聚3，4乙烯二氧噻吩修飾的新型碳納米管纖維電極及其電化學(xué)性能評價*

楊宇熹 高中寶 曹 振 李斯偉 張 笑 劉 偉 朱 穎 周 瑾

（軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院軍事認知與腦科學(xué)研究所，北京 100850）

植入式電極已經(jīng)成為神經(jīng)科學(xué)研究和醫(yī)療應(yīng)用的重要工具，這些可植入的微電極通過采集或誘發(fā)神經(jīng)元活動，實現(xiàn)了外部設(shè)備和神經(jīng)系統(tǒng)之間的通信［1-3］。建立穩(wěn)定高效的腦機接口連接保證了神經(jīng)接口設(shè)備的可靠性，這依賴于與神經(jīng)組織接觸的植入式電極，與皮層腦電圖（electrocorticography，ECoG）和頭皮腦電圖（electroencephalogram，EEG）等非穿透性表面電極信號采集相比，植入式電極檢測的信號受到的干擾遠小于其他記錄方式，其電極和目標(biāo)神經(jīng)組織之間的距離更近，具有更高的空間和時間分辨率［4-8］。在過去的幾十年里，已經(jīng)開發(fā)了各種類型的侵入式微電極，如最早用于神經(jīng)記錄的使用金屬線制作的微電極和以Utah電極為代表的硅基電極［3，9-10］。金屬或硅基微電極在腦機接口研究中都得到了很好的使用，但它們在植入后的壽命有限，這限制了它們的長期使用和臨床應(yīng)用［11-12］。金屬或硅基微電極失效的原因主要由兩方面原因造成。第一，電極的植入會引發(fā)移植部位的損傷，導(dǎo)致宿主體內(nèi)的組織炎癥反應(yīng)，且這種炎癥反應(yīng)會因為電極和周圍組織之間的化學(xué)和物理特性不匹配而持續(xù)存在［13］。組織炎癥反應(yīng)導(dǎo)致神經(jīng)元死亡和形成膠質(zhì)疤痕，進一步造成電極特性的改變，從而降低了神經(jīng)信號采集的信噪比。第二，金屬或硅基微電極的使用壽命受到材料不穩(wěn)定性的影響，例如，電極部位的腐蝕以及電極材料的降解導(dǎo)致電極性能不能長期穩(wěn)定保持［13-15］。

微纖維電極已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于替代現(xiàn)有的金屬或硅基微電極，它們大多由碳基材料制成，如碳纖維（carbon fibers，CFs）、碳 納 米 管（carbon nanotubes，CNTs）和石墨烯［14］。這些柔軟的碳基微纖維電極具有優(yōu)良的化學(xué)和機械穩(wěn)定性，有助于提高電極的使用壽命和功能，可以彌補其他電極面臨的諸多問題［10］。已經(jīng)有研究表明，由于這些碳基微纖維電極只有微米級別的尺寸，與周圍組織的順應(yīng)性更好，組織炎癥反應(yīng)較小，因此碳基微纖維電極非常適用于長時間神經(jīng)信號記錄。其中，具有小截面的CFs電極已被廣泛應(yīng)用于顱內(nèi)檢測多巴胺和血清素等神經(jīng)遞質(zhì)。CNTs電極由于其出色的生物相容性、機械及化學(xué)特性、大的有效表面積和高導(dǎo)電性，已被用作神經(jīng)接口的電極材料［10，16］。盡管微纖維電極適用于長時間神經(jīng)信號記錄，但通常需要額外的涂層來改善其用于神經(jīng)信號記錄的能力，這些涂層可以減小電化學(xué)阻抗，提高電極的記錄質(zhì)量［10，17］。已開發(fā)的涂層材料包括導(dǎo)電聚合物、氧化銥等材料，其中，導(dǎo)電聚合物是CFs電極最廣泛使用的涂層材料［10，15，18-20］。已經(jīng)有研究表明，通過電鍍法沉積聚3,4-乙烯二氧噻吩（poly（3,4-ethylenedioxythiophene），PEDOT）等聚合物覆蓋碳纖維電極，可以使電極具有楊氏模量小、電導(dǎo)率高和電化學(xué)阻抗低等優(yōu)點［10，14，21-22］。但是，相比CFs電極，具有更出色的機械、化學(xué)特性和生物相容性的CNTs纖維電極的相關(guān)研究相對較少，部分成果在太陽能電池、生物仿生肌肉、細胞凋亡檢測上得到了應(yīng)用［23-25］。

