雙黃連可溶性粉對S180荷瘤小鼠腹腔巨噬細胞C3b和Fc受體的影響

陳冠銘，楊麗姿，龐定國，王正書，劉 群*

(1.西南民族大學畜牧獸醫(yī)學院，四川成都 610041；2.四川大學華西公共衛(wèi)生學院，四川成都 610041)

單核-吞噬細胞系統(tǒng)成員分布廣泛，參與機體特異性免疫和非特異性免疫[1]。巨噬細胞表面具有大量受體，其中C3b受體(CR1)和Fc受體(FcR)在巨噬細胞識別、結合、吞噬抗原的過程中發(fā)揮重要作用。C3b受體能與C3補體裂解片段(C3b)特異性結合并介導細胞識別、攝取C3b包被的顆粒和免疫復合物[2-3]。Fc受體能與IgG、IgE、IgA、IgM等抗體的Fc片段特異性結合[4-5]。中藥對巨噬細胞表面的C3b受體和Fc受體活性具有調節(jié)作用，如五味消毒飲作為一種清熱解毒方劑，用于多種疾病的治療，針對小鼠腹腔巨噬細胞可以提升C3b 受體活性[6]；軍用固體運動飲料富含黃芪、人參和紅景天等中藥提取物，可明顯增加C3b受體活性[7]。雙黃連可溶性粉(金銀花∶連翹∶黃芩=1∶2∶1)具有疏風解表、清熱解毒的功效，廣泛應用于外感風熱所致的感冒(癥見發(fā)熱、咳嗽、咽痛)，獸醫(yī)臨床上用于臟腑氣分實熱證、濕熱證和熱毒證的治療，由于病原體的清除與免疫系統(tǒng)關系密切，推測雙黃連可溶性粉可能參與了免疫調節(jié)過程[9-10]。本研究以S180載瘤小鼠為研究對象，腹腔巨噬細胞C3b、Fc受體活性為檢測指標，采用EA、YC-花環(huán)試驗，結合巨噬細胞吞噬雞紅細胞，探討雙黃連可溶性粉對小鼠腹腔巨噬細胞C3b、Fc受體活性的影響，旨在為 雙黃連可溶性粉的使用探索更廣泛的用途，現(xiàn)將研究結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物 雙黃連可溶性粉，由江西仲襄本草生物有限公司提供(批號：1900301)。

1.1.2 實驗動物 SPF昆明小鼠，雌性,6周齡～8周齡,24 g～26 g，成都達碩實驗動物有限公司提供(scxk(川)2015-030)。

1.1.3 瘤細胞 S180腹水瘤細胞，由中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所基礎醫(yī)學細胞中心提供。

1.1.4 主要試劑 黃芪多糖、酵母菌干粉，西南民族大學臨床實驗室提供；環(huán)磷酰胺，山西普德藥業(yè)股份有限公司產(chǎn)品；20 mL/L戊二醛、丙酮、甲醇，成都市科隆化學品有限公司產(chǎn)品；瑞特氏染色液，北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品；HE染色液，上海源葉生物科技有限公司產(chǎn)品； DMEM完全培養(yǎng)基，賽默飛世爾生物化學制品(北京)有限公司產(chǎn)品；PBS、Hanks液，武漢博士德生物工程有限公司產(chǎn)品；100 mL/L新鮮羊紅細胞懸液、雞紅細胞懸液，南京森貝伽生物科技有限公司產(chǎn)品；兔抗羊紅細胞抗體，北京博爾西科技有限公司產(chǎn)品。

