副豬嗜血桿菌14型的分離鑒定和藥敏試驗

徐引弟，王治方，焦文強，朱文豪，李海利，張青嫻，郞利敏，王克領(lǐng)

(河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，河南鄭州 450002)

副豬嗜血桿菌(Haemophilusparasuis，HPS)是豬副豬嗜血桿菌病的病原菌，主要引起豬的多發(fā)性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎和腦膜炎。副豬嗜血桿菌病在世界范圍內(nèi)存在，是斷奶、保育仔豬死亡的原因之一，是臨床混合感染的主要病原之一，給養(yǎng)豬業(yè)造成較大的經(jīng)濟損失，影響?zhàn)B豬業(yè)的健康發(fā)展[1]。

副豬嗜血桿菌臨床血清型較多，有15個血清型，臨床上還有20%以上的不可分型菌株，各地流行菌株血清型不一，各血清型之間缺乏免疫交叉保護能力。疫苗免疫接種是防控副豬嗜血桿菌病的最佳途徑，國內(nèi)商品化疫苗多為針對血清4型、5型的二價疫苗或血清4型、5型、13型的三價或血清4型、5型、12型、13型的四價疫苗，目前國內(nèi)主要流行血清4型、5型、12型、13型、14型，血清14型沒有疫苗[2]。菌株毒力與其攜帶的毒力基因有密切關(guān)系，副豬嗜血桿菌血清1型、5型、10型、13型、14型為高毒力；血清2型、4型、15型為中等毒力；其他血清型劃為無毒力型[3]。但也發(fā)現(xiàn)HPS臨床菌株毒力與血清型并不完全相關(guān)，同一血清型不同菌株毒力不同，甚至存在明顯差異。不同地區(qū)HPS臨床菌株耐藥表型不同，同一地區(qū)菌株耐藥性也呈現(xiàn)動態(tài)變化，大都表現(xiàn)出耐藥增強趨勢，這些變化使副豬嗜血桿菌病臨床防控更加復(fù)雜。近年來，在臨床典型病例中不斷分離出副豬嗜血桿菌1型、2型、7型、6型、9型、14型等血清型，使得副豬嗜血桿菌的感染流行情況更為復(fù)雜。需要根據(jù)臨床感染情況開發(fā)有針對性的血清型疫苗，更好的更有效的防控副豬嗜血桿菌病。14型菌株的研究報道越來越多，提示副豬嗜血桿菌14型在臨床感染率越來越高。[4-5]。本研究對1株副豬嗜血桿菌血清14型菌株進行了毒力基因檢測、毒力試驗和藥敏試驗等，旨在為副豬嗜血桿菌血清14型的流行病學(xué)研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料來源 采集來自河南某規(guī)模化豬場具有疑似副豬嗜血桿菌病臨床癥狀的3頭保育豬的肺臟、心血、腦、關(guān)節(jié)液等病料共12份，發(fā)病豬表現(xiàn)為發(fā)熱、呼吸困難、關(guān)節(jié)腫脹、跛行、皮膚及黏膜發(fā)紺、站立困難甚至癱瘓、僵豬或死亡。

1.1.2 試驗用動物 副豬嗜血桿菌ELISA試劑盒檢測抗體為陰性的健康保育豬20頭，體重20 kg左右，購自鄭州郊區(qū)某豬場。

1.1.3 主要試劑 胰蛋白胨大豆瓊脂(TSA)，碧迪醫(yī)療器械(上海)有限公司產(chǎn)品；犢牛血清、50×TAE濃縮液瓊脂糖和DNA提取試劑盒，生工生物工程(上海) 股份有限公司產(chǎn)品；煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(輔酶Ⅰ，NAD)， Roche公司產(chǎn)品；TaqPCR master mix、DNA標準DL 2 000、DNA提取試劑盒等PCR試劑，寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；基因引物，北京擎科生物科技有限公司合成；藥敏片，杭州濱河微生物試劑有限公司產(chǎn)品。

1.1.4 主要儀器 Thermo 5020 PCR擴增儀、Thermo 1300SERIES A2生物安全柜，賽默飛世爾科技(中國)有限公司產(chǎn)品；電泳儀(DYY-6型)，北京六一生物科技有限公司產(chǎn)品；凝膠成像系統(tǒng)，沙船(天津)生物科技發(fā)展有限公司產(chǎn)品；5418臺式高速離心機，Eppendorf公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 副豬嗜血桿菌的分離培養(yǎng) 培養(yǎng)基配制參照文獻[5]，無菌條件下采集發(fā)病或死亡豬的肺臟、心血、淋巴結(jié)、脾臟、腦、關(guān)節(jié)液等病料接種于含有NAD的TSA固體培養(yǎng)基上，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h，挑取疑似菌落進行傳代純化，再培養(yǎng)24 h～48 h后觀察副豬嗜血桿菌的菌落及菌體形態(tài)。