本研究采用恒電流方式在CNTs纖維電極表面原位聚合了PEDOT薄膜作為微電極涂層，并測試了電極的電化學(xué)阻抗和電荷存儲容量等電化學(xué)性能指標(biāo)，證明了涂層材料可以降低電極的電化學(xué)阻抗、增加電極的電荷存儲容量。此外，本文還對PEDOT薄膜進行了掃描電鏡表征、機械穩(wěn)定性測試及生物相容性評價。結(jié)果表明，PEDOT薄膜可以提高CNTs纖維電極的穩(wěn)定性。相關(guān)研究結(jié)果證明，PEDOT薄膜修飾作為微電極修飾的方法在改善神經(jīng)信號記錄方面具有良好的應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 材料

CNTs纖維電極由北京大學(xué)工學(xué)院段小潔課題組提供，CNTs纖維電極通過化學(xué)氣相沉積生長［16］；3,4-乙 二 氧 噻 吩 (3,4-ethylenedioxythiophene，EDOT，CAS No.126213）、聚苯乙烯磺酸鹽（polystyrene sulfonate，PSS，CAS No.28210-41-5）購自Sigma；細胞培養(yǎng)基板選用溫宜氧化銦錫（ITO）導(dǎo)電玻璃。

1.2 電沉積

電沉積實驗使用CHI660D電化學(xué)工作站完成。在含有0.01 mol/L EDOT單體與0.01 mol/L PSS的水溶液中，以恒電流方式在CNTs纖維電極上電沉積PEDOT/PSS薄膜。實驗采用三電極體系，Ag/AgCl電極作為參比電極，Pt電極作為對電極。設(shè)置EDOT聚合電流強度為100 nA，選取50、100、200 s三組電沉積時間作為實驗組。此外，進行生物相容性測試時，在ITO導(dǎo)電玻璃基板上施加1 mA/cm2電流，電沉積過程中施加的電荷分別控制為0.3、0.6、1 C/cm2。

1.3 掃描電鏡測試

掃描電鏡儀器為 Hitachi-S4800 FESEM，設(shè)置掃描電壓為5 kV，觀察CNTs纖維電極在電沉積PEDOT薄膜前后的表面形貌，每個PEDOT沉積電極拍攝3個樣品。

1.4 電化學(xué)性能測試

使用CHI660D電化學(xué)工作站測量電極電化學(xué)阻抗譜（electrochemical impedance spectroscopy，EIS），測試溶液是標(biāo)準(zhǔn)的PBS溶液，pH=7.4，室溫約25℃。選取頻率范圍為1 Hz~100 kHz、振幅為10 mV的正弦交流電信號采集電極電化學(xué)阻抗譜［26］。使 用CHI660E Electrochemical Workstation（CH Instruments，Inc.）進行數(shù)據(jù)采集。

循環(huán)伏安法（cyclic voltammetry，CV）的測試條件如下：25℃室溫、0.1 mol/L PBS （pH=7.4）環(huán)境下，在-0.6 V到+0.8 V的電位之間，采用50 mV/s的掃描速率進行電化學(xué)信號采集，每個電極至少重復(fù)3次循環(huán)伏安掃描，直到循環(huán)伏安曲線穩(wěn)定。通過在設(shè)定電位范圍內(nèi)陰極電流的時間積分計算得到陰極電荷儲存容量（cathodic charge storage capacity，CSCC），CSCC已成為表征神經(jīng)電極電荷容量的常用方法。將沉積PEDOT膜后的電極在PBS中浸泡30 min，在記錄每1個CV之前進行多次循環(huán)掃描，以確保沉積的PEDOT膜達到穩(wěn)定狀態(tài)［26］。所有電化學(xué)數(shù)據(jù)的結(jié)果均為每個實驗條件下6個樣品的平均值。

1.5 電極穩(wěn)定性測試

對PEDOT修飾后CNTs纖維電極進行5 min超聲處理，測量超聲前后1 kHz頻率下電極電化學(xué)阻抗的變化，評估修飾涂層在電極表面的機械穩(wěn)定性。

