單核細胞增生李斯特菌新型轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子lmo2486的分子特征及原核表達研究

朱孝珍，劉昱誠，張星星，王立霞，季春輝，郭 蘊，才學(xué)鵬，孟慶玲，喬 軍*

(1.石河子大學(xué)動物科技學(xué)院，新疆石河子 832003； 2 .新疆農(nóng)墾科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，新疆石河子 832003；3.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所，甘肅蘭州 730046)

單核細胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes，LM)是一種兼性胞內(nèi)寄生菌，該菌可引發(fā)人和多種動物的李斯特菌病，盡管李斯特菌病病例較少，但其病死率很高，被認為是引起公共衛(wèi)生問題的主要病原菌[1]。成年人的常見癥狀為頭痛、胃痛、發(fā)熱、腹瀉和嘔吐，但在高危人群，比如孕婦、嬰兒、老人和艾滋病、癌癥患者中可能會出現(xiàn)嚴重癥狀，如腦膜炎、敗血癥、流產(chǎn)甚至新生兒死亡[1-4],對于人致死率高達20%～30%[5]。在土壤、動物飼料、水以及哺乳動物和鳥類的糞便中都能發(fā)現(xiàn)單核細胞增生性李斯特菌，該菌能通過污染各種肉類和蔬菜、乳制品和即食食品從而導(dǎo)致李斯特菌病暴發(fā)[1]。此外，該菌可在高鹽、低溫、酸堿、高壓和其他極端條件下存活[6-7]，有較強的環(huán)境適應(yīng)性[8-9]。

LM感染、胞內(nèi)生存和毒力受多種分子的調(diào)控，這些分子組成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)?，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，含有PspC結(jié)構(gòu)域(噬菌體休克蛋白C)蛋白家族，廣泛存在于多種病原微生物中。PspC蛋白是一種重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，可參與細菌的應(yīng)激反應(yīng)系統(tǒng)及毒力相關(guān)基因的表達調(diào)控，可能與應(yīng)激反應(yīng)以及維持細菌細胞包膜的完整性密切相關(guān)[10]。然而，目前有關(guān)LM PspC家族成員的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白Lmo2486的生物學(xué)功能尚不明確。前期的生物學(xué)信息分析表明，Lmo2486蛋白具有PspC結(jié)構(gòu)域。PspC結(jié)構(gòu)域被認為是應(yīng)激反應(yīng)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，可能與LM多個基因的表達調(diào)控密切相關(guān)[11-12]。同時，Lmo2486蛋白含有DUF4097結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域為細菌黏附的可能結(jié)構(gòu)元件。然而，lmo2486具體的生物學(xué)功能尚未深入研究。

為了進一步探究lmo2486基因的生物學(xué)功能功能，本研究對LM-SB5綿羊野毒株進行l(wèi)mo2486基因克隆，對編碼蛋白的結(jié)構(gòu)進行分子特征分析，并進行了其遺傳進化特征和表達研究，為揭示lmo2486在LM中對環(huán)境耐受和毒力的調(diào)控作用提供前期的研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、培養(yǎng)基及試劑 LM-SB5新疆野毒株，由石河子大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)實驗室從發(fā)病綿羊體內(nèi)分離，鑒定后保存。大腸埃希氏菌(E.coli) 感受態(tài)細胞DH5α，由石河子大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)實驗室保存。

1.1.2 培養(yǎng)基及試劑 腦心浸液培養(yǎng)基(BHI)，青島高科技園海博生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；DNA標準DL 2 000、pMD19-T(simple)載體，TaKaRa公司產(chǎn)品；細菌DNA提取試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒，諾維贊生物公司產(chǎn)品；T4 DNA連接酶、限制性核酸內(nèi)切酶HindⅢ、BamHⅠ、蛋白Marker，TaKaRa公司產(chǎn)品；IPTG，索萊寶公司產(chǎn)品；Trans8K DNA Marker、Transetta(DE3)，北京全式金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 儀器設(shè)備 超凈操作臺，BOXUN公司產(chǎn)品；恒溫水浴鍋(XMTD-8222)、隔水式恒溫培養(yǎng)箱(DNP-9082)，上海精宏實驗設(shè)備有限公司產(chǎn)品；移液器(2.5 μL、10 μL、20 μL、100 μL、200 μL、1 000 μL、5 L)，Eppendorf公司產(chǎn)品；高壓蒸汽滅菌鍋(HVE-50)，Hirayama公司產(chǎn)品；普通恒溫培養(yǎng)箱(8000DH)、全自動酶標儀(Muitiskan GO)、高速冷凍離心機(Multifuge X1R)，Thermo Fisher公司產(chǎn)品；PCR儀、凝膠成像儀、轉(zhuǎn)膜儀，Bio-Rad公司產(chǎn)品；電子天平(TP-213)，丹佛儀器(北京)有限公司產(chǎn)品；電泳槽(Power Wave XS2)，北京君意東方電泳設(shè)備有限公司產(chǎn)品；電泳儀(DYY-2C)、SDS-PAGE凝膠電泳儀(DYY-6C)，北京六一生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計與合成 根據(jù)GenBank登錄的lmo2486基因序列(登錄號：CP023861.1)，設(shè)計擴增lmo2486基因特異性引物，上游引物lmo2486F：5′-ACAGACACCGGCAATAT-3′，下游引物lmo2486R：5′-CCGAATGCAGCTGATTCT-3′。由DNA Start軟件分析的蛋白抗原表位集中區(qū)35～390，設(shè)計擴增lmo2486抗原集中區(qū)的特異性引物，32a1：CGGATCCATTTATATTATCATCACCAT，32a2：CCAAGCTTAATTCCATTTCCTACTTT，在引物32a1/2的5′端分別添加BamHⅠ和HindⅢ保護性堿基及限制性酶切位點(斜體及下劃線部分)。送往北京華大基因公司合成。

