甘肅河西地區(qū)肉羊肌肉和肝腎組織中抗菌藥物殘留的檢測(cè)

宋 晨，格 代，魏衍全，茍惠天，李天昊，委慧玲，齊玉梅，田常青，史文靜，祁國(guó)軍，薛惠文*，張 勇*

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，甘肅蘭州 730070；2.甘南藏族自治州農(nóng)業(yè)農(nóng)村局/甘南州農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測(cè)檢驗(yàn)中心，甘肅合作 747000)

獸藥被廣泛用于食品動(dòng)物養(yǎng)殖中[1]，因其不當(dāng)使用或?yàn)E用造成動(dòng)物性食品中獸藥殘留[2]，尤其是抗微生物藥物的殘留較為突出。據(jù)我國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部2020年度動(dòng)物及動(dòng)物產(chǎn)品獸藥殘留監(jiān)控結(jié)果顯示，豬肉、雞蛋等34批不合格樣品中94.12%檢出抗微生物藥物[3]。當(dāng)人體攝入抗微生物藥物殘留超標(biāo)的動(dòng)物性食品，具有潛在風(fēng)險(xiǎn)，會(huì)導(dǎo)致過(guò)敏反應(yīng)或其他毒副作用，并出現(xiàn)了細(xì)菌耐藥性和菌群失調(diào)等問(wèn)題，嚴(yán)重影響公眾健康，而且對(duì)生態(tài)環(huán)境會(huì)產(chǎn)生不良影響，已引起全世界的廣泛關(guān)注[4]。因此，開展動(dòng)物性食品抗微生物藥物檢測(cè)具有重要意義，但目前尚未見(jiàn)到甘肅省河西地區(qū)羊肉產(chǎn)品中抗微生物藥物殘留情況的報(bào)道。

肉類食品中抗微生物藥物殘留的檢測(cè)方法有快速檢測(cè)試紙條、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)、高效液相色譜法(high performance liquid chromatography,HPLC)、氣相色譜-質(zhì)譜法(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(liquid chromatograph tandem mass spectrometer,LC-MS/MS)[4-9]等。快速檢測(cè)試紙條兼具檢測(cè)線低、耗時(shí)短、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，有利于跨地區(qū)或在不同環(huán)境中開展檢測(cè)工作，但存在無(wú)法準(zhǔn)確定量的問(wèn)題，適合快速篩選。LC-MS/MS具有檢測(cè)靈敏度高、分離能力強(qiáng)的特點(diǎn)，在實(shí)際工作中作為定量檢測(cè)使用[10-14]。

本研究從甘肅河西地區(qū)采集肉羊主要可食組織樣品，采用獸藥殘留快速檢測(cè)試紙條對(duì)試樣進(jìn)行初步篩查，再用LC-MS/MS對(duì)篩查陽(yáng)性樣品中抗微生物藥物殘留進(jìn)行定量測(cè)定，以明確當(dāng)?shù)匮蛉馐称分锌刮⑸锼幬餁埩舻念悇e和種類，以期為制定抗微生物藥物監(jiān)控措施提供數(shù)據(jù)支撐，為建立羊肉中抗微生物藥物殘留的快速篩選和精準(zhǔn)識(shí)別技術(shù)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 2020年8月下旬從甘肅省酒泉、張掖、武威、金昌4個(gè)市各選取1家羊屠宰企業(yè)，根據(jù)屠宰場(chǎng)規(guī)模及當(dāng)日屠宰量從屠宰線上隨機(jī)采集羊的肌肉(39份)、肝臟(51份)、腎臟(39份)3種可食組織，每份不少于20 g，組織勻漿后裝于清潔自封袋中，置-80 ℃保存。

