細胞塊聯(lián)合免疫組化檢測對胸腔積液中腺癌與間皮的鑒別作用

顧婷婷 姚麗倩 徐 松 高小姣

江蘇大學附屬昆山醫(yī)院 昆山市第一人民醫(yī)院病理科，江蘇昆山 215300

胸腔積液常是晚期惡性腫瘤的首發(fā)癥狀[1-2]。惡性胸腔積液最常見于肺癌中晚期患者，也包括其他臟器惡性腫瘤的遠處轉移、原發(fā)于胸膜的惡性胸膜間皮瘤等[3-4]。目前，細胞病理學檢查仍然是惡性胸腔積液常用診斷方法[5-6]。常規(guī)細胞學涂片質(zhì)量差，細胞數(shù)量少，診斷經(jīng)驗不足等因素均可導致陽性檢出率低[7]。胸腔積液中反應性增生的間皮細胞形態(tài)與腺癌細胞常難以區(qū)分，造成漏診甚至誤診[8]。本研究對可疑異型腺上皮的169例胸腔積液標本進行了細胞塊包埋及石蠟切片，并應用一組抗體進行免疫組化染色，以探討細胞蠟塊結合免疫組化在胸腔積液細胞病理學診斷中的應用價值。

1 材料與方法

1.1 材料

選取2017年1月至2020年5月昆山市第一人民醫(yī)院病理科有轉移性腺癌及反應性增生的間皮細胞的胸腔積液標本169例，男98例、女71例；年齡19～93歲。選取的惡性胸腔積液病例均經(jīng)過常規(guī)細胞學診斷，且與臨床診斷或原發(fā)灶組織病理學診斷相符。

1.2 方法

1.2.1 主要儀器及試劑 HE染色機（ST5020，德國LEICA公司）。全自動免疫組化染色機（LEICA BOND-MAX，德 國LEICA公 司）。特 異性一抗試劑：波形蛋白(Vimentin)、細胞角蛋白5/6（cytokeratin，CK5/6）、腎母細胞瘤基因（nephroblastoma gene，WT-1）、鈣 網(wǎng) 膜 蛋 白（Calretinin）、癌 胚 抗 原（carcino-embryonic antigen，CEA，細胞角蛋白7（cell keratin 7，CK7）、人類全癌上皮相關糖蛋白2（human pancarcinoma-associated epithelial glycoprotein-2，MOC-31）、上皮特異抗原（Ber-Ep4）均購自上?；蚩萍加邢薰尽Ｃ庖唢@色試劑（徠卡生物系統(tǒng)有限公司）。

1.2.2 細胞石蠟制片及染色 將存檔的胸腔積液倒入50 ml離心管中，2500 r/min，離心10 min，棄去上清液，根據(jù)沉淀量加入2倍體積的95%乙醇，2500 r/min，離心10 min，棄去上清液，取出沉淀物放入包埋盒，10%中性甲醛固定后，進行常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋制成細胞石蠟塊。常規(guī)石蠟切片3～4 μm，烘箱65℃烤片60 min備用。

每例標本選取一張常規(guī)切片脫蠟，進行蘇木素伊紅（HE）染色，中性樹膠封片。選用特異性一抗試劑行全自動免疫組化（IHC）染色機染色，嚴格按說明書步驟操作。

1.3 結果判定

免疫組化結果均由兩名高年資病理醫(yī)師進行雙盲獨立閱片。Vimentin、CK7、CK5/6定位于胞質(zhì)，WT1定位于胞核，MOC-31、Calretinin定位于胞核和胞質(zhì)，CEA、Ber-Ep4定位于胞膜和胞質(zhì)。細胞著色定位明確，呈棕黃色顆粒為陽性細胞。

1.4 統(tǒng)計學處理

應用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進行處理，計數(shù)資料采用χ2檢驗，P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 胸腔積液的石蠟包埋切片HE染色特點

鏡下觀察，82例惡性胸腔積液為腺癌細胞，細胞核偏位，呈圓或橢圓形，核漿比高，核染色質(zhì)粗顆粒狀。細胞平鋪排列，部分細胞呈巢狀立體結構，外觀呈球形、乳頭狀、或腺腔樣結構，其中以腺腔樣結構常見，背景為數(shù)量不等的紅細胞、間皮細胞、淋巴細胞及炎細胞（圖1A）。38例間皮反應性增生的病例中，增生的間皮細胞，核略增大、深染，核質(zhì)比略增大，細胞呈類圓形、梭形、多邊形等多種形態(tài)，有聚集成團傾向，細胞團細胞之間常見“開窗”現(xiàn)象（圖2A）。49例為難以鑒別為轉移性腺癌、反應性增生的間皮細胞或間皮瘤。

圖1 腺癌細胞HE及免疫組化染色

2.2 免疫組化結果分析

2.2.1 腺癌細胞與反應性間皮細胞免疫組化結果 細胞蠟塊連續(xù)切片，免疫標記的染色背景清晰、陽性染色細胞定位準確，易于判斷。腺癌細胞的HE染色及抗體著色情況（圖1）。反應性增生的間皮細胞HE染色及抗體著色情況（圖2）。CEA、CK7、MOC-31、Ber-Ep4、Vimentin、CK5/6、WT1、Calretinin在轉移性腺癌和增生間皮細胞中的表達有顯著差異（表l）。CEA、CK7、MOC-31、Ber-Ep4在腺癌中的陽性表達率分別為81.0%、66.7%、90.5%、81.9%；而在增生性間皮中，陽性表達率僅為6.3%、12.5%、4.7%、7.8%。Vimentin、CK5/6、WT1、Calretinin在增生性間皮中，陽性表達率分別為87.5%、84.3%、92.2%、90.6%；而在轉移性腺癌中，陽性表達率僅為28.6%、17.1%、14.3%、4.8%。