1.2.2 LMlmo2486基因的克隆及測序 挑取LM-SB5單菌落于BHI培養(yǎng)基中，置于37 ℃振蕩培養(yǎng)14 h～16 h，按照細菌基因組DNA提取試劑盒的說明書提取LM-SB5分離株基因DNA，以該DNA為模板，以設(shè)計的lmo2486基因特異性上、下游引物lmo2486F/R擴增lmo2486基因，PCR的反應(yīng)體系為：PCR Mixture 10 μL，H2O 7 μL，上、下游引物各0.5 μL，DNA模板2 μL。 反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min 30 s，72 ℃ 10 min，共30個循環(huán)；4 ℃保存。將PCR產(chǎn)物用10 g/L瓊脂糖凝膠在0.5×TBE電泳緩沖液中進行電泳，與DNA標準DL 2 000相比，將目的片段用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收純化?；厥蘸蟮哪康钠蝜mo2486基因與pMD19-T(simple)載體4 ℃過夜連接，然后轉(zhuǎn)化到E.coliDH5α感受態(tài)細胞內(nèi)，通過菌液PCR篩選陽性轉(zhuǎn)化子，將陽性克隆送至華大基因生物公司測序。

1.2.3lmo2486基因編碼蛋白質(zhì)的生物信息學(xué)分析 通過Motif Scan在線軟件分析糖基化位點、磷酸化位點等。利用在線軟件ProtParam預(yù)測Lmo2486蛋白的理論分子質(zhì)量及等電點；通過Protscale分析蛋白質(zhì)的親水性、疏水性；通過SignalP進行蛋白質(zhì)的信號肽預(yù)測；利用軟件SOPMA預(yù)測Lmo2486蛋白的二級結(jié)構(gòu)；應(yīng)用SWISS-MODEL預(yù)測蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)；使用DNA Star預(yù)測蛋白的抗原表位集中區(qū)域；利用SMART預(yù)測并分析蛋白的結(jié)構(gòu)域。

1.2.4lmo2486基因核苷酸序列遺傳進化分析 將LM-SB5lmo2486基因與GenBank中公布的LM不同的菌株和PspC家族和DUF4097家族其他種屬細菌的基因核苷酸序列進行同源對比，應(yīng)用MEGA5.0軟件對lmo2486基因核苷酸序列進行遺傳進化分析，并采用鄰接法(Neighbor-Joining,NJ)構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

1.2.5 重組載體pET-32a(+)-lmo2486K構(gòu)建 用引物32a1/2擴增lmo2486基因抗原表位集中區(qū)的片段并命名為lmo2486K，構(gòu)建pMD19-T-lmo2486K，轉(zhuǎn)化至DH5α中，篩選陽性克隆，用BamHⅠ和HindⅢ內(nèi)切酶同時雙酶切pMD19-T-lmo2486K重組質(zhì)粒和pET-32a(+)載體質(zhì)粒并將其回收，然后使用T4連接酶將pMD19-T-lmo2486K重組質(zhì)粒和pET-32a(+)載體4 ℃過夜連接，轉(zhuǎn)化至DE3中，進行菌液PCR和雙酶切鑒定，將驗證正確的質(zhì)粒命名為pET-32a(+)-lmo2486K。

1.2.6 Lmo2486K的誘導(dǎo)表達及重組蛋白鑒定 將pET-32a(+)-lmo2486K重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)入DE3感受態(tài)細胞內(nèi)，使用IPTG誘導(dǎo)蛋白表達，然后用120 g/L的SDS-PAGE驗證蛋白的表達情況。同時，以小鼠抗His單克隆抗體為一抗，帶有His標簽的山羊抗鼠IgG為二抗，進行Western blot分析，鑒定表達的重組蛋白。