1.1.2 試劑和藥物標(biāo)準(zhǔn)品 甲酸、甲醇、乙腈為國(guó)產(chǎn)色譜純，檸檬酸、磷酸二氫鈉、乙二胺四乙酸二鈉等試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純；恩諾沙星、環(huán)丙沙星、氧氟沙星、替米考星品、泰樂(lè)菌素、慶大霉素標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98%)，上海Macklin生化科技有限公司產(chǎn)品；獸藥殘留檢測(cè)試紙條，北京勤邦生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 儀器 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(Agilent 1290-6460 LC/MS)、色譜柱:Eclipse Plus C18(粒徑1.8 μm規(guī)格2.1 mm×50 mm)、固相萃取小柱(SPE)，美國(guó)Agilent公司產(chǎn)品；高通量組織研磨儀(SCIENTZ-48)，寧波新芝生物科技股份有限公司產(chǎn)品；高速冷凍離心機(jī)(3-18 ks)，德國(guó)Sigma公司產(chǎn)品；冷凍臺(tái)式真空離心濃縮儀(CVS-3110)，東京理化械株式會(huì)社產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 獸藥殘留檢測(cè)試紙條初篩 將勻漿好的肌肉、肝、腎共129份樣品，每份取2.5 g分別加入樣本提取液，渦旋混勻后離心，取上清液，用獸藥殘留檢測(cè)試紙條進(jìn)行喹諾酮類(11種)、磺胺類(7種)、四環(huán)素類(4種)、大環(huán)內(nèi)酯類(2種)、氨基糖苷類(2種)、β-內(nèi)酰胺類(1種)、氟苯尼考(1種)等7大類28種抗微生物藥物的快速檢測(cè)(表1)和初步篩查，確定陽(yáng)性樣品及殘留藥物類別，再結(jié)合當(dāng)?shù)厝庋蝠B(yǎng)殖防疫常用藥物以確定抗微生物藥物種類。操作方法參考獸藥殘留檢測(cè)試紙條說(shuō)明書。

1.2.2 LC-MS/MS測(cè)定

1.2.2.1 樣品前處理 將獸藥殘留檢測(cè)試紙條初篩檢出抗微生物藥物陽(yáng)性的肌肉、肝、腎樣品進(jìn)行提取及凈化，處理方法按照“食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)”規(guī)定的恩諾沙星、氧氟沙星、環(huán)丙沙星、泰樂(lè)菌素、替米考星、慶大霉素檢測(cè)方法進(jìn)行[16-18]。

表1 初篩藥物類別與藥物名稱

1.2.2.2 測(cè)定條件

(1)液相色譜條件

(a)色譜柱：Agilent Eclipse Plus C18，1.8 μm，2.1 mm×50 mm或相當(dāng)者；(b)進(jìn)樣量：1 μL；(c)流速：0.3 mL/min；(d)柱溫：35 ℃；(e)流動(dòng)相：A：0.1 mmol/L甲酸水溶液；B：甲醇。梯度洗脫條件見(jiàn)表2。

(2)質(zhì)譜條件

(a)離子源:電噴霧離子源;(b)掃描方式:正離子掃描(ESI+);(c)檢測(cè)方式:多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)；(d)離子源溫度：350 ℃；(e)母離子、子離子、碎裂電壓和碰撞氣能量：見(jiàn)表3。

1.2.3 樣品測(cè)定 通過(guò)“1.2.2.1”前處理提取及凈化的樣品經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾后，按照食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法(LC-MS/MS)對(duì)試樣中殘留的抗微生物藥物進(jìn)行測(cè)定。

表2 梯度洗脫條件

表3 母離子、子離子、碎裂電壓和碰撞氣能量

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用Excel對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理并采用無(wú)重復(fù)雙因素方差分析，對(duì)肌肉、肝、腎3種可食組織中檢出的抗微生物藥物的結(jié)果進(jìn)行分析，比較不同種類藥物檢出率之間差異是否顯著；對(duì)4個(gè)市之間檢出的不同種類抗微生物藥物進(jìn)行方差分析，比較檢出藥物種類之間的差異性。

