間充質(zhì)干細(xì)胞來源外泌體在膝骨關(guān)節(jié)炎微環(huán)境中的作用*

侯靖宇 李振偉 胡 園 劉曉雯 壽康全**

（1）三峽大學(xué)第一臨床醫(yī)院&宜昌市中心人民醫(yī)院骨外科，宜昌 443003；2）三峽大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，腫瘤微環(huán)境與免疫治療湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，宜昌 443002）

骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是一種伴有關(guān)節(jié)腫脹、疼痛和僵硬癥狀的慢性肌肉骨骼退行性疾病。主要的危險(xiǎn)因素包括年齡、陳舊性的關(guān)節(jié)創(chuàng)傷、性別、機(jī)械應(yīng)力和遺傳。骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，其特征是關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)的病理改變，包括軟骨侵蝕、滑膜炎癥和伴有骨贅形成的軟骨下硬化［1-2］。其中，膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎，又稱膝骨關(guān)節(jié)炎（knee osteoarthritis，KOA）最為常見。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全世界患OA的人數(shù)已達(dá)2.5億，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，成為目前老齡化社會嚴(yán)重的健康問題［3-4］。迄今為止，還沒有有效的治療方法可改變KOA的病理進(jìn)展。軟骨細(xì)胞的再生能力差，KOA早期炎癥反應(yīng)會加速軟骨的不可逆損傷，進(jìn)而導(dǎo)致關(guān)節(jié)組織進(jìn)行性結(jié)構(gòu)改變，形成慢性炎癥，進(jìn)一步加重KOA的疾病進(jìn)程。目前臨床上仍缺乏治療KOA的有效方法。

近年來，間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）作為軟骨組織工程領(lǐng)域的研究重點(diǎn)，被認(rèn)為是治療OA的新希望。關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射間充質(zhì)干細(xì)胞已被用于治療KOA［5-6］，其能夠緩解膝關(guān)節(jié)疼痛，改善軟骨質(zhì)量。但MSCs引發(fā)的移植排斥、腫瘤風(fēng)險(xiǎn)和倫理等問題尚待解決。此外，MSCs的分離采集、運(yùn)輸存儲不便，對供體年齡的要求較高，且體外擴(kuò)增有減少其增殖、分化及癌化的可能［7］，這為MSCs治療KOA帶來極大的阻礙。有研究表明，MSCs旁分泌的外泌體可能在膝關(guān)節(jié)組織的修復(fù)中發(fā)揮重要作用［8］。因此，易提取、具有較低免疫源性和生物毒性［9］的MSCs來源外泌體被大量用于KOA治療的研究中。

1 間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體

內(nèi)生性外泌體可來源于自身的關(guān)節(jié)軟骨、滑膜、肌腱及大多數(shù)體液，其在KOA的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。而不同干細(xì)胞來源的外泌體（骨髓、脂肪、滑膜、臍帶）在對KOA的治療中起重要作用。外泌體起源于內(nèi)體系統(tǒng)，內(nèi)體通過依賴轉(zhuǎn)運(yùn)所需分選復(fù)合體（endosomal sorting complexes required for transport，ESCRT）或不依賴ESCRT機(jī)制的途徑以內(nèi)出芽的方式形成腔內(nèi)小泡，隔離特定胞質(zhì)游離的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸或其他胞漿物質(zhì)［10］，形成多泡體。大部分多泡體被溶酶體溶解，少部分通過膜融合由內(nèi)分泌和旁分泌途徑從細(xì)胞中釋放出來，形成外泌體。外泌體可以通過與質(zhì)膜直接融合，或與受體相互作用，或通過內(nèi)吞作用和與核內(nèi)體融合，選擇性地靶向受體細(xì)胞［11］（圖1）。外泌體在不同組織、不同環(huán)境刺激下生成，其生成和釋放速率不同，且成分和濃度受微環(huán)境調(diào)節(jié)。