2 結(jié)果

2.1 lmo2486基因的擴增、克隆及測序

用特異性引物PCR擴增lmo2486基因，產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測得到1 212 bp的目的條帶(圖1)。膠回收與pMD19-T(simple)載體連接，轉(zhuǎn)化到DH5α后通過菌液PCR篩選陽性轉(zhuǎn)化子(圖2)，進行測序分析，結(jié)果顯示該基因序列與GenBank中公布的序列一致。

2.2 lmo2486基因核苷酸及其編碼氨基酸序列分析

由GenBank中提供的序列可知，LM-SB5lmo2486基因全長1 212 bp，編碼403個氨基酸。lmo2486蛋白含3個N-糖基化位點(137-140、201-204、317-320)，1個cAMP和cGMP依賴性蛋白激酶磷酸化位點(277-280)，10個酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(8-11、65-68、66-69、193-196、206-209、241-244、279-282、321-324、348-351、396-399)，7個蛋白激酶C磷酸化位點(43-45、139-141、144-146、176-178、261-263、288-290、348-350)，5個N-豆蔻?；稽c(15-20、16-21、26-31、297-302、344-349)(圖3)。

M.DNA標準DL 2 000;1.陽性對照；2～4.菌液PCR的產(chǎn)物

3個N-糖基化位點(陰影部分)，1個cAMP和cGMP依賴性蛋白激酶磷酸化位點(加粗部分)，10個酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(下劃線)，7個蛋白激酶C磷酸化位點(雙下劃線)，5個N-豆蔻?；稽c(方框)

2.3 Lmo2486蛋白的分子結(jié)構(gòu)特征分析

通過在線軟件分析表明，Lmo2486蛋白分子質(zhì)量為64.6 ku，屬于親水性蛋白。利用在線軟件SOPMA分析可知，Lmo2486蛋白主要由α-螺旋和無規(guī)則卷曲構(gòu)成(圖4A)。在線軟件TMHMM Server v.2.0分析Lmo2486蛋白形成一個跨膜區(qū)(34-56)。SignalP 4.1 分析表明，該蛋白無信號肽。SWISS-MODEL預(yù)測該蛋白可形成桶狀的三級結(jié)構(gòu)(圖4B)。SMART預(yù)測并分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白質(zhì)具有PspC 蛋白域(3-63)和DUF4097 蛋白域(140-361)(圖4C)。

A.Lmo2486二級結(jié)構(gòu)；B.Lmo2486三級結(jié)構(gòu)；C.Lmo2486含有的主要結(jié)構(gòu)域(PspC蛋白域位置：3～63，跨膜區(qū)：34～56，盤繞區(qū)：68～98，DUF4097蛋白域位置：140～361)

2.4 lmo2486基因序列的系統(tǒng)進化分析

將LM-SB5lmo2486核苷酸序列與LM不同分離株核苷酸序列以及同為PspC家族和DUF4097家族的不同菌種的基因進行同源性比對，結(jié)果顯示，LM-SB5的lmo2486核苷酸序列與LM3株、02-6680株(4b型)、SLCC2378株(4e型)、ATCC 19117株(4d型)株、ICDC-LM188株、1/2b 10-0811株屬于同一分支，與標準株EGD-e株的親緣關(guān)系較近。與大腸埃希氏菌、阿爾多耶爾森氏菌( NZ-CP009781.1)、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌株IP26014、亞歷山大耶爾森氏菌株(NZ-CGBL01000009.1 )及馬桑耶爾森氏菌株CCUG 53443屬于不同分支，親緣關(guān)系較遠(圖5)，表明lmo2486基因在LM中高度保守。

2.5 lmo2486表達載體pET-32a(+)-lmo2486K的鑒定

lmo2486抗原集中區(qū)片段長度為1 074 bp。將pMD19-T-lmo2486K雙酶切，得到2 692 bp和1 074 bp大小的條帶(圖6)。重組質(zhì)粒pET-32a(+)-lmo2486K雙酶切得到5 900 bp的載體條帶和1 074 bp的目的條帶(圖7)，表示成功構(gòu)建了pET-32a(+)-lmo2486K重組質(zhì)粒。

2.6 pET-32a(+)-lmo2486K重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)及蛋白的表達