1.2.2 引物設(shè)計 參照文獻[6-8]設(shè)計合成副豬嗜血桿菌16S rRNA基因特異性引物和副豬嗜血桿菌血清型14引物，引物序列和擴增片段長度見表1。

1.2.3 副豬嗜血桿菌的鑒定和血清型鑒定 將臨床分離菌株分別接種于TSA平板(含50 mL/L的犢牛血清，0.1 mg/mL的NAD)上，放置于體積分數(shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱，37 ℃培養(yǎng)36 h，挑取典型菌落，按照DNA提取試劑盒說明書分別提取菌株的DNA，分裝備用。PCR反應(yīng)體系為25 μL，體系包括10×TaqPCR master mix 13 μL，上、下游引物各1.0 μL，無菌水5.0 μL，模板5 μL。反應(yīng)條件為：94 ℃變性5 min；94 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，共35個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min，PCR產(chǎn)物于4 ℃保存。取PCR產(chǎn)物10 μL，經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠100 V電壓下電泳45 min后用凝膠成像系統(tǒng)分析觀察結(jié)果，陽性結(jié)果測序比對。

表1 副豬嗜血桿菌鑒定和血清型鑒定引物

1.2.4 毒力基因檢測 參照文獻[9-10]合成副豬嗜血桿菌毒力基因的引物(表2)，以提取的菌株DNA為模板進行PCR擴增檢測，鑒定菌株的毒力基因。

1.2.5 致病性試驗 將20頭保育豬隨機分為2組，1組對照組和1組試驗組，每組10頭。將副豬嗜血桿菌分離株接種TSB液體培養(yǎng)基，37 ℃搖床培養(yǎng)24 h后，測定菌體濃度，連續(xù)10倍稀釋涂布固體平板，活菌計數(shù)，計算原液菌體濃度，調(diào)整至109CFU/mL。試驗組動物通過腹腔內(nèi)接種3 mL副豬嗜血桿菌液體培養(yǎng)物，對照組動物通過腹腔內(nèi)接種3 mL滅菌的TSB液體培養(yǎng)基。注射后連續(xù)觀察2周，觀察并記錄其發(fā)病數(shù)和死亡數(shù)等情況。

表2 毒力基因引物序列

1.2.6 藥敏試驗 采用紙片擴散法，挑取分離株的菌落，TSB(含50 mL/L的犢牛血清，0.1 mg/mL的NAD)培養(yǎng)過夜，調(diào)整濃度為0.5麥氏單位的菌懸液，用滅菌棉簽蘸取細菌懸液，均勻涂滿TSA平板(含50 mL/L的犢牛血清，0.1 mg/mL的NAD)表面；用滅菌鑷子夾取藥敏紙片均勻的貼于TSA平板上，置于體積分數(shù)為5%的CO2、37 ℃培養(yǎng)36 h，測量抑菌圈大小，判斷結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 細菌的分離培養(yǎng)

通過對采集的疑似樣品進行細菌分離、純化、鑒定，分離出1株疑似副豬嗜血桿菌，長出一致的針尖狀大小、無色透明、光滑、濕潤的，直徑大小為1 mm～2 mm的菌落；純化的同時并接種于不含NAD的TSA固體培養(yǎng)基上，在不含NAD的TSA培養(yǎng)基上不能生長；挑取純化的單個菌落進行革蘭氏染色鏡檢，觀察菌體形態(tài)特征為革蘭氏陰性菌，細長桿菌，多絲狀的菌體如圖1。

2.2 分離菌株鑒定和分型鑒定

通過PCR擴增，臨床菌株均擴增出822 bp、730 bp 2個條帶，大小與副豬嗜血桿菌血清14型目的條帶一致，表明臨床分離菌株為副豬嗜血桿菌，血清型為14型(圖2) 。通過基因比對，分離株與血清14型副豬嗜血桿菌標準株的16S rRNA、funAB基因序列的同源性均在100%。經(jīng)PCR分子血清分型鑒定，結(jié)果為血清型14型，鑒定結(jié)果見圖2。將分離鑒定的血清14型副豬嗜血桿菌命名為HN1513。

圖1 副豬嗜血桿菌分離株的菌體形態(tài)

2.3 毒力基因測定結(jié)果

通過PCR擴增測定，共檢測出capd、vta1、vta2、vta3、wza、hhdA、hhdB、ompP2、nanH、cdtA、cdtB、cdtC、espP13種毒力基因(圖3)。

2.4 動物感染試驗結(jié)果

觀察發(fā)現(xiàn)，HN1513株接種組在接種副豬嗜血桿菌24 h后表現(xiàn)出喘氣、呼吸困難等癥狀，體溫升高，耳部、腹部及臀部發(fā)紺，并出現(xiàn)轉(zhuǎn)圈，2 d后開始出現(xiàn)死亡，共死亡8頭。對照組動物在試驗期間體溫正常,且無明顯的呼吸道癥狀。