最初外泌體被認(rèn)為是細(xì)胞產(chǎn)生的“廢物”，隨著研究的深入，學(xué)者們發(fā)現(xiàn)外泌體在各種病理或生理狀態(tài)下均有重要功能，包括調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝、控制炎癥、促進(jìn)血管新生、促進(jìn)組織修復(fù)、免疫調(diào)節(jié)等功能。而且外泌體是細(xì)胞外囊泡的重要組成部分，可參與多種生理過程，包括細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）的降解、炎癥、血管生成和抗原呈遞等［12］。此外，外泌體可以作為重要的信號信使和載體，將信號傳遞給相應(yīng)的靶細(xì)胞，從而改變其生理功能和狀態(tài)。在MSCs治療KOA的過程中，主要利用MSCs旁分泌的外泌體發(fā)揮組織修復(fù)功能［5-6］，并且外泌體可抑制KOA的病程發(fā)展［8］，而且在維持關(guān)節(jié)腔微環(huán)境穩(wěn)態(tài)方面具有重要作用。因此，MSCs外泌體在KOA微環(huán)境中的作用逐漸成為KOA臨床治療的研究熱點(diǎn)。

Fig. 1 Exosome biogenesis and its interaction with target cells圖1 外泌體的發(fā)生機(jī)制及其與靶細(xì)胞的相互作用

2 膝骨關(guān)節(jié)炎 (KOA) 微環(huán)境

隨著認(rèn)識的提高，KOA逐漸被認(rèn)識為全關(guān)節(jié)疾病，所有關(guān)節(jié)成分如關(guān)節(jié)軟骨、滑膜、軟骨下骨及相關(guān)肌肉在KOA發(fā)生發(fā)展過程中均發(fā)生了病理學(xué)變化［13］。KOA最早的病理改變多見于關(guān)節(jié)軟骨表面，由于軟骨組織發(fā)生剝落，鈣化基質(zhì)擴(kuò)張，最終取代了軟骨組織中的關(guān)節(jié)區(qū)，軟骨細(xì)胞的外周細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)塌陷。KOA發(fā)展過程中，軟骨基質(zhì)的穩(wěn)態(tài)被促炎細(xì)胞因子和趨化因子破壞［14-15］。這些細(xì)胞因子刺激巨噬細(xì)胞和軟骨細(xì)胞產(chǎn)生蛋白酶、一氧化氮（NO）和類二十烷，誘導(dǎo)ECM發(fā)生分解代謝，并抑制基質(zhì)合成［16］（圖2）。與此同時(shí)，核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）、絲裂原活化蛋白激酶以及其他炎癥和應(yīng)激誘導(dǎo)途徑進(jìn)一步增強(qiáng)了炎癥和分解代謝反應(yīng)相關(guān)蛋白質(zhì)的表達(dá)。在關(guān)節(jié)組織中的免疫細(xì)胞受到這些信號刺激后，釋放出白介素（interleukin，IL）-6、IL-1β、γ干擾素（IFN-γ）和腫瘤壞死因子α（tissue necrosis factor-α，TNF-α）等促炎因子，進(jìn)一步加重炎癥反應(yīng)。此外，這些信號通路誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞產(chǎn)生如基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metallopro-teinase，MMPs）、聚蛋白多糖酶（aggrecan-degrading enzyme 5，ADAMTS5）等參與軟骨細(xì)胞破裂的細(xì)胞因子，激活Toll樣受體，加速分解代謝反應(yīng)和炎癥反應(yīng)［17］，導(dǎo)致廣泛的ECM降解和丟失，軟骨細(xì)胞增殖速度急劇加快，部分軟骨細(xì)胞轉(zhuǎn)變成肥大軟骨細(xì)胞［18］。

Fig. 2 Role of exosomes derived from mesenchymal stem cells in knee osteoarthritis圖2 間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體在膝骨關(guān)節(jié)炎中的作用

膽固醇代謝也是KOA微環(huán)境改變的重要因素。KOA受損軟骨細(xì)胞的肝X受體α/β（liver X receptor α/β，LXR α/β）會大量流失，LXRα/β的減少會導(dǎo)致OA微環(huán)境中膽固醇相關(guān)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)下調(diào)，致使細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過度積累，進(jìn)一步破壞軟骨細(xì)胞［19］。