2 結(jié)果

2.1 獸藥殘留檢測(cè)試紙條初篩結(jié)果

2.1.1 抗微生物藥物類別篩查結(jié)果 采用獸藥快速檢測(cè)試紙條對(duì)129份樣品進(jìn)行7大類28種抗微生物藥物殘留初步篩查，結(jié)果表明，57份樣品呈陽(yáng)性，檢出率44.19%(57/129)，39份肌肉、51份肝、39份腎的抗微生物藥物陽(yáng)性樣品數(shù)分別為6、47、4份，檢出率分別為15.38%(6/39)、92.16%(47/51)、10.26%(4/39)，肝臟檢出率高于肌肉和腎臟(表4)。

確定了氨基糖苷類(慶大霉素)、喹諾酮類(恩諾沙星、環(huán)丙沙星、氧氟沙星)以及大環(huán)內(nèi)酯類(泰樂(lè)菌素、替米考星)3類藥物，其中氧氟沙星為不得用于食品動(dòng)物的藥物；未檢出磺胺類、四環(huán)素類、β-內(nèi)酰胺類、氟苯尼考4類藥物。

2.1.2 初篩數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 對(duì)3種可食組織中檢出的抗微生物藥物初篩數(shù)據(jù)進(jìn)行無(wú)重復(fù)雙因素方差分析，結(jié)果顯示，肌肉、肝、腎中3種抗微生物藥物檢出率之間差異顯著(P<0.05)，但大環(huán)內(nèi)酯類、氨基糖苷類、喹諾酮類3類不同類別抗微生物藥物檢出率之間差異不顯著(P>0.05)。

2.2 LC-MS/MS測(cè)定結(jié)果

2.2.1 抗微生物藥物種類檢出結(jié)果 采用LC-MS/MS對(duì)初篩陽(yáng)性的57份樣品中6種抗微生物藥物測(cè)定結(jié)果顯示，6種藥物均有檢出，并檢出了不得用于食品動(dòng)物的氧氟沙星，與初篩的藥物種類和類別一致。恩諾沙星、環(huán)丙沙星、氧氟沙星、慶大霉素、替米考星、泰樂(lè)菌素檢出的樣品份數(shù)分別為3、31、20、29、50、6份，其中替米考星檢出率最高(38.76%)，恩諾沙星最低(2.33%)；6種抗微生物藥物殘留范圍分別為：(0.275 8～0.362 0)、(0.716 9～12.194 2)、(0.250 5～0.517 4)、(131.235 8～135.496 0)、(0.720 1～39.194 9)、(0.258 2～2.069 4)μg/kg(表5)。

恩諾沙星、環(huán)丙沙星、替米考星及泰樂(lè)菌素殘留量均未超過(guò)我國(guó)食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)[19]，樣品合格率達(dá)100%；2份肌肉樣品中慶大霉素殘留量超標(biāo)，合格率為98.45%；20份組織樣品中檢出了禁用藥物氧氟沙星，樣品合格率為86.05%，6種抗微生物藥物檢出數(shù)量及超標(biāo)數(shù)量對(duì)比見(jiàn)圖1。

表4 3種可食組織中抗微生物藥物初篩統(tǒng)計(jì)結(jié)果

表5 LC-MS/MS測(cè)定樣品中抗微生物藥物殘留結(jié)果

A.6種抗微生物藥物檢出數(shù)量；B.6種抗微生物藥物超標(biāo)數(shù)量

2.2.2 抗微生物藥物的LC-MS/MS檢出結(jié)果 采用LC-MS/MS對(duì)初篩抗微生物藥物呈陽(yáng)性的6份肌肉、47份肝、4份腎進(jìn)行6種抗微生物藥物檢測(cè)，結(jié)果顯示，肌肉中檢出氧氟沙星(1/6)、慶大霉素(2/6)和替米考星(3/6)3種藥物，替米考星檢出率最高(50%)，未檢出其他3種藥物；肝中檢出了恩諾沙星(2/47)、環(huán)丙沙星(30/47)、氧氟沙星(17/47)、慶大霉素(26/47)、替米考星(46/47)、泰樂(lè)菌素(6/47)6種藥物，以替米考星檢出率最高(97.87%)；腎中檢出了恩諾沙星(1/4)、環(huán)丙沙星(1/4)、氧氟沙星(2/4)、慶大霉素(1/4)、替米考星(1/4)5種藥物(表6)。