1.6 細胞活性測試

為了進一步明確PC12細胞在不同修飾方法的PEDOT膜上的細胞活性［26］，采用CCK-8方法進行PC12細胞的活性檢測。首先，將PEDOT沉積的ITO導(dǎo)電玻璃固定在24孔組織培養(yǎng)板的底部。作為對照，純ITO導(dǎo)電玻璃也用同樣的方法固定在24孔組織培養(yǎng)板的底部。PC12細胞在培養(yǎng)基（DMEM（Gibco，A1451801）/5%胎 牛 血 清（Gibco 10091148）/15% 馬 血 清 （Gibco，26050088））中培養(yǎng)，37℃培養(yǎng)箱中含有5% CO2和95%的空氣。在接種細胞前，于37℃下用0.1 g/L多聚-D-賴氨酸（Gibco，A3890401）涂覆樣品孔至少1 h，以促進未黏附PC12細胞的附著。隨后用無菌水沖洗樣品孔，然后用0.01 mol/L PBS沖洗。以2×104/孔的密度將PC12細胞接種于24孔板，培養(yǎng)過程中每2 d更換一半培養(yǎng)基。培養(yǎng)細胞第7天，觀察PC12細胞在PEDOT膜以及ITO玻璃上的神經(jīng)元生長情況，并進行CCK-8檢測其細胞活性，ITO導(dǎo)電玻璃基板及電沉積電荷為0.3、0.6、1 C/cm2實驗組分別測試16個孔的吸光度值。CCK8檢測基于WST-8，在電子耦合劑存在的情況下，可以被線粒體內(nèi)的脫氫酶還原成高度水溶性的橙黃色甲臜產(chǎn)物，顏色深淺與細胞增殖成正比，與細胞毒性成反比，使用酶標(biāo)儀在450 nm波長處測定吸光度值，間接反映活細胞數(shù)量。

1.7 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（standard error of mean，SEM）表示，采用t檢驗，P<0.05表示有顯著差異。統(tǒng)計學(xué)數(shù)據(jù)均用SigmaPlot（版本10.0，Systat Software Inc.，USA）與Igor Pro 6.32A（WaveMetrics，USA）軟件包處理。

2 結(jié) 果

2.1 電極表面SEM表征

電極良好的表面修飾可以降低電極的電化學(xué)阻抗，提高電極的信號記錄質(zhì)量［19，26-27］。圖1展示了CNTs纖維電極沉積PEDOT薄膜前（圖1a）和50 s（圖1b）、100 s（圖1c）、200 s（圖1d）恒電流沉積后的表面形貌。本研究中使用的CNTs纖維電極直徑為~20 μm，修剪長度約為1 cm的電極絲用于電極尖端表面修飾與掃描電鏡形貌表征，修剪后的CNTs纖維電極尖端成束狀，形狀不規(guī)則，且電極表面有明顯凹凸?fàn)罱Y(jié)構(gòu)，與之相比，不同時長修飾PEDOT后觀察到CNTs纖維電極尖端被PEDOT涂層覆蓋，填補了電極尖端的空隙。這種結(jié)構(gòu)有利于神經(jīng)細胞的黏附，使電極與細胞間形成更加密切的連接，提高電極的導(dǎo)電性，有利于降低電極-組織界面的阻抗。

Fig. 1 SEM images of the side view of ～20 μm diameter CNT fibers used in this study

2.2 電極電化學(xué)性能

電化學(xué)阻抗反應(yīng)了腦機接口植入式電極信號記錄的能力，低電極-組織界面阻抗是微電極應(yīng)用于神經(jīng)接口不可缺少的特性，阻抗越小，理論上采集信號的噪聲就越小，也允許電極尺寸做得更加精細以減小植入時的組織損傷［11-12，28］。EIS是一種強大的導(dǎo)電聚合物沉積表征工具，本文利用EIS測量了CNTs纖維電極與PEDOT沉積時間分別為50、100、200 s的修飾電極的電化學(xué)阻抗。發(fā)現(xiàn)與CNTs纖維電極相比，頻率為10~1 000 Hz時，測得的3種PEDOT沉積電極的阻抗都顯著降低（圖2），表明CNTs纖維電極的阻抗在沉積PEDOT后顯著降低。神經(jīng)電極在1 kHz下的電化學(xué)阻抗是一個常規(guī)的評估參數(shù)，相比CNTs纖維電極，PEDOT沉積50 s（圖2a）、100 s（圖2b）、200 s（圖2c）的修飾電極的電化學(xué)阻抗分別由（54.10±22.29）kΩ、（36.31±10.22）kΩ、（46.40±11.89）kΩ下 降 至（21.21±8.98） kΩ、（12.26±1.65） kΩ、（17.41±3.06）kΩ，即分別降低到原阻抗水平的39.19%、33.76%和30%，表明PEDOT沉積的時間越長，阻抗減少的幅度越明顯，這些結(jié)果顯示導(dǎo)電聚合物修飾涂層對電極阻抗有顯著優(yōu)化。