微環(huán)境中Zn2+代謝失衡也與骨性關(guān)節(jié)炎密切相關(guān)。軟骨細(xì)胞中的miRNA-488在OA中表達(dá)下調(diào)，進(jìn)而下調(diào)Zn2+敏感的金屬調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子1（metal regulatory transcription factor 1，MTF-1）的表達(dá)，導(dǎo)致MMP-3、MMP-13和ADAMTS-5高表達(dá)，導(dǎo)致OA微環(huán)境紊亂［20］。

線粒體功能障礙和活性氧（reactive oxygen species，ROS）對KOA的發(fā)展也產(chǎn)生影響。線粒體是產(chǎn)生ROS的主要部位，而過多的ROS會抑制線粒體呼吸鏈，減少三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）的生成，并導(dǎo)致線粒體DNA（mtDNA）突變，引起軟骨細(xì)胞功能衰竭和細(xì)胞死亡。研究表明，KOA患者軟骨細(xì)胞的線粒體膜電位降低，線粒體呼吸功能障礙，間接導(dǎo)致MMPs的生成增加［21］。促炎細(xì)胞因子IL-1β和TNF-α亦可促進(jìn)線粒體ROS和NO的產(chǎn)生［22］。

此外，KOA也與細(xì)胞的衰老和缺氧有關(guān)［11］。KOA中的軟骨細(xì)胞表現(xiàn)出與衰老相關(guān)的表型，增加MMP-1和MMP-13蛋白的釋放，降解ECM膠原［23］。而缺氧相關(guān)基因誘導(dǎo)的一氧化氮合成酶和缺氧誘導(dǎo)因子-1（hypoxia inducible factor-1，HIF-1）在KOA中上調(diào)，加重缺氧環(huán)境，從而加劇KOA并發(fā)生滑膜炎［24］。

3 間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體在膝骨關(guān)節(jié)炎 (KOA) 微環(huán)境中的作用

3.1 調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)

在KOA的關(guān)節(jié)軟骨中，軟骨細(xì)胞損傷和修復(fù)失衡會引起ECM的結(jié)構(gòu)破壞。在溶酶體蛋白酶以及膠原酶的作用下，軟骨基質(zhì)內(nèi)的蛋白多糖、II型膠原等成分急劇減少，軟骨細(xì)胞功能受損失去合成ECM的能力［25］。有研究表明，間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體能夠調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞外基質(zhì)穩(wěn)態(tài)，延緩骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生發(fā)展［26］。

Wang等［27］研究發(fā)現(xiàn)，通過向KOA模型小鼠關(guān)節(jié)腔內(nèi)分別注射胚胎間充質(zhì)干細(xì)胞（embryonic stem cell -mesenchymal stem cell，ESC-MSCs）或其來源的外泌體，可更大程度上提高II型膠原酶的生成，降低MMP-13的表達(dá)，平衡軟骨ECM的合成與降解，對OA產(chǎn)生良好的治療作用。Zhang等［28］從人胚胎來源的MSCs中獲得外泌體，并使用免疫小鼠模型研究了ESC-MSCs來源外泌體對軟骨再生的影響，發(fā)現(xiàn)ESC-MSCs來源的外泌體促進(jìn)了軟骨基質(zhì)重要成分硫化多糖（sulphated glycosaminoglycan，s-GAG）和II型膠原的合成，加速了軟骨細(xì)胞的修復(fù)。Mao等［29-30］研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)miR-92a-3p的MSCs來源外泌體轉(zhuǎn)染OA患者軟骨細(xì)胞后，MMP-13表達(dá)明顯降低；將miR-92a-3p轉(zhuǎn)染原代軟骨細(xì)胞后，高表達(dá)miR-92a-3p的MSCs來源外泌體可通過靶向調(diào)節(jié)noggin蛋白經(jīng)PI3K/AKT/mTOR（哺乳動物雷帕霉素靶蛋白）通路抑制人軟骨細(xì)胞ADAMTS-4和ADAMTS-5表達(dá)，抑制軟骨基質(zhì)分解，延緩OA進(jìn)展。