2.2.3 河西4市肉羊產(chǎn)品抗微生物藥物檢出結(jié)果對(duì)比 通過(guò)對(duì)酒泉、張掖、武威、金昌4市肉羊3種可食組織中的大環(huán)內(nèi)酯類、氨基糖苷類和喹諾酮類檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比可見(jiàn)(圖2)，酒泉、張掖、金昌3市肉羊產(chǎn)品以慶大霉素檢出率最高(27.27%、33.33%、16.67%)，武威市肉羊產(chǎn)品則以泰樂(lè)菌素和替米考星檢出最為明顯(33.33%)。

表6 3種可食組織中6種抗微生物藥物檢出情況

圖2 河西4市肉羊樣品抗微生物藥物殘留檢出率

對(duì)河西4市羊肉樣品中恩諾沙星、環(huán)丙沙星、氧氟沙星、慶大霉素、替米考星及泰樂(lè)菌素檢出的殘留數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，結(jié)果顯示，從3種可食組織中檢出的抗微生物藥物殘留量，4市之間差異不顯著(P>0.05)，且6種抗微生物藥物之間差異不顯著(P>0.05)。

2.3 兩種檢測(cè)方法結(jié)果對(duì)比分析

2.3.1 3種組織兩種檢測(cè)方法的吻合率 在肌肉、肝、腎3種組織中，獸藥殘留快速檢測(cè)試紙條篩查結(jié)果與LC-MS/MS檢測(cè)結(jié)果對(duì)比顯示，肌肉和肝中檢出的組織樣品完全吻合，但在2份腎組織中通過(guò)LC-MS/MS未檢出抗微生物藥物殘留(表7)。

2.3.2 4個(gè)市兩種方法檢出陽(yáng)性樣品吻合率 對(duì)4個(gè)市肉羊3種可食樣品通過(guò)獸藥殘留試紙條檢測(cè)與LC-MS/MS檢測(cè)結(jié)果的吻合率對(duì)比可見(jiàn)，酒泉、張掖、武威、金昌樣品經(jīng)兩種檢測(cè)方法吻合率分別達(dá)100%、81.48%、93.75%、90.91%(表8)，說(shuō)明獸藥殘留快速檢測(cè)試條初步篩查結(jié)果可靠。

表7 3種組織中兩種檢測(cè)方法結(jié)果對(duì)比

表8 4市兩種檢測(cè)方法結(jié)果對(duì)比

3 討論

本研究應(yīng)用獸藥殘留快速檢測(cè)試紙條(膠體金標(biāo)檢測(cè)試紙條)對(duì)甘肅省河西4個(gè)市肉羊3種可食組織(肌肉、肝、腎)進(jìn)行7大類28種抗微生物藥物殘留進(jìn)行非靶向初篩，129份樣品共檢出57份陽(yáng)性樣品，包含3大類抗微生物藥物的6種藥物，分別為氨基糖苷類的慶大霉素，氟喹諾酮類的恩諾沙星、環(huán)丙沙星、氧氟沙星，以及大環(huán)內(nèi)酯類的泰樂(lè)菌素和替米考星；這與曹忠君[20]在豬肉中檢出氟喹諾酮類藥物殘留的報(bào)道也相符合，但檢出的具體藥物不同，說(shuō)明在食品動(dòng)物養(yǎng)殖過(guò)程中，喹諾酮類藥物存在濫用或使用不規(guī)范等現(xiàn)象[21]。恩諾沙星、環(huán)丙沙星、氧氟沙星、慶大霉素、替米考星及泰樂(lè)菌素6種抗微生物藥物之間差異不顯著(P>0.05)，說(shuō)明不同種類藥物在臨床不存在特定用藥情況。并且在129份樣品未檢出磺胺類、四環(huán)素類、β-內(nèi)酰胺類、氟苯尼考4大類藥物，28種抗微生物藥物未檢出22種，包括喹諾酮類(8種)、磺胺類(7種)、四環(huán)素類(4種)、氨基糖苷類(1種)、β-內(nèi)酰胺類(1種)、氟苯尼考(1種)。