1.1.5 主要儀器 壓力蒸汽滅菌器(HVE-50)，德國HIRAYMA公司產(chǎn)品；數(shù)顯恒溫水浴鍋(HWS24)，上海一恒科學儀器有限公司產(chǎn)品；恒溫培養(yǎng)箱(BD-115)，德國BINDER公司產(chǎn)品；微量移液槍，德國Heidolph公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 雙黃連可溶性粉口服液制備 按照生藥濃度，用蒸餾水將雙黃連可溶性粉配制成200%、100%、50%的口服液，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 S180荷瘤小鼠分組及處理 S180腹水瘤細胞懸液，瘤細胞復蘇、傳代，經(jīng)預試驗確定最佳接種濃度1×107cells/mL，0.2 mL/只(肉瘤生長良好并能保證整個試驗過程中(14 d)瘤體不破裂導致死亡)，接種5 d～7 d后，挑選腋下米粒大小瘤體的小鼠，隨機分為荷瘤小鼠組、雙黃連高劑量組、雙黃連中劑量組、雙黃連低劑量組、黃芪多糖組、環(huán)磷酰胺組，另設空白對照組(非荷瘤小鼠)，每組24只。各組處理如下：

荷瘤小鼠組，每日灌胃生理鹽水0.2 mL/只；雙黃連高劑量組，每日灌胃200%雙黃連口服液0.2 mL/只；雙黃連中劑量組，每日灌胃100%雙黃連口服液0.2 mL/只；雙黃連低劑量組，每日灌胃50%雙黃連口服液0.2 mL/只；黃芪多糖組，每日灌胃濃度200 mg/kg的黃芪多糖0.2 mL/只；環(huán)磷酰胺組，每日灌胃濃度20 mg/kg的環(huán)磷酰胺0.2 mL/只；空白對照組，每日灌胃生理鹽水0.2 mL/只。

連續(xù)灌胃14 d。在第4(4 d)、7(7 d)、14(14 d)次灌胃后24 h，每組隨機抽取8只小鼠，腹腔注射5 mL無血清DMEM培養(yǎng)液并輕揉腹部2 min，剖腹收集腹腔巨噬細胞進行C3b、Fc受體活性檢測和吞噬試驗。

1.2.3 Fc受體檢測 采用EA花環(huán)試驗檢測小鼠腹腔巨噬細胞Fc受體活性。單層巨噬細胞載玻片(腹腔巨噬細胞懸液0.5 mL)+EA懸液0.4 mL(100 mL/L新鮮羊紅細胞懸液+等量兔抗羊紅細胞抗體(1∶1 000稀釋))，37 ℃溫育1 h，沖洗以除去非黏附的巨噬細胞和雜質，瑞特氏染色，鏡檢，計數(shù)200個巨噬細胞，計算EA花環(huán)形成率。

1.2.4 C3b受體檢測 采用YC花環(huán)試驗檢測小鼠腹腔巨噬細胞C3b受體活性。單層巨噬細胞載玻片(腹腔巨噬細胞懸液0.5 mL)+YC懸液0.4 mL(小鼠血清(1∶20比例稀釋)+酵母菌5 mg/mL)，37 ℃溫育1 h，沖洗以除去非黏附的巨噬細胞和酵母菌顆粒，H-E染色，鏡檢，計數(shù)200個巨噬細胞，計算YC花環(huán)形成率。

1.2.5 吞噬活性檢測 采用巨噬細胞吞噬雞紅細胞試驗檢測小鼠腹腔巨噬細胞吞噬活性。單層巨噬細胞載玻片(腹腔巨噬細胞懸液0.5 mL)+雞紅細胞懸液0.4 mL(1.25×107/mL)，37 ℃溫育30 min，沖洗以除去非黏附的巨噬細胞和紅細胞，瑞特氏染色，鏡檢，計數(shù)200個巨噬細胞，計算吞噬百分率和吞噬指數(shù)。