3.2 調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞代謝

在正常狀態(tài)下，軟骨細(xì)胞處于生理和代謝平衡，其強(qiáng)大的氧化還原能力可以控制分化和軟骨形成［31］。在KOA關(guān)節(jié)環(huán)境和炎癥條件下，軟骨細(xì)胞代謝穩(wěn)態(tài)被打破，發(fā)生軟骨重塑，其主要特征是糖酵解途徑增強(qiáng)、線粒體功能紊亂和軟骨細(xì)胞衰老［32］。因此，治療KOA必須恢復(fù)軟骨組織的生物能量平衡。MSCs來源外泌體中包含糖酵解中ATP生成階段的酶，如3-磷酸甘油醛脫氫 酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPD）、磷酸甘油酸激酶（phosphoglycerate kinase，PGK）和M2型丙酮酸激酶（M2 pyruvate kinase，PKM2），可增加受損軟骨細(xì)胞的生物合成，最終促進(jìn)受損軟骨組織修復(fù)［33］。Chen等［34］研究發(fā)現(xiàn)，在使用線粒體ETC復(fù)合體I抑制劑模擬的線粒體損傷模型中，與對照組相比，MSCs來源的外泌體組線粒體的活性氧產(chǎn)量減少，軟骨細(xì)胞中ATP水平增加了21%。這表明MSCs來源的外泌體可能通過直接向線粒體提供其合成所需的蛋白質(zhì)，而修復(fù)軟骨細(xì)胞中線粒體的損傷。Wu等［35］發(fā)現(xiàn)，髕下脂肪墊間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體通過抑制靶向軟骨細(xì)胞的mTOR信號來抑制軟骨細(xì)胞凋亡，調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞代謝，促進(jìn)ECM再生。而軟骨細(xì)胞自噬活性的增強(qiáng)則可能與髕下脂肪墊間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體中富含的核酸miR-100-5p有關(guān)。

3.3 免疫調(diào)節(jié)

滑膜巨噬細(xì)胞（synovial macrophages，M?）是膝關(guān)節(jié)中的主要免疫細(xì)胞［36］。研究表明，MSCs來源的外泌體可抑制巨噬細(xì)胞的募集。Shen等［37］發(fā)現(xiàn)，MSCs來源的外泌體高表達(dá)趨化因子受體2（C-C motif chemokine receptor 2，CCR2），通過結(jié)合促炎趨化因子2（C-C motif ligand 2，CCL2）來抑制CCL2的活性，從而抑制巨噬細(xì)胞聚集，在組織損傷中發(fā)揮關(guān)鍵作用。此外，針對M1/M2極化的MSCs來源外泌體具有免疫調(diào)節(jié)的作用，能增強(qiáng)M2型巨噬細(xì)胞的浸潤，減少M(fèi)1型巨噬細(xì)胞的浸潤，抑制IL-1β和TNF-α的表達(dá)，從而抑制KOA中的炎癥反應(yīng)［28］。

在II型膠原酶誘導(dǎo)的OA模型中，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone mesenchymal stem cell，BMSCs）來源的外泌體可降低關(guān)節(jié)軟骨的損傷，對軟骨起到保護(hù)作用，并有效減輕炎癥反應(yīng)［38］。另外，在脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）模型中，hUCMSCs來源的外泌體可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞由M1型向M2型轉(zhuǎn)化，減少炎癥因子釋放，促進(jìn)SCI修復(fù)［39］。而在延遲型超敏模型中，MSCs來源外泌體可抑制T細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)Tregs細(xì)胞的產(chǎn)生，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用［38］。而且，MSCs來源外泌體通過抗原遞呈細(xì)胞（antigen-presenting cell，APC）介導(dǎo)的體外和體內(nèi)途徑可誘導(dǎo)初始T細(xì)胞分化為Treg細(xì)胞［40］。同時(shí)，MSCs來源的外泌體對B細(xì)胞也具有免疫抑制作用，可抑制漿細(xì)胞的最終分化和成熟。上述結(jié)果提示，MSCs來源外泌體或可作為免疫調(diào)節(jié)劑，用于抑制KOA的發(fā)展進(jìn)程。

