫酸按體積比為1 ∶5混合)，充分渦旋，在沸水浴中加熱25 min。冷卻至室溫，以加入與樣品溶液同濃度乙醇為空白，在490 nm波長處測(cè)定吸光度，以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線y=3.575 6x + 0.169 9，結(jié)果顯示，葡萄糖在0.049～0.295 mg/mL 與吸光度線性關(guān)系良好(R2=0.999 6)，其中x為葡萄糖質(zhì)量濃度(mg/mL)、y為吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算酸棗多糖質(zhì)量濃度，并按式(1)計(jì)算多糖得率。

酸棗多糖得率(%)=[(n×C×V)/m]×100(1)

式(1)中，n為稀釋倍數(shù)、C為待測(cè)樣品的濃度、V為準(zhǔn)確移取待測(cè)樣品的體積、m為準(zhǔn)確稱取多糖樣品質(zhì)量。

從出土文獻(xiàn)看，《居延新簡》的《四時(shí)簿》《月言簿》中，明確記錄了考核地方官員的標(biāo)準(zhǔn)，其中非常重要的一條就是：“務(wù)順?biāo)臅r(shí)月令”。如EPF59·61號(hào)簡：“制詔納言：其令百遼，屢省所典，修厥職，務(wù)順時(shí)氣?！盵14]《居延新簡三》125-126EPF22·50號(hào)簡：“部吏毋犯四時(shí)禁者，敢言之。”[14]《居延新簡四》58EPF59·161號(hào)簡：“會(huì)月二日，謹(jǐn)案部燧六所，吏七人，卒廿四人，毋犯四時(shí)禁者。謁報(bào)，敢言之。”[14]《居延新簡三》138

1.3.5 酸棗多糖的抗氧化性分析 酸棗多糖提取物和維生素 C 的濃度梯度分別為質(zhì)量濃度0.05、0.10、0.2、0.40、0.6、0.8、1.0 mg/mL。參照Yiling Zhu等[13]的方法進(jìn)行酸棗多糖清除DPPH自由基和羥基自由基能力的測(cè)定。清除率計(jì)算公式如式(2)、(3)：

DPPH·清除率(%)=[1-(A1-A2)/A0]× 100

(2)

·OH 清除率(%)=[1-(A1-A3)/A0]× 100

(3)

式(2)、(3)中，A0為空白對(duì)照的吸光度、A1為自由基與多糖或陽性對(duì)照的吸光度、A2為樣品的本底吸光度、A3為乙醇替代水楊酸乙醇溶液的樣品本底吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同提取方法對(duì)酸棗多糖提取率的影響

2.1.1 超聲輔助提取酸棗多糖的得率 如圖1所示，隨著超聲功率的改變，酸棗多糖得率逐漸上升，當(dāng)超聲功率達(dá)400 W時(shí)最高(28.64%)，繼續(xù)加大超聲功率，得率開始降低，可能是多糖分子在較強(qiáng)機(jī)械作用下斷裂，引起提取率的急劇降低[14]；而固定超聲功率，考察超聲時(shí)間發(fā)現(xiàn)處理時(shí)間為25 min時(shí)達(dá)到最高(28.59%)，繼續(xù)延長超聲時(shí)間，得率開始顯著降低。延長超聲輔助提取時(shí)間有利于植物與提取溶劑充分接觸，但對(duì)性質(zhì)不穩(wěn)定的活性物質(zhì)，在長時(shí)間高溫條件下處理可能會(huì)導(dǎo)致提取率的下降。

圖1 不同超聲功率、超聲時(shí)間對(duì)酸棗多糖得率的影響

2.1.2 微波輔助提取酸棗多糖的得率 如圖2所示，多糖得率隨著微波功率的增加，當(dāng)微波功率為200 W時(shí)，得率達(dá)到最高(31.87%)，但當(dāng)微波功率再增大時(shí)，因?yàn)樘崛◇w系溫度更高，多糖斷裂，且溶劑持續(xù)沸騰，水分快速蒸發(fā)，也使產(chǎn)率急速下降；微波處理時(shí)間的延長也呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，為微波時(shí)間為2 min時(shí)得率最大(32.06%)。

圖2 不同微波功率、微波時(shí)間對(duì)酸棗多糖得率的影響

2.1.3 超聲-微波協(xié)同提取多糖的得率 如圖 3A 所示，pH=7的檸檬酸-檸檬酸緩沖溶液作溶劑時(shí)，多糖得率最大為41.37%，這是因?yàn)椴煌琾H值下多糖中一些特定基團(tuán)的溶解程度不同[15]，而檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液中，檸檬酸鈉作為螯合劑，與果膠中的金屬離子結(jié)合能力較強(qiáng)，增加了果膠的溶解性[16]，從而相較蒸餾水有更高的提取率；如圖 3B 所示，隨著超聲溫度的提升先增高后降低，適當(dāng)?shù)臏囟饶芗铀俣嗵堑娜艹觯^高的溫度則會(huì)使多糖結(jié)構(gòu)破壞，當(dāng)提取溫度為60℃時(shí)多糖得率最大為41.27%；如圖3C所示，料液比為1：30時(shí)多糖得率最高為41.45%。由于微波能量較高，使溶劑在提取過程中逐漸耗失，溶劑和物料間的濃度差不斷改變，當(dāng)多糖溶出達(dá)到平衡時(shí)，增加溶劑體積可能降低了超聲的工作效率，進(jìn)而降低了多糖得率；如圖3D所示，微波-超聲協(xié)同提取隨著超聲時(shí)間的延長，多糖得率呈先升高后降低的趨勢(shì)。超聲15 min時(shí)的多糖得率最高，為42.67%。與單一微波和超聲輔助提取方法相比，協(xié)同提取縮短了提取時(shí)間，且二者聯(lián)用所取得的多糖提取率明顯高于超聲提取和微波提取的最高值。