2 結果

2.1 鏡檢結果

巨噬細胞EA花環(huán)、YC花環(huán)見圖1和圖2。

紫色：巨噬細胞；粉紅色：致敏綿羊紅細胞

不規(guī)則：巨噬細胞;長桿狀：致敏性酵母菌

2.2 Fc受體活性

各組小鼠在不同檢測時間點的EA花環(huán)率見表1和表2。

表1顯示，各檢測時間點(4、7、14 d)荷瘤小鼠組的EA花環(huán)率與空白組比較差異不顯著(P>0.05)；黃芪多糖組的EA花環(huán)率極顯著高于空白組和荷瘤小鼠組(P<0.01)；環(huán)磷酰胺組的EA花環(huán)率與空白組和荷瘤小鼠組相當(P>0.05)；3個受試劑量藥物組的EA花環(huán)率均極顯著高于空白組、荷瘤小鼠組和環(huán)磷酰胺組(P<0.01)，并與黃芪多糖組相當(P>0.05)，3個受試劑量藥物組間雖然差異不顯著，但隨著劑量濃度的增加，EA花環(huán)率的絕對平均值呈上升趨勢。

表2顯示，隨著給藥次數(shù)的增加(4 d～14 d)，3個受試劑量藥物組和黃芪多糖組的EA花環(huán)率呈上升趨勢，其中低劑量組在給藥14 d之后，花環(huán)率顯著高于4 d給藥時(P<0.05)。結果表明，接種S180瘤細胞，荷瘤小鼠腹腔巨噬細胞Fc受體活性不受影響；免疫抑制劑環(huán)磷酰胺對小鼠腹腔巨噬細胞Fc受體活性無影響；連續(xù)給予4 d～14 d不同劑量的雙黃連口服液(生藥濃度50%～200%)，荷瘤小鼠腹腔巨噬細胞Fc受體活性增強，作用與黃芪多糖相當。

2.3 C3b受體活性

各組小鼠在不同檢測時間點的YC花環(huán)率見表3和表4。表3顯示，各檢測時間點(4、7、14 d)荷瘤小鼠組的YC花環(huán)率與空白組比較無顯著差異(P>0.05)；黃芪多糖組的YC花環(huán)率顯著高于空白組和荷瘤小鼠組(P<0.01)；環(huán)磷酰胺組的YC花環(huán)率明顯低于空白組和荷瘤小鼠組(P<0.05)；3個受試劑量藥物組的YC花環(huán)率均極顯著高于空白組、荷瘤小鼠組和環(huán)磷酰胺組(P<0.01)并與黃芪多糖組相當(P>0.05)，但組間差異不顯著。

表4顯示，隨著給藥次數(shù)的增加(4 d～14 d)，3個受試劑量藥物組和黃芪多糖組的YC花環(huán)率變化不大，差異不顯著。結果表明，接種S180瘤細胞，荷瘤小鼠腹腔巨噬細胞C3b受體活性不受影響；免疫抑制劑環(huán)磷酰胺具有降低小鼠腹腔巨噬細胞C3b受體活性的作用；連續(xù)給予4 d～14 d不同劑量的雙黃連口服液(生藥濃度50%～200%)，荷瘤小鼠腹腔巨噬細胞C3b受體活性增強，作用與黃芪多糖相當。

表1 EA-花環(huán)率組間比較

表2 EA-花環(huán)率組內(nèi)比較

表3 YC-花環(huán)率組間比較

表4 YC-花環(huán)率組內(nèi)比較

綜合EA、YC花環(huán)試驗結果，接種S180瘤細胞，荷瘤小鼠腹腔巨噬細胞Fc、C3b受體活性不受影響；免疫抑制劑環(huán)磷酰胺具有降低C3b受體活性的作用(對Fc受體活性沒有影響)；黃芪多糖對Fc、C3b受體活性具有增強作用；連續(xù)給予4 d～14 d不同劑量的雙黃連口服液(生藥濃度50%～200%)，荷瘤小鼠腹腔巨噬細胞Fc、C3b受體活性增強。