3.4 抗炎作用

在KOA進(jìn)程中，促炎介質(zhì)如IL-1β和TNF-α的分泌水平增加，可誘導(dǎo)軟骨組織損傷和炎癥［41］，而MSCs來源的外泌體具有明確的抗炎效果。脂肪源MSCs的外泌體可減少軟骨細(xì)胞中TNF-α、IL-6、IL-10等炎癥因子的產(chǎn)生，下調(diào)環(huán)氧合酶2（cyclooxygenase-2，COX-2）和微粒體PGE合酶1（prostaglandin E synthase 1，PGEs1）的表達(dá)，減少前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）的產(chǎn)生，發(fā)揮軟骨保護(hù)作用［42］。此外，骨髓MSCs來源的外泌體可抑制炎癥介質(zhì)對軟骨穩(wěn)態(tài)的不良影響［43］，其通過促進(jìn)蛋白聚糖沉積和II型膠原的生成，降低COX-2和促炎白介素（IL-1α、IL-1β、IL-6、 IL-8、IL-17）的表達(dá)，抑制OA軟骨細(xì)胞中NF-κB p65亞基的核轉(zhuǎn)位，從而抑制TNF-α誘導(dǎo)的促炎信號和TNF-α誘導(dǎo)的OA軟骨細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，發(fā)揮抗炎效果。此外，骨髓MSCs來源的外泌體還可增強(qiáng)3D纖維蛋白凝膠培養(yǎng)的OA軟骨細(xì)胞中軟骨源性轉(zhuǎn)錄因子SRY盒子9（SRY-box-9，Sox-9）和WNT家族成員7A（Wnt family member 7A，WNT7A）的mRNA表達(dá)，增強(qiáng)Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（Runt related transcription factor 2，RUNX2）、X型膠原和堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）的表達(dá)，抑制軟骨肥厚，維持軟骨穩(wěn)態(tài)［43］。

4 總結(jié)與展望

KOA是一種常見的關(guān)節(jié)疾病，其臨床治療主要依賴藥物和手術(shù)治療，但這些治療面臨許多問題，如藥物副作用、手術(shù)并發(fā)癥等，會給患者帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。目前，干細(xì)胞已用于軟骨組織修復(fù)和OA治療，但干細(xì)胞本身的生長特性限制了治療效果，還會觸發(fā)免疫反應(yīng)，而且細(xì)胞供體年齡還會影響干細(xì)胞在體內(nèi)的活性。而通過關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射MSCs來源的外泌體，可改變關(guān)節(jié)腔的生物分子構(gòu)成，改善關(guān)節(jié)腔的微環(huán)境。同時(shí)，外泌體所攜帶的特異性營養(yǎng)因子可調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝、免疫環(huán)境并發(fā)揮抗炎作用，恢復(fù)軟骨細(xì)胞的ECM穩(wěn)態(tài)平衡，促進(jìn)軟骨再生，改善癥狀，延緩KOA進(jìn)程。目前外泌體的治療功能僅限于臨床前研究，且無法確定治療效果最佳的外泌體種類。此外，外泌體的規(guī)范化提取、最佳用量以及療程問題，都有待于長期的實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)一步探索。近年來，有學(xué)者提出軟骨下骨微環(huán)境中軟骨下骨和軟骨組成的軟骨單元在關(guān)節(jié)穩(wěn)態(tài)和KOA發(fā)展中起著重要作用，而針對其中一個(gè)異常關(guān)節(jié)單元的治療可能抑制整個(gè)關(guān)節(jié)的病理進(jìn)展［44］。因此，干細(xì)胞來源的外泌體在軟骨下骨中的作用可能成為今后治療KOA的新方向。