本研究采用LC-MS/MC對(duì)抗微生物藥物初篩呈陽(yáng)性的肌肉、肝、腎3種組織中6種藥物進(jìn)行定量檢測(cè)，結(jié)果表明初篩57份陽(yáng)性組織樣品含上述6種抗微生物藥物中的一種或多種，其中恩諾沙星、環(huán)丙沙星、替米考星及泰樂(lè)菌素殘留量均未超標(biāo)，但2份肌肉中慶大霉素殘留量超標(biāo)。《中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部公告第2292號(hào)》[22]明確規(guī)定，自2016年12月31日起在食品動(dòng)物中停止使用氧氟沙星，但本研究在22份樣品中檢出了該藥物，說(shuō)明肉羊養(yǎng)殖中仍有非法使用氧氟沙星的現(xiàn)象，這對(duì)肉羊養(yǎng)殖業(yè)和人體健康存在潛在風(fēng)險(xiǎn)。

本研究采用的快速檢測(cè)初篩和LC-MS/MC證實(shí)，肝中抗微生物藥物檢出率高于肌肉和腎，這與肝臟為藥物主要代謝器官有關(guān)[23]。但方差分析結(jié)果顯示，肌肉、肝、腎中不同類別抗微生物藥物檢出率之間差異不顯著(P>0.05)，這可能與藥物的吸收及代謝過(guò)程在體內(nèi)受諸多因素影響有關(guān)。此外，根據(jù)藥物種類以及給藥方式、給藥途徑的不同，其吸收速率、程度也會(huì)有所差異，這也是造成抗微生物藥物在不同組織中殘留量不同、分布不均的原因[24]。

抗微生物藥物初篩檢測(cè)結(jié)果顯示腎中有4份陽(yáng)性樣品，但通過(guò)LC-MS/MS只檢出2份陽(yáng)性樣品，表明除膠體金標(biāo)試紙條存在假陽(yáng)性的因素外，還可能與基質(zhì)效應(yīng)有關(guān)。對(duì)于動(dòng)物性食品而言，樣品前處理技術(shù)在藥物痕量測(cè)定中起到?jīng)Q定作用[25]，對(duì)于提取溶劑、除水劑、凈化過(guò)程中填料的選擇就顯得尤為關(guān)鍵。由于動(dòng)物組織含有大量蛋白質(zhì)和脂肪等物質(zhì)，即使通過(guò)凈化也不能完全達(dá)到理想效果，從而影響化合物在離子源中的離子化，使化合物的響應(yīng)出現(xiàn)增強(qiáng)或抑制，出現(xiàn)基質(zhì)效應(yīng)[26]。而消除基質(zhì)效應(yīng)的方法也比較多，如充分凈化樣品、用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線[27]、用同位素做內(nèi)標(biāo)校正[28]、加入分析保護(hù)劑[29]等。近些年興起的一種快捷經(jīng)濟(jì)高效基質(zhì)分散固相萃取技術(shù)(quick,easy,cheap,effective,rugged,and safe,QuEChERS)相對(duì)于傳統(tǒng)的液液萃取、固相萃取而言，凈化操作流程更加便捷、填料選擇更加靈活[25,30-31]，是未來(lái)高效提取目標(biāo)化合物的理想手段。