Fig. 2 Electrochemical impedance spectra of CNTs fiber electrode before and after deposition of PEDOT film

2.3 電荷存儲容量

循環(huán)伏安曲線已被廣泛用于評價神經(jīng)電極的氧化還原性能和電荷存儲能力［18，26］。本研究采用的掃描速率為50 mV/s，掃描電位范圍限制在-0.6 ~0.8 V之間，這一工作窗口避免了聚合物薄膜的過度氧化或水的電解。未修飾的CNTs纖維電極本身具有一定電荷存儲能力，而在修飾PEDOT涂層后，CV曲線包圍面積有了顯著增加，該封閉曲線積分與電荷存儲容量成正相關(guān)，積分越大，電極的電容性能就越好（圖3）。計算電極的陰極電荷儲存容量，發(fā)現(xiàn)隨著沉積材料量的增加，CSCC分別由（22.47±4.96）pC、（27.24±8.58）pC、（45.53±9.48）pC增加至（52.82±20.73）pC（圖3a）、（70.65±30.14）pC（圖3b）、（112.52±41.14）pC（圖3c），即分別增加到原陰極電荷儲存容量的235.09%、259.32%和247.14%，這可能是由于PEDOT薄膜為導(dǎo)電聚合物與周圍電解質(zhì)之間的相互作用提供了有效的活化區(qū)。這些結(jié)果表明，與CNTs纖維電極相比，CNTs薄膜電極的電化學(xué)界面性能得到了改善。

Fig. 3 The cyclic voltammetry of CNTs fiber electrode before and after deposition of PEDOT film

2.4 PEDOT涂層的機械穩(wěn)定性

通過測量超聲處理后電極在1 kHz頻率下電化學(xué)阻抗的變化，可以表征材料與電極結(jié)合的機械穩(wěn)定性強弱。PEDOT沉積時間分別為50、100、200 s的修飾電極在1 kHz頻率下的電化學(xué)阻抗平均分別增加了25.10%、33.38%和29.02%（圖4）。這些結(jié)果說明修飾材料在剪切、振蕩等力的作用下可能產(chǎn)生少量剝離和損失，但仍能維持電極記錄位點的穩(wěn)定黏附，保持良好的信號采集能力。

Fig. 4 Mechanical stability test of the modified coating on the electrode surface

2.5 涂層材料細胞毒性

提高電極電化學(xué)性能的同時，電極修飾材料還應(yīng)具有良好的細胞相容性，以減小植入體內(nèi)后對組織的損傷。利用體外細胞實驗測試涂層材料的細胞毒性，分別在ITO玻璃基板和沉積了PEDOT的ITO玻璃基板上培養(yǎng)PC12細胞1周，通過CCK-8試劑盒檢測活細胞數(shù)量。加入CCK-8試劑孵育1 h后測得組織培養(yǎng)板各孔吸光度值，吸光度值越大表明活細胞數(shù)量越多。與ITO玻璃基板相比，以0.3、0.6和1.0 C/cm2沉積了PEDOT的玻璃基板上吸光度值由（0.466±0.015）分別降低為（0.377±0.011）、（0.389±0.023）和（0.349±0.015）（圖5），計算得到細胞存活率分別為（78.71±2.87）%、（82.02±6.90）%和（71.90±3.77）%。ITO已被證明是一種用于慢性植入微電極的生物相容性材料，PEDOT薄膜具有與ITO導(dǎo)電玻璃相當(dāng)?shù)募毎嗳菪裕砻麟姌O修飾材料具有良好的細胞相容性。