結(jié)束后處死試驗組動物，同時處死10頭對照組動物，采集病料，進行細菌分離。HN1513株接種組剖檢肺部有大量纖素樣滲出，與胸膜粘連，心包積液，絨毛心，腦部出血；對照組剖檢均未發(fā)生明顯的病理變化，對照組的10份病料均未分離到副豬嗜血桿菌，試驗組的10份病料中均分離到副豬嗜血桿菌，PCR鑒定結(jié)果與接種菌株一致。

綜合試驗結(jié)果，副豬嗜血桿菌株HN1513株表現(xiàn)為毒力較強的菌株。

M.DNA標準DL 2 000；1～2.HN1513株的16S rRNA基因擴增；3.血清14型標準株的16S rRNA基因擴增；4～6.HN1513株血清14型的funAB基因擴增；7.血清14型標準株的的funAB基因的擴增；8.陰性對照

2.5 藥敏試驗結(jié)果

選用18種常用抗菌藥物對標準株和臨床菌株進行耐藥表型檢測(表3)。結(jié)果表明，分離株對頭孢他啶、氟苯尼考、頭孢噻呋、氨芐西林、強力霉素、土霉素、氧氟沙星敏感，對阿莫西林、新霉素、卡那霉素、替米考星、四環(huán)素、環(huán)丙沙星、紅霉素中介，對青霉素、阿米卡星、諾氟沙星、復(fù)方新諾明耐藥。

M.DNA標準DL 2 000；1.capd基因；2.vta1基因；3.vta2基因；4.vta3基因；5.wza基因；6.hhdA基因；7.hhdB基因；8.ompP2基因；9.nanH基因；10.cdtA基因；11.cdtB基因；12.cdtC基因；13.espP2基因

表3 藥敏試驗抑菌圈直徑及判定結(jié)果

3 討論

副豬嗜血桿菌是養(yǎng)豬行業(yè)的重要細菌性病原之一，可以單一病原感染發(fā)病，更多是作為繼發(fā)病原感染豬群，引起混合感染之后，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大經(jīng)濟損失。副豬嗜血桿菌臨床血清型較多，不同血清型菌株的毒力及致病性不同，臨床感染發(fā)病情況也不盡相同。本室研究表明河南地區(qū)主要流行菌株為血清4型、血清5型和血清7型，血清4型血清和5型相關(guān)報道也較多，而血清14型報道較少[11-12]。本試驗對河南地區(qū)1株副豬嗜血桿菌血清14型臨床菌株進行了生物學(xué)特性研究，該分離株攜帶有13種主要毒力基因，毒力較強，藥敏試驗結(jié)果表明，分離株對頭孢他啶、氟苯尼考、頭孢噻呋、氨芐西林、強力霉素、土霉素、氧氟沙星敏感。

菌株毒力的強弱與其攜帶的毒力因子有著直接關(guān)系，副豬嗜血桿菌毒力因子多而復(fù)雜，致病機理尚未完全研究清楚，本試驗篩選檢測的13個毒力基因可能是副豬嗜血桿菌的致病關(guān)鍵因子，通過毒力因子檢測，該分離株檢測出全部13種毒力基因，保育豬致病性試驗表明該分離株毒力較強，屬于強毒株，與毒力基因檢測的結(jié)果有一定的關(guān)聯(lián)性[9]。

抗菌藥物仍是當(dāng)前防控副豬嗜血桿菌病的有效途徑，但由于養(yǎng)殖過程中抗菌藥物長期盲目濫用或不規(guī)范使用，導(dǎo)致細菌耐藥性越來越嚴重，使得藥物抗菌效果越來越差，給養(yǎng)殖戶造成了很大的經(jīng)濟損失[13]。通過耐藥表型檢測，該分離菌株對頭孢他啶、氟苯尼考、頭孢噻呋、氨芐西林、強力霉素、土霉素、氧氟沙星較為敏感，對其他11種藥物敏感性較低或耐藥，分離株表現(xiàn)出多重耐藥現(xiàn)象。因此，篩選敏感藥物，科學(xué)合理使用抗菌藥物是防控副豬嗜血桿菌病的關(guān)鍵。

本試驗通過對河南某規(guī)模化豬場副豬嗜血桿菌血清14型生物學(xué)特性研究，從基因檢測結(jié)果、致病性試驗和耐藥表型結(jié)果來看，臨床HPS血清14型菌株表現(xiàn)出較強的毒力，有明顯的耐藥性，在生產(chǎn)實踐中應(yīng)當(dāng)重視副豬嗜血桿菌血清14型的危害和防控。