通過(guò)對(duì)河西地區(qū)4個(gè)市肉羊3種可食組織中抗微生物藥物殘留檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，酒泉、張掖、金昌3個(gè)市的試樣中以氨基糖苷類的慶大霉素檢出率最高，武威市的試樣則以大環(huán)內(nèi)酯類的泰樂(lè)菌素和替米考星檢出率最高，但4個(gè)市之間差異不顯著(P>0.05)。在臨床上，使用慶大霉素對(duì)于控制和治療由沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希氏菌、巴氏桿菌等細(xì)菌引起的局部或全身感染具有良好效果，如泌尿生殖道、呼吸道、胃腸道等部位感染以及乳腺炎、骨關(guān)節(jié)炎及軟組織感染等[32]。錢坤等[33]在內(nèi)服和皮下注射兩種給藥途徑對(duì)替米考星藥代動(dòng)力學(xué)進(jìn)行研究，結(jié)果表示其吸收均極為迅速，達(dá)峰快，血液中藥物半衰期長(zhǎng)，藥物組織穿透力強(qiáng)，體內(nèi)分布容積大，在組織中藥物濃度高，維持時(shí)間長(zhǎng)，這些特殊的藥動(dòng)學(xué)特性尤其適合于家畜肺炎治療。8月下旬，河西地區(qū)氣候干燥高熱，規(guī)?；B(yǎng)羊場(chǎng)如通風(fēng)不暢、缺水則易引起羊呼吸道疾病和繼發(fā)性感染等，而慶大霉素和替米考星適用于上述病癥，羊在屠宰前若不能嚴(yán)格執(zhí)行停藥期，則極易引起羊可食組織中抗微生物藥物殘留。此外，抗微生物藥物殘留也與各地實(shí)行不同的防疫政策以及防治羊常見(jiàn)病所用藥物基本一致[34]。對(duì)此，筆者建議畜牧獸醫(yī)主管部門加強(qiáng)抗微生物藥物使用監(jiān)管、殘留檢測(cè)，臨床獸醫(yī)和養(yǎng)羊企業(yè)合理規(guī)范使用抗微生物藥物，嚴(yán)格遵守停藥期，禁止使用國(guó)家規(guī)定的禁用藥物；屠宰企業(yè)應(yīng)提高抗微生物藥物殘留檢測(cè)頻率，防止不合格產(chǎn)品流入市場(chǎng)。

對(duì)3類可食組織樣品，采用LC-MS/MS測(cè)定抗微生物藥物殘留結(jié)果與獸藥快速試紙卡初篩結(jié)果篩選出的藥物種類一致，但在檢出的樣品數(shù)量上結(jié)果不全相同。本研究驗(yàn)證結(jié)果表明，快速檢測(cè)試紙條檢測(cè)效果較好，檢測(cè)速度快、耗時(shí)短、使用更方便，可以用于抗微生物藥物的快速和非靶向的調(diào)查、檢測(cè)；羊可食組織存在基質(zhì)背景干擾嚴(yán)重、定性困難、抗微生物藥物在樣品組份殘留含量較低等情況，本試驗(yàn)采用LC-MS/MS[16-18]，可發(fā)揮其靈敏度高、精準(zhǔn)度高、檢測(cè)限低的特點(diǎn)，作為精準(zhǔn)識(shí)別羊肉產(chǎn)品中抗微生物藥物殘留的有力技術(shù)支撐。肉品中抗微生物藥物檢測(cè)方法較多，本研究采用膠體金技術(shù)和LC-MS/MS有機(jī)結(jié)合，應(yīng)用于實(shí)際檢驗(yàn)檢測(cè)工作中，可為肉羊可食組織中抗微生物藥物的快速檢測(cè)及精準(zhǔn)識(shí)別、開展肉品抗微生物藥物殘留的監(jiān)測(cè)奠定基礎(chǔ)，為加強(qiáng)羊肉產(chǎn)品安全檢測(cè)和管理提供科學(xué)數(shù)據(jù)，以保障肉羊產(chǎn)品質(zhì)量安全。