圖3 不同提取條件對(duì)酸棗多糖得率的影響

2.1.4 不同提取方法提取多糖得率的比較 由圖4可知，超聲-微波協(xié)同提取中，協(xié)同順序?yàn)槲⒉?超聲的輔助提取法獲得的酸棗多糖提取率最高(39.84%)，超聲-微波輔助提取率次之(37.99%)，單一微波輔助提取的提取率較低(32.06%)，單一超聲輔助提取的提取率最低(28.64%)。微波-超聲協(xié)同提取順序的多糖提取率較高，可能因?yàn)槎邊f(xié)同作用，先通過微波高效快速穿透薄壁，短時(shí)間內(nèi)達(dá)到較高溫度，提高目標(biāo)組分的擴(kuò)散能力，再在超聲環(huán)境下均勻提取，使細(xì)胞壁消融更徹底，短時(shí)間內(nèi)細(xì)胞內(nèi)的活性多糖充分溶出[17]。

圖4 不同提取方法酸棗多糖提取率

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表3 響應(yīng)面的方差分析結(jié)果

Y=+42.76-0.76A+2.25B+0.15C+0.92AB-0.99AC+0.72BC-1.99A2-1.83B2-3.79C2

(4)

2.2.2 最佳工藝條件及驗(yàn)證性試驗(yàn) 求解回歸方程，得到酸棗果肉多糖提取的最佳工藝條件為超聲溫度 58.6℃、料液比為1 ∶39.15(g/mL)、協(xié)同提取超聲時(shí)間為 15.9 min。預(yù)測(cè)酸棗多糖的得率 43.49%。為了方便實(shí)際試驗(yàn)操作，將理論條件進(jìn)行近似處理，超聲溫度 60℃、料液比為1 ∶40(g/mL)、協(xié)同提取超聲時(shí)間為 16 min。進(jìn)行驗(yàn)證性試驗(yàn)，重復(fù)3次平行試驗(yàn)，得到的結(jié)果分別為 43.26%、41.75%、42.81%，其平均值為(42.61±0.78)%，與預(yù)測(cè)值差異不顯著，說明該工藝具有穩(wěn)定性和可行性。

2.3 酸棗多糖抗氧化性分析

2.3.1 酸棗多糖對(duì)DPPH·清除能力 DPPH·可以捕獲或清除其他的自由基，而被廣泛用于測(cè)定試樣的抗氧化能力[19]。由圖5可知，在質(zhì)量濃度為0.05～1.00 mg/mL 氛圍內(nèi)，隨著維生素C和酸棗多糖濃度的增加，對(duì)DPPH·的清除能力也明顯增加。在酸棗果肉多糖質(zhì)量濃度1 mg/mL時(shí)，對(duì)DPPH·的清除率達(dá)最大值19.12%，但清除率均小于維生素C，這表明酸棗果肉多糖對(duì)DPPH·具有一定的清除效果。

圖5 多糖對(duì)DPPH·的清除作用

2.3.2 酸棗多糖對(duì)·OH清除能力 ·OH是活性氧中活性最強(qiáng)的一種自由基，可以氧化組織中蛋白質(zhì)、糖、核酸等生物大分子，損傷細(xì)胞的結(jié)構(gòu)與功能，導(dǎo)致機(jī)體壞死或突變，因此對(duì)羥基自由基清除的清除能力是抗氧化作用的一個(gè)重要指標(biāo)[20]。由圖6可知，對(duì)·OH 清除活性隨酸棗多糖質(zhì)量濃度的增加而逐漸增強(qiáng)，當(dāng)濃度增大到 0.40 mg/mL 時(shí)，維生素C對(duì)·OH 清除率接近 100%。當(dāng)酸棗多糖達(dá)1.0 mg/mL時(shí)，對(duì)·OH的清除率達(dá)32.99%，試驗(yàn)證明酸棗多糖也具有一定的清除·OH 能力。

圖6 多糖對(duì)·OH的清除作用

3 討論與結(jié)論

以酸棗果肉多糖得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)面對(duì)酸棗多糖微波-超聲提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，得出多糖的最優(yōu)提取率為(42.61±0.78)%，與模型的預(yù)測(cè)值較為接近。與單一超聲輔助提取、單一微波輔助、超聲-微波提取相比，提取率分別增加了13.97%、10.55%、4.62%，且工藝操作簡單，節(jié)省提取時(shí)間，降低能耗污染，使多糖提取效益最大化。而一定pH值范圍內(nèi)的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液較蒸餾水也有較強(qiáng)的多糖提取能力。檸檬酸、檸檬酸鈉作為常見的食品添加劑，可應(yīng)用于食品加工生產(chǎn)中，提高產(chǎn)品風(fēng)味的同時(shí)也能增加有效物質(zhì)的溶出。體外抗氧化試驗(yàn)表明，酸棗果肉多糖具有較強(qiáng)的DPPH·和·OH 清除能力，其抗氧化活性隨酸棗多糖濃度的增加而增強(qiáng)。酸棗果肉為中藥酸棗仁的副產(chǎn)品，資源豐富，可作為良好的天然抗氧化劑來源，本研究將為酸棗的綜合利用和相關(guān)功能性天然產(chǎn)品的開發(fā)與應(yīng)用等提供科學(xué)依據(jù)。