Fig. 5 Biocompatibility of the PEDOT film

3 討 論

在神經(jīng)系統(tǒng)中植入腦機接口設(shè)備以治療神經(jīng)疾病正變得非常普遍，這些腦-機接口的成功取決于與神經(jīng)組織接觸的電極，長時間、高質(zhì)量的神經(jīng)記錄電極正在成為大家研究的焦點［1-2，9，14，29-30］。長期穩(wěn)定信號采集電極必須滿足一些特性，如高信號采集分辨率、高電化學(xué)穩(wěn)定性和良好的生物相容性。為此，本文研究了PEDOT修飾的新型CNTs薄膜纖維電極及其電化學(xué)穩(wěn)定性。發(fā)現(xiàn)不同時長的電沉積過程對PEDOT薄膜涂層微電極的性能有很大的影響（圖2、3），這說明電極表面修飾方式不同，電極產(chǎn)生的特性也會顯著不同［20，26］。神經(jīng)電極的電學(xué)性能測試包括電化學(xué)阻抗、伏安循環(huán)曲線等，發(fā)現(xiàn)PEDOT薄膜沉積時間越長，電極的電化學(xué)阻抗越低，電荷存儲容量越大，這可能是由于PEDOT的高導(dǎo)電性和電極有效表面積的增加引起，這也在電極表面掃描電鏡的結(jié)果中得到了驗證，電極修飾PEDOT后觀察到CNTs纖維被PEDOT涂層覆蓋，提高了電極的電化學(xué)有效表面積（圖1），有利于電極輸入阻抗的降低。

電極的穩(wěn)定性是電極質(zhì)量的重要考核指標(biāo)［12，14，26］。為了驗證電極的機械穩(wěn)定性，本文通過測量超聲處理后的電極電化學(xué)阻抗變化來表征材料與電極結(jié)合的機械穩(wěn)定性強弱。發(fā)現(xiàn)修飾電極的阻抗只有微弱的升高（圖4），這說明修飾電極的PEDOT涂層黏附很穩(wěn)定，可以滿足低阻抗下的穩(wěn)定記錄；同時發(fā)現(xiàn)，超聲處理后修飾50 s的電化學(xué)阻抗要比另外兩種情況增加較小，這是由于PEDOT修飾50 s后電極表面覆蓋材料較少，阻抗降低幅度較低導(dǎo)致，由于其修飾后電極電化學(xué)阻抗仍然較高，表面覆蓋材料較少，所以相對更難脫落。本文也驗證了PEDOT涂層材料的生物相容性，在培養(yǎng)的PC12細胞中觀察涂層的細胞毒性（圖5）表明，PEDOT涂層具有良好的生物相容性［26，31］。

本文實驗結(jié)果表明，PEDOT涂層可以降低CNTs電極的輸入阻抗，并且修飾后的電極具有良好的機械穩(wěn)定性和生物相容性，說明PEDOT同樣可以應(yīng)用于CNTs纖維電極作為涂層材料，為將來實現(xiàn)長期穩(wěn)定且具有高分辨率的神經(jīng)信號采集打下了堅實的基礎(chǔ)，滿足了神經(jīng)接口裝置的要求。

4 結(jié) 論

植入式腦機接口在神經(jīng)疾病的治療方面已經(jīng)得到了廣泛應(yīng)用，治療的效果依賴于與神經(jīng)組織接觸的電極。與剛性材料制作的電極相比，微纖維電極已被證明可以減少植入后的異物反應(yīng)，改善神經(jīng)記錄信號的信噪比。本文設(shè)計了一種柔性CNTs纖維電極的修飾方法，該方法采用電化學(xué)聚合的方式將PEDOT薄膜沉積到CNTs纖維電極上，降低了電極的電化學(xué)阻抗，提高了電極的電化學(xué)性能；此外，通過對電極進行超聲處理，證明了修飾涂層在電極表面具有良好的機械穩(wěn)定性；最后，細胞實驗表明，PEDOT薄膜具有良好的生物相容性。這些結(jié)果表明，PEDOT薄膜可以提高CNTs纖維電極的穩(wěn)定性，有望提高腦機接口系統(tǒng)的壽命和可靠性，具有良好的應(yīng)用前景。