將pET-32a(+)-lmo2486K轉(zhuǎn)化至DE3感受態(tài)中，使用IPTG在16 ℃中振蕩誘導(dǎo)Lmo2486的抗原集中區(qū)蛋白表達，經(jīng)120 g/L SDS-PAGE檢測出該重組蛋白的分子質(zhì)量約是64.6 ku(圖8)，并在20 h～24 h時表達量較多。Western blot以鼠抗His單克隆抗體為一抗，帶有His標簽的山羊抗兔IgG為二抗，在64.6 ku處有特異性反應(yīng)條帶(圖8)，與預(yù)期值相符，分析lmo2486基因有著一定的反應(yīng)原性，Lmo2486抗原集中區(qū)重組蛋白在大腸埃希氏菌BL21(DE3)中表達成功。

圖5 基于lmo2486基因核苷酸序列進行系統(tǒng)進化分析(NJ法)

M.DNA標準DL 8 000;1～2.pMD19-T-lmo2486K雙酶切產(chǎn)物

M.DNA標準DL 8 000;1～5.pET-32a(+)-lmo2486K雙酶切產(chǎn)物

3 討論

LM是一種食源性胞內(nèi)寄生的革蘭氏陽性菌，也是李斯特菌屬中致病力最強的細菌，可感染人和動物，并突破機體的血腦及血胎等生理屏障，引起腦膜炎和流產(chǎn)等多種疾病[13]。LM擁有復(fù)雜的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)，其中包括LM毒力因子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控和對環(huán)境應(yīng)激耐受力的調(diào)節(jié)等，其中pfrA是許多毒力基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，sigB可調(diào)控多種環(huán)境應(yīng)激相關(guān)基因的表達，在LM應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮著重要的功能[14-17]。LMlmo2486基因是一種含有PspC結(jié)構(gòu)域的新型轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，可能參與LM在致病力和環(huán)境應(yīng)激時的轉(zhuǎn)錄調(diào)控過程。同時，該蛋白DUF4097結(jié)構(gòu)域是構(gòu)成細菌黏附素的重要元件，可能參與LM黏附宿主細胞的過程，推測與細菌毒力密切相關(guān)。然而，目前對LMlmo2486的研究較少，至今其生物學(xué)功能尚不清楚。

M.蛋白分子質(zhì)量標準；1.蛋白上清液；2.pET-32a(+)空載體；3～9.IPTG誘導(dǎo)Lmo2486K蛋白0、4、8、12、16、20、24 h的表達產(chǎn)物；10.重組蛋白 pET-32a(+)-lmo2486K

PspC家族蛋白是一類應(yīng)激反應(yīng)調(diào)節(jié)因子，廣泛存在于在革蘭氏陰性腸桿菌科大腸埃希氏菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌、腸炎沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌中，主要參與細菌的應(yīng)激反應(yīng)和毒力的調(diào)節(jié)。目前研究發(fā)現(xiàn)，細菌的存活取決于它們感知和響應(yīng)細胞包膜紊亂的能力。噬菌體休克蛋白(Psp)系統(tǒng)在包膜應(yīng)激反應(yīng)中起關(guān)鍵作用。在大腸埃希氏菌中，PspC家族蛋白參與應(yīng)激反應(yīng)系統(tǒng)以維持細菌細胞膜的完整性和功能[10,18]。PspC和PspB是兩種細胞質(zhì)膜蛋白，可以形成整合復(fù)合物，在小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌和大腸埃希氏菌中作為Psp反應(yīng)的感覺激活劑[19-20]。在乳酸乳球菌中，YthA蛋白是PspC家族的應(yīng)激反應(yīng)性轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，在氨基酸生物合成、嘧啶代謝和胞外多糖的生物合成中發(fā)揮了調(diào)控作用，同時YthA有助于耐酸性[18]。在小腸結(jié)腸炎桿菌中，小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌的Psp系統(tǒng)對毒力至關(guān)重要，PspC 缺失突變后毒力顯著降低[19,21-22]，其生長也明顯比野生型慢[21,23-24]?；魜y弧菌的Psp反應(yīng)在壓力源存在的情況下，內(nèi)膜蛋白PspC可參與感知損傷[25]。PspC在肺炎球菌菌臨床分離株中普遍存在，且PspC蛋白可以保護小鼠免受致命肺炎鏈球菌的攻擊[26]。

本研究成功克隆了lmo2486基因并對其編碼的蛋白進行了分子特征分析，發(fā)現(xiàn)其含有PspC結(jié)構(gòu)域和DUF4097結(jié)構(gòu)域。系統(tǒng)進化分析發(fā)現(xiàn)，該基因在LM中具有高度保守性。在此基礎(chǔ)上，通過SDS-PAGE和Western blot證實重組蛋白Lmo2486K具有一定的反應(yīng)原性，為揭示LMlmo2486對LM在環(huán)境應(yīng)激和致病力調(diào)控作用奠定了前期的研究基礎(chǔ)。