2.4 吞噬活性

各組小鼠在不同時間點巨噬細胞吞噬活性(吞噬百分率、吞噬指數(shù))見表5和表6。

表5顯示，各檢測時間點(4、7、14 d)荷瘤小鼠組腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞的吞噬百分率與空白組比較無顯著差異(P>0.05)；黃芪多糖組的吞噬百分率高于空白組和荷瘤小鼠組(4 d、P<0.01，7 d、P<0.05，14 d、P>0.05)；環(huán)磷酰胺組的吞噬百分率與空白組和荷瘤小鼠組相當(P>0.05)；3個受試劑量藥物組中，低劑量組的吞噬百分率高于空白組、荷瘤小鼠組和環(huán)磷酰胺組(4 d、P<0.01，7 d、P<0.05，14 d、P>0.05)，中劑量組的吞噬百分率高于空白組、荷瘤小鼠組和環(huán)磷酰胺組(4 d、P<0.01，7 d、P<0.01，14 d、P<0.01)，高劑量組的吞噬百分率高于空白組、荷瘤小鼠組和環(huán)磷酰胺組(4 d、P<0.01，7 d、P<0.01，14 d、P>0.05)，中、高劑量組在連續(xù)給藥7 d～14 d的吞噬百分率高于黃芪多糖組(P<0.05)。

各檢測時間點(4、7、14 d)荷瘤小鼠組腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞的吞噬指數(shù)與空白組比較無顯著差異(P>0.05)；黃芪多糖組的吞噬指數(shù)極顯著高于空白組和荷瘤小鼠組(P<0.01)；環(huán)磷酰胺組的吞噬指數(shù)與空白組和荷瘤小鼠組相當(P>0.05)；3個受試劑量藥物組中，低劑量藥物組的吞噬指數(shù)，在4、7 d兩個時間點高于空白組、荷瘤小鼠組和環(huán)磷酰胺組(P<0.01、P<0.05)，中劑量組吞噬指數(shù)在4、7、14 d這3個時間點高于空白組、荷瘤小鼠組和環(huán)磷酰胺組(P<0.01、P<0.01、P<0.01)，高劑量組吞噬指數(shù)在4、7、14 d這3個時間點高于空白組、荷瘤小鼠組和環(huán)磷酰胺組(P<0.01、P<0.01、P<0.05)，中、高劑量組的吞噬指數(shù)在連續(xù)給藥7 d～14 d高于黃芪多糖組(P<0.01、P<0.05)。

表6顯示，隨著給藥次數(shù)的增加(4 d～14 d)，3個受試劑量藥物組吞噬百分率的呈上升下降趨勢，7 d高于4 d和14 d，其余各組變化不大，差異不顯著。結果表明，接種S180瘤細胞，荷瘤小鼠腹腔巨噬細胞吞噬活性不受影響；免疫抑制劑環(huán)磷酰胺對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬活性無顯著影響；連續(xù)給予4 d～14 d不同劑量的雙黃連口服液(生藥濃度50%～200%)，荷瘤小鼠腹腔巨噬細胞吞噬活性增強，作用優(yōu)于或與黃芪多糖相當。

隨著給藥次數(shù)的增加(4 d～14 d)，荷瘤小鼠組、黃芪多糖組的吞噬指數(shù)呈下降趨勢，環(huán)磷酰胺組的吞噬指數(shù)變化不大，3個受試劑量藥物組吞噬指數(shù)呈上升下降趨勢，7 d高于4 d和14 d。結果表明，接種S180瘤細胞，荷瘤小鼠腹腔巨噬細胞吞噬能力不受影響；免疫抑制劑環(huán)磷酰胺對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬能力無顯著影響；連續(xù)給予4 d～14 d不同劑量的雙黃連口服液(生藥濃度50%～200%)，荷瘤小鼠腹腔巨噬細胞吞噬能力增強，作用與黃芪多糖相當。