圖2 間皮細胞HE及免疫組化染色

表1 CEA、CK7、MOC-31、Ber-Ep4、Vimentin、CK5/6、WT1、Calretinin在腺癌與間皮源性細胞的表達結果

2.2.2 聯(lián)合免疫標記 CEA、CK7、MOC-31、Ber-Ep4、Vimentin、CK5/6、WT1及Calretinin在轉移性腺癌與增生性間皮細胞中的敏感度與特異度（表2）。

表2 CEA、CK7、MOC-31、Ber-Ep4、Vimentin、CK5/6、WT1、Calretinin在鑒別診斷腺癌細胞與增生性間皮細胞中的應用價值（%）

3 討論

胸腔積液（胸水）主要指人體胸膜腔中病理性液體積聚，常為晚期惡性腫瘤患者出現(xiàn)的首發(fā)癥狀，尤其是肺癌患者[9-10]。因此，胸水性質(zhì)的病理學診斷極其重要[11]。傳統(tǒng)胸水離心細胞涂片簡單、經(jīng)濟[12]，但陽性檢出率低。細胞塊石蠟技術可提高檢出細胞數(shù)量，避免細胞形態(tài)破壞[13]，還能實現(xiàn)切片長期保存，用于免疫組化、基因檢測等進一步檢查[14-15]。而常規(guī)細胞涂片中增生性間皮與腺癌細胞常難以鑒別[16]。此時，聯(lián)合細胞塊石蠟技術與免疫組化檢測，不僅明顯提高陽性細胞檢出率，也解決了一部分疑難病例。文獻表明，完成這一任務還需要多個抗體聯(lián)合應用、相互補充[17-19]。

本研究對169例胸水離心沉淀行細胞塊石蠟包埋，采用Vimentin、CK5/6、WT1、Calretinin、CEA、CK7、MOC-31、Ber-Ep4一組聯(lián)合抗體，應用于胸水細胞學診斷與鑒別診斷。結果顯示，CEA標記腺癌細胞的敏感度為81.0%，特異度為93.8%，標記間皮細胞陽性率僅為6.3%。CEA是對間皮和癌細胞實施區(qū)分的有效標記，廣泛存在于各種腺上皮源性腫瘤中，尤其是各種腺癌細胞中，而在間皮細胞以及間皮瘤中，并不存在CEA表達。CK7主要在移行上皮及正常組織腺上皮標記，非上皮來源不表達，本組CK7在腺癌中的敏感性為66.7%，特異性為87.5%。MOC-31又稱做EGP-2（上皮糖蛋白-2），是上皮的分子標記，非上皮來源不表達，因此MOC-31有助于確定胸水細胞來源。本組MOC-31在腺癌中的敏感性為90.5%，特異性為95.3%，在增生性間皮中表達極低。Ber-Ep4除了表層鱗狀上皮、肝細胞和壁細胞外，所有上皮都表達，而間皮通常不表達。本組Ber-Ep4在腺癌中的敏感性為81.9%，特異性為92.2%。且CEA、CK7、Ber-Ep4、MOC-31在腺癌組與增生性間皮組之間的表達存在顯著差異，提示這一組聯(lián)合抗體是識別腺癌細胞的有效標志物。

Vimentin可用作上皮源性與間葉源性腫瘤、子宮內(nèi)膜腺癌與宮頸腺癌、間皮與腺癌細胞的鑒別診斷等。在本組胸水中標記間皮的敏感性為87.5%，特異性為71.4%。CK5/6為高分子量角蛋白，正常組織中表達在皮膚的基底和棘層細胞，部分前列腺基底細胞，導管上皮的基底細胞以及部分鱗狀上皮生發(fā)層、肌上皮和間皮，腺上皮不表達。因此，可用于鱗癌和腺癌，間皮和腺癌細胞的鑒別診斷。本組CK5/6標記間皮的敏感性為84.3%，特異性為82.9%。WT1正常表達于腎、支持細胞、子宮蛻膜細胞及卵巢顆粒細胞等，在Wilm’s瘤，后腎腺瘤及間皮中常陽性表達，可作為間皮與腺癌細胞的鑒別診斷。本組WT1標記間皮的敏感性為92.2%，特異性為85.7%，在轉移性腺癌中表達極少。Calretinin是一種鈣結合蛋白，存在于神經(jīng)元及其他細胞中，間皮中亦有表達，而腺癌極少表達，它是鑒別惡性間皮瘤最特異性的標志物。本組Calretinin標記間皮的敏感性為90.6%，特異性高達95.2%。且Vimentin、CK5/6、WT1、Calretinin在增生性間皮組與腺癌組之間的表達存在顯著差異，提示這一組聯(lián)合抗體是識別間皮的有效標志物。

因此，采用細胞塊石蠟技術聯(lián)合免疫組化能夠有效協(xié)助臨床病理醫(yī)師對疾病更準確地診斷，Vimentin、CK5/6、WT1、Calretinin、CEA、CK7、MOC-31、Ber-Ep4這組聯(lián)合抗體在胸水轉移性腺癌與增生性間皮細胞中的表達差異均有統(tǒng)計學意義，但各個抗體的敏感性和特異性也存在不同程度的局限性，聯(lián)合抗體檢測可大大提高其實際應用價值，值得在臨床中推廣使用。