表5 吞噬百分率和吞噬指數(shù)組間比較

表6 吞噬百分率和吞噬指數(shù)組內(nèi)比較

綜合吞噬百分率和吞噬指數(shù)，接種S180瘤細胞，荷瘤小鼠腹腔巨噬細胞吞噬活性和吞噬能力不受影響；免疫抑制劑環(huán)磷酰胺對巨噬細胞吞噬活性和吞噬能力無顯著影響；連續(xù)給予4 d～14 d不同劑量的雙黃連口服液(生藥濃度50%～200%)，荷瘤小鼠腹腔巨噬細胞吞噬活性和吞噬能力增強，作用優(yōu)于或相當于黃芪多糖。

3 討論

巨噬細胞作為免疫系統(tǒng)的重要成員，在組織中起著重要免疫作用，不僅具有抗感染、抗炎癥和抗腫瘤等免疫功能，還能在組織穩(wěn)態(tài)中調節(jié)淋巴管、血管的生成[11]。巨噬細胞C3b、Fc受體參與巨噬細胞發(fā)揮功能，其活性高低代表巨噬細胞功能狀態(tài)(吞噬、分泌等功能)，C3b、Fc受體對巨噬細胞功能具有調節(jié)作用，輔助巨噬細胞吞噬，促進對與免疫球蛋白和補體蛋白相結合的顆粒的攝取，在溶酶體中被消化和破壞[12-13]。C3b受體能與補體免疫復合物(IC)結合，在清除循環(huán)IC中發(fā)揮重要作用。這種受體對于防止IC的積累是至關重要的，IC的積累會導致炎癥病理。在一定條件下也能促進C3b調理過的顆粒被巨噬細胞吞噬[14]。Fc受體的主要功能是介導巨噬細胞吞噬活動中的特異性吞噬，當Fc受體與抗體的Fc片段結合后，能激活抗體依賴性細胞介導的細胞毒性作用；當巨噬細胞Fc受體失衡時會導致多種自身免疫性疾病，如免疫性血小板減少癥 (ITP)、系統(tǒng)性紅斑狼瘡[15-18]等。C3b、Fc受體的結構不同，C3b受體與配體結合需要二價陽離子的參與，其生物學活性會受到胰蛋白酶的破壞，需要巨噬細胞活化后才可以介導細胞吞噬，而Fc受體則不會被影響，不需要二價陽離子的參與就能與配體結合并能介導其吞噬作用[2]。關于巨噬細胞C3b、Fc受體活性檢測方法，目前主要采用EA-花環(huán)、YC-花環(huán)試驗，所謂EA-花環(huán)試驗是將巨噬細胞Fc受體與相應抗體致敏的紅細胞(EA)混合，當5個及以上的EA吸附在巨噬細胞上時會形成以巨噬細胞為中心，周圍為紅細胞的類似花環(huán)的形狀，花環(huán)率的高低代表Fc受體的活性；所謂YC-花環(huán)試驗是將巨噬細胞C3b受體與補體致敏的酵母菌(YC)混合，酵母菌被吸附在巨噬細胞上形成以巨噬細胞為中心，周圍為酵母菌的類似花環(huán)的形狀，花環(huán)率的大小代表C3b受體的活性[5]。

本研究以S180載瘤小鼠為模式動物，腹腔巨噬細胞為研究對象，C3b、Fc受體活性為檢測指標，EA花環(huán)、YC花環(huán)試驗為研究手段，結合巨噬細胞吞噬雞紅細胞，探討雙黃連可溶性粉對巨噬細胞免疫功能的影響，結果表明，小鼠接種S180瘤細胞，荷瘤小鼠腹腔巨噬細胞Fc、C3b受體活性不受影響，免疫抑制劑環(huán)磷酰胺具有降低C3b受體活性的作用(對Fc受體活性沒有影響)，連續(xù)給予4 d～14 d不同劑量的雙黃連可溶性粉，荷瘤小鼠腹腔巨噬細胞Fc、C3b受體活性增強，吞噬能力增強，作用優(yōu)于或相當于黃芪多糖，研究結果為雙黃連可溶性粉臨床使用的研究提供科學